KR101548207B1 - 신규한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 knua020 균주, 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법 - Google Patents

신규한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 knua020 균주, 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020 균주 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020 균주는 지방산 및 지방알코올의 생산능, 특히, α-리놀렌산(α-linolenic acid) 및 헥사데세놀(hexadecenol)의 생산능이 우수하므로, 이를 식품 또는 비누/화장품 관련분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

신규한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020 균주, 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법{Novel Asterarcys quadricellulare KNUA020, and method for producing fatty acid and fatty alcohol using the same}
본 발명은 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020 균주, 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법에 관한 것이다.
미세조류는 광합성을 통해 이산화탄소를 클로로필, 카로테노이드, 비타민 및 지방 등과 같은 다양한 종류의 유기화합물로 전환하는 광독립영양생물이다. 상기 미세조류는 수중환경에서 다양한 장쇄 다가불포화지방산들(PUFAs)를 생산하며, 특히 영양학적으로 중요한 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산이 생체 내에 풍부한 것으로 알려져 있다.
현재, 오메가-3 및 오메가-6 시장은 빠른 속도로 성장하고 있으며, 미세조류는 고농도의 PUFA를 함유하고 있으며 빠른 성장을 보이는 특성으로 인해 생선 지방을 대체할 수 있는 자원으로 각광받고 있다. 이에 따라, 미국과 극동지역에서는 클로렐라(chlorella) 및 스피룰리나(spirulina)의 상업적 배양시설이 증가하고 있다. 또한, 지방알코올은 계면활성제로 많이 사용하고 있는데, 최근 계면활성제 수요증가로 지방알코올의 수요가 꾸준히 증가하고 있다.
이에 본 발명자들은 지방산 및 지방알코올 생산능이 우수한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020을 동정하여, 상기 미생물의 최적 성장 조건을 실험하고, 이를 이용하여 생산된 지방산 및 지방알코올을 분석함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 지방산 및 지방 알코올을 생산하는 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020(수탁번호: KCTC 12350BP)균주를 제공함에 있다.
또한, 본 발명은 상기 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020(수탁번호: KCTC 12350BP)균주를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법을 제공함에 있다.
본 발명은 지방산 및 지방알코올을 생산하는 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020(수탁번호: KCTC 12350BP) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020(수탁번호: KCTC 12350BP)균주를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020 균주는 지방산 및 지방알코올의 생산능, 특히, α-리놀렌산(α-linolenic acid) 및 헥사데세놀(hexadecenol)의 생산능이 우수하므로, 식품 또는 비누/화장품 관련분야에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020의 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020의 온도에 따른 생장곡선을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020의 pH에 따른 생장 곡선을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020가 생산하는 지방산 및 지방 알코올을 GC/MS로 분석한 도이다(1:헥사데카테트라렌산(hexadecatetraenoic acid); 2:팔미톨레산(palmitoleic acid); 3:팔미트산(palmitic acid); 4:알려지지 않음 5: 리놀렌산(linolenic acid), 6: α-리놀렌산(α-linolenic acid); 7:헥사데세놀(hexadecenol))
도 5는 본 발명의 EI-MS를 이용한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020가 생산한 α-리놀렌산을 분석한 도이다.
도 6은 본 발명의 EI-MS를 이용한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020가 생산한 헥사데세놀(hexadecenol)을 분석한 도이다.
본 발명은 지방산 및 지방알코올을 생산하는 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020 균주를 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020 균주는 대구광역시 경북대학교의 생명과학관 남단(35°53′ N, 128°36′ E)의 정원 토양에서 샘플을 채취하여, 항생제 메로페넴(meropenem) 및 질소를 포함하는 BG-11(+) 배지에서 무균배양하여 분리하였고, 상기 분리된 균주를 2013년 1월 15일자로 생명공학연구원에 기탁하여 KCTC 12350BP의 수탁번호를 수여받았다. 상기 균주는 25℃에서 가장 잘 생장하였고, pH 4.0에서 pH 12.0까지 범위에서 잘 생장하였다.
또한, 본 발명의 균주는 18S rRNA 및 형태적 동정을 통하여 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리에 속하는 균주임을 확인하였다. 또한, 상기 균주는 지방산 및 지방 알코올 생산능, 특히, α-리놀렌산(α-linolenic acid) 및 헥사데세놀(hexadecenol) 생산능이 우수하여 식품 또는 비누/화장품 관련분야에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 지방산은 α-리놀렌산(α-linolenic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀렌산(linolenic acid) 및 헥사데카테트라렌산(hexadecatetraenoic acid)를 포함한다. 또한, 지방알코올은 헥사데세놀(hexadecenol)임이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은,
1)아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020(수탁번호: KCTC 12350BP) 균주를 20℃에서 30℃ 및 pH 4.0에서 pH 12.0에서 배양하는 단계;
2)상기 1)단계에서 배양된 세포를 명암주기를 주어 28일 내지 30일 동안 광영양독립적으로 배양하는 단계;
3)상기 2)단계에서 배양된 세포를 동결건조시키고, 클로로포름-메탄올로 처리하여 클로로포름 추출액을 얻는 단계; 및
4)상기 3)단계의 클로로포름 추출액에 메탄올 및 헥산을 처리하여 헥산 추출액을 분리하는 단계를 포함하는, 지방산 및 지방알코올의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 지방산 및 지방알코올의 생산방법을 단계별로 상세히 설명한다
상기 1)단계는 균주를 배양하는 단계로, 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) KNUA020(수탁번호: KCTC 12350BP)을 광범위 세균 항생제 메로페넴(meropenem) 및 질소를 포함하는 BG-11(+) 배지에 배양할 수 있고, 여러 차례 무균배양할 수 있다. 바람직한 배양온도는 20℃ 내지 30℃, 더욱 바람직하게, 25℃이다.
상기 2)단계는 명암주기를 주어 광영양독립적으로 배양하는 단계로, 명암주기는 명:18시간, 암:6시간인 것이 바람직하다. 명주기는 세포에게 빛을 받아 에너지를 생산하게 하며, 암주기는 명주기에서 생성된 에너지를 이용하여 유기화합물을 합성하게 한다.
상기 3)단계는 클로로포름 추출액을 얻는 단계로, 클로로포름-메탄올의 부피비 비율은 2:1인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 4)단계는 헥산 추출물을 얻는 단계로, 상기 3)단계에서 얻은 클로로포름 추출액을 메탄올로 처리하고, 헥산 내 수산화 칼륨용액을 상기 반응물에 가한 후, 전체적 혼합물을 25 내지 35℃, 바람직하게는 30℃에서 7 내지 15시간, 바람직하게는 10시간 동안 가열하고, 냉각시켜, 헥산 추출물을 얻는다.
또한, 본 발명의 지방산 및 지방알코올을 생산하는 방법은 헥산 추출물에서 지방산 및 지방알코올을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 헥산 추출물에서 지방산 및 지방알코올을 추출하는 방법은 공지된 방법인 다양한 종류의 크로마토그래피, GC/MS등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명은 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020( Asterarcys quadricellulare) 균주의 동정
1. 샘플 채집 및 균주동정
토양샘플을 2010년 5월 대한민국 대구광역시 소재 경북대학교의 생명과학관남단(35°53′ N, 128°36′ E)의 정원으로부터 채집하였다. 그 후, 생토(生土) 1~2 mg을 100㎍ mL-1의 메로페넴(meropenem) 및 질소를 포함하는 100 mL의 BG-11(+) 배지에 접종하였다. 상기 플라스크를 160 rpm 및 25℃로 설정한 회전식 진탕기(Vision scientific, 부천, 대한민국)에서 미세조류 성장이 관찰될 때까지 배양하였다. 잘 자란 미세조류 배양액(1.5mL)을 3,000 × g에서 15분 동안 원심분리하고, 탈수된 펠렛을 메로페넴을 함유한 BG-11 한천 배지상에 획선 접종(streaking)하였다. 이 후, 낮:밤 16:8 시간의 광조건으로 25℃에서 배양하였다. 단일 콜로니를 무균적으로 20 ㎍ mL-1의 메로페넴이 함유된 BG-11 배지에 획선 접종하여 무균 배양물을 수득하였다. 상기 무균 배양물에서 균주를 분리하였고, 상기 균주를 KNUA020으로 명명하였다. 상기 분리 균주는 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare)의 분류군을 나타내는 것으로, 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020이라는 명칭으로 2013년 1월 15일자로 생명공학연구원에 기탁하여 KCTC 12350BP의 수탁번호를 수여받았다.
2.형태학적 동정
상기 1의 무균배양물을 28일 동안 BG-11(+)배지에서 배양하였다. 3,000 × g에서 5분 동안 원심분리하여 살아있는 세포를 수득하였고, 멸균된 증류수로 세척하였고, 미분간섭차(DIC:differential interference contrast) 광학이 장치된 Zeiss Axioskop 2 광학현미경(Carl Zeiss, Standort Gottingen, Vertrieb, Germany)상에서 400
Figure 112014118331613-pat00001
배에서 관찰하였다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 분리된 미세조류는 비 운동성의 3차원적으로 배열된 연결생활체(coenobia)를 갖고 있었고, 성장단계에 따라 직경은 3 내지 4㎛에서 20㎛로 다양하였고, 연결생활체는 구체의 점액막(spherical mucilage envelope)안에서 무작위적으로 분포된 세포로 구성됨을 확인하여 본 발명의 균주는 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리에 속하는 균주임을 확인하였다.
3.분자적 동정
Genomic DNA를 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다. NS1 (5-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)및 NS8 (5′-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3)을 프라이머로 이용하여 18S 리보솜 RNA(rRNA) 서열분석을 White et.al(1990)에 기술된 방법으로 수행하였다. 증폭반응은 대략 10ng의 주형 DNA, 0.5μM의 프라이머(Macrogen, 서울, 대한민국), 0.5 U의 Ex Taq DNA 중합효소, 200μM의 각각의 dNTP, 2.5mM MgCl2 및 1×Ex Taq PCR 완충액(Takara, Otsu, Japan)을 포함하는 전체 25μl의 반응용액으로 수행하였다. 증폭은 PCR 장치(thermocycler; Dice Model TP600; Takara)에서 수행하였다; 증폭 조건은 94℃에서 2분을 반응시키고, 94℃에서 30초, 45℃에서 45초 및 72℃에서 1분 30초를 한 주기로 30 주기의 증폭을 수행하였고, 72℃에서 5분 동안 마지막 신장 주기를 수행하였다. 내부 전사 공간(ITS; internal transcribed spacer) 부위는 Al1500bf (5′-GAT GCA TTC AAC GAG CCTA-3) 및 LR3 (5′-CCG TGT TTC AAGACG GG-3)을 이용하여 증폭을 수행하였고, 증폭 조건은 95℃에서 10분을 반응시키고, 95℃에서 1분, 51℃에서 40초 및 72℃에서 1분을 한 주기로 35 주기의 증폭을 수행하였고, 72℃에서 10분 동안 마지막 신장 주기를 수행하였다. 이 후, PCR 산물을 LaboPass PCR 정제 키트(Cosmo Genetech, 서울, 대한민국)를 이용하여 정제하였다. PCR 증폭산물을 pGEM 벡터 시스템(Promega, Madison, WI, USA)에 재조합하여 Escherichia coli DH5α에 형질전환한 후 DNA 서열을 분석하였고, 미국 국립생물정보센터(The National center for Biotechnology information; NCBI)에 기탁번호 JQ043183 및 JQ043184로 등록하였다. 이의 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
마커 유전자 기탁번호 길이(bp) closest match(genbank accession no) overlap(%) 서열유사도(%)
18s rRNA JQ043183 1729 Asterarcys quadricellulare
Comas 1977/75 (AF388375)		 100 100
ITS JQ043184 695 Graesiella emersonii CCAP
211/8P (FR865687)		 100 91
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주는 분류학적으로 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리에 속하는 균주임을 확인하였다.
4. 성장 실험 및 산성 저항성 실험
30일간 배양한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020(1mL) 균주를 BG-11(+) 배지에 각각 3회 반복하여 접종하고 30일 동안 배양하였다. 균주 배양의 최적 온도를 결정하기 위하여, 상기 균주의 생존 및 생장을 5, 10, 15, 20, 25 및 30℃에서 검사하였다. 25℃의 조건에서 pH 3.0에서 13.0까지의 범위에서 각각의 산도에 대한 저항성을 실험하였다. 미세조류 세포의 밀도는 680nm에서 Optimizer 2120 UV 분광기(Mecasys, Daejeon, Korea)로 OD(optical density)를 측정하였다. 온도에 따른 생장곡선을 도 2에 나타내었고, pH 범위에 따른 성장곡선을 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주는 25℃에서의 생장이 가장 우수함을 확인하였다. 또한 도 3에 나타난 바와 같이, pH 4.0부터 pH 12.0까지 광범위한 산도에서 세포 생장이 잘 이루어지는 것을 확인하였고, 특히 pH 7.0에서 생장이 가장 우수함을 확인하였다.
< 실시예 2> 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020( Asterarcys quadricellulare)을 이용한 지방 생산 확인
미세조류 기반의 상업적 생화학적 물질 및 바이오매스를 얻기 위하여, 각각의 접종된 배양물을 18-L 투명한 폴리카보네이트 용기에 16L의 비료용액(1:1000 희석; BioNex; 5.1%의 N, 10%의 P2O5, 및 5%의 K2O; Biosangsa, 부산, 대한민국)에 3회 반복으로 접종하였다. 상기 배양액을 독립영양 조건에서 배양하였다. 구체적으로, 배양액에 형광 빛(대략 70μmole m-2S-2)을 명암주기(명:16시간, 암:8시간)로 주어 비추었고, 공기방울을 대략 2 L min-1의 속도로 흐르게 하여 30일 동안 배양하였다. 배양이 끝난 미세조류 세포는 3,220 ×g로 10분 동안 원심분리하여 수득하였다(Centrifuge 5810R; Eppendorf, Hamburg, Germany). 수득한 미세조류 세포의 바이오매스를 동결건조시키고, Yeo et.al.(2011)에 기술된 방법에 따라 클로로포름-메탄올(2 : 1)로 하룻밤 동안 혼합시켜 주었다. 클로로포름 추출액을 회전 증발기(rotary evaporator; RV10; IKA, Wilmington, NC, USA)로 건조시켰다. 상기 추출액의 지질의 무게를 재고, 미리 제조한 메탄올로 처리한 다음, 헥산 내 수산화 칼륨용액(potassium hydroxide in Hexane)을 상기 반응물에 가하고, 전체 혼합물을 30℃로 10시간 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 메탄올 및 헥산 막을 분리시켰다. 노란색의 헥산막을 추가적인 분석을 위하여 분리하였고, 배양액의 지방산 조성물을 GC/MS[KBSI(Korea Basic Science Institute) 대구센터(Daegu center)의 Agilent 6890N GC를 장착한 Jeol JMS700 mass spectrometer; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA]로 분석하였다. EI-MS(electron impact mass spectrum)에 근거하여 피크가 어떤 화합물인지를 분석하였다. NIST(National Institute of Standards and Technology)의 mass spectral libraries을 데이터베이스로 참조하였다. 상기 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUA020이 생산하는 지방산을 GC/MS로 분석한 결과를 도 4에 나타내었고, α-리놀레 산 및 헥사데세놀(hexadecenol)을 EI-MS 패턴을 도 5 및 도 6에 나타내었다. 또한 본 발명의 미세조류가 생산하는 지방산의 함량을 표 2에 나타내었다.
Figure 112014118331613-pat00002
표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이, α-리놀렌산 및 헥사데세놀(hexadecenol)의 함량이 높음을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미세조류가 생산하는 α-리놀렌산은 분자량 292의 오메가 3 지방산임을 확인하였고, 현재 생선기름으로부터 추출되는 지방산을 대체할 수 있는 잠재적인 가능성을 가진 것으로 판단된다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 KNUS020 균주는 화장품 및 비누산업에 사용되는 장쇄지방알코올의 헥사데세놀(hexadecenol; 분자량 296)을 생산하여 화장품 및 비누산업에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
한국생명공학연구원 KCTC12350BP 20130115

Claims (3)

  1. 수탁번호가 KCTC 12350BP인 지방산 또는 지방알코올을 생산하는 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 지방산은 α-리놀렌산(α-linolenic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀렌산(linolenic acid) 및 헥사데카테트라렌산(hexadecatetraenoic acid)으로 구성된 지방산 중 선택된 하나 이상의 지방산인 것을 특징으로 하는, 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) 균주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 지방알코올은 헥사데세놀(hexadecenol)인 것을 특징으로 하는, 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리(Asterarcys quadricellulare) 균주.
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