KR101576480B1 - 신규한 미세조류 클로렐라 불가리스 knua007 균주 및 이로부터 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤 생산 방법 - Google Patents

신규한 미세조류 클로렐라 불가리스 knua007 균주 및 이로부터 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP) 및 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)는 내냉성을 가지므로 추·동절기에도 대량배양이 가능하며, 영양학적으로 중요한 오메가 3 불포화지방산 및 오메가 6 불포화지방산, 지방알코올인 헥사데세놀 및 에고스테롤을 광독립영양적으로 생합성할 수 있어, 이를 이용하여 다양한 산업 분야에 응용이 가능하다.

Description

신규한 미세조류 클로렐라 불가리스 KNUA007 균주 및 이로부터 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤 생산 방법{Novel Chlorella vulgaris KNUA007 strain and method for producing fatty acid, fatty alcohol, and ergosterol from the same}
본 발명은 신규한 미세조류 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주 및 이로부터 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤을 생산하는 방법에 관한 것이다.
미세조류(microalgae)는 지구의 탄소 및 질소 순환에서 필수불가결한 역할을 하며, 광범위한 서식환경에 분포되어 있다. 미세조류는 가혹한 환경 조건에 대한 뛰어난 내성으로 인해 극지방에서 사막지대에 이르기까지 매우 광범위한 지역에 분포할 수 있다. 미세조류는 광합성을 통해 빙권지역(cryosphere)에서 전체 생태계 생물량(biomass)의 구성에 큰 역할을 담당하고 있다. 미세조류는 영하의 온도, 부동수(不凍水)의 부족, 높은 자외선 수치 및 이용 가능한 양분의 큰 변화와 같은 조건들에 대한 내성으로 인하여 빙권지역에서 우점하는 것을 자주 관찰할 수 있다.
따라서, 빙권지역(cryosphere)에 분포하는 남조류(cyanobacteria)를 포함하는 미세조류는 학문적으로 많은 관심을 받고 있고, 최근에는 PCR 기법을 이용한 남극 미세조류의 다양성 평가 연구가 주목받고 있다. 숨겨진 남극 미생물 생태계에 대한 이해를 높이는 연구에 이러한 비배양적(culture-independent)인 분자계통적 접근법을 성공적으로 적용시켜 왔으나, 배양적인(culture-dependent) 접근법인 미세조류 균주의 분리와 생리적 특성에 대한 연구 역시 매우 중요하다. 배양 가능한 남극 미세조류의 다상적인(polyphasic) 연구는 미세조류의 다양성, 생리학 및 생명공학적 연구에 있어 더 깊은 이해를 가능하게 할 수 있다.
미세조류의 태양에너지 이용 효율은 5%로, 육상식물의 0.2%에 비해 약 25배 정도 높으며, 이산화탄소 고정화 속도는 소나무의 15배로 매우 효율적이다. 현재 미세조류는 사료나 생물학적 비료로 이용될 뿐 아니라, 다양한 건강식품으로 이용되고 있다.
한편, 클로렐라는 단세포의 지름 10마이크로미터 이하의 구형 또는 타원형의 광합성 미생물로서, 자연적으로는 담수 및 해수에서 자란다. 이러한 클로렐라는 영양학적으로 식물성단백질, 필수아미노산, 필수지방산, 복합당질(glycoprotein), 비타민, 미네랄, 식이섬유소, 엽록소, 핵산, 베타 카로테노이드, 플라보노이드, 류틴 등의 항산화제, 식물성 영양성분(phytochemical, phytosterol), 스테롤, 감마 리놀렌산 등 식물성 영양소를 고루 함유하고 있어, 매년 건강식품, 식품 첨가물, 사료, 의약품 재료 등의 상용범위가 넓어지고 있으며 그 수요가 매년 증가하고 있는 추세이다.
오메가 3 불포화지방산은 세포를 보호하고, 세포의 구조를 유지시키며, 원활한 신진대사를 돕는 효과가 있고, 오메가 6 불포화지방산은 필수지방산으로서 혈액 콜레스테롤 양을 저하시키는 효과가 있다. 이러한 효과로 오메가 3 불포화지방산 및 오메가 6 불포화지방산은 건강기능식품으로 각광받고 있다. 또한, 지방 알코올 헥사데세놀은 휘발유 첨가제 또는 비누 및 화장품의 원료로 사용이 기대되며, 최근 항암효과가 밝혀진 에고스테롤은 제약산업에서의 고부가가치를 창출할 수 있는 약품 원료로서 응용이 기대된다.
이에, 본 발명자들은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주를 남극 세종기지 인근 해빙수로부터 채취하여 무균적으로 분리하였으며, 이 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주는 신규한 균주로서 영양학적으로 중요한 지질 성분, 지방알코올 및 에고스테롤을 광독립영양적으로 생산할 수 있음을 보여주어 관련 산업에서의 응용 가능성이 높게 평가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
국내특허출원번호 10-2010-0118997 국내특허출원번호 10-2010-0118993 국내특허출원번호 10-2012-0044874
본 발명의 목적은 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤을 생산하는 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)를 이용한 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤을 생산하는 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)를 배양하고, 그 배양액으로부터 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤을 분리하는 단계를 포함하는, C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 신규한 미세조류 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)는 C16 내지 C18의 지방산, 지방알코올 및 에고스테롤을 광독립영양적으로 생합성할 수 있는 효과를 가진다. 또한 상기 균주는 내냉성을 가지므로 추·동절기에도 대량배양이 가능하여, 이를 이용하여 추·동절기에도 C16 내지 C18의 지방산, 지방알코올 및 에고스테롤을 생산할 수 있다.
본 발명의 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)가 생산하는 C16 내지 C18의 지방산에는 특히 영양학적으로 중요한 오메가 3 불포화지방산 및 오메가 6 불포화지방산이 포함되고, 지방 알코올에는 휘발유 첨가제 또는 비누 및 화장품의 원료로 사용될 수 있는 헥사데세놀이 포함되며, 에고스테롤에 대해서는 최근 항암효과가 밝혀진 바, 본 발명의 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)는 건강기능식품, 휘발유 첨가제, 비누 및 화장품, 항암제 등의 생산원료로서 다양한 산업 분야에 응용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)의 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)의 온도 조건에 따른 성장의 차이를 나타낸 도이다.
도 3은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)의 GC/MS 분석 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤을 생산하는 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주를 제공한다.
상기 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주는 2010년 1월 남극대륙 사우스 셰틀렌드 제도의 킹조지섬에 있는 세종기지(62°13'S, 58°47'W) 인근의 해빙수로부터 분리되었으며, 이는 형태학적, 분자적 및 생리학적 수준에서 동정(identification) 되었다. 본 출원인은 상기 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주를 신규한 균주로 확인하고 이를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2014년 1월 15일자로 기탁하였다(기탁번호: KTCT 12543BP).
상기 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주는 광합성을 통해 광독립영양적으로 C16 내지 C18의 지방산, 바람직하게는 영양학적으로 중요한 오메가 3 불포화지방산인 헥사데카트리에노익 산과 알파-리놀레익 산, 및 오메가6 불포화지방산인 리놀레익 산을 주요 지질성분으로 생산한다. 또한, 상기 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주는 지방알코올, 바람직하게는 헥사데세놀(C20H40O)을 광독립영양적으로 생산한다. 또한 상기 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주는 항암효과가 우수한 에고스테롤(C28H44O)을 광독립영양적으로 생산한다.
또한, 본 발명은
1) 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주를 배양하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 얻은 배양액으로부터 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)을 추출하는 단계;를 포함하는 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)의 생산 방법을 제공한다.
상기 1) 단계에서 배양 온도는 바람직하게는 5℃ 에서 30℃ 이며, 보다 바람직하게는 20℃이다. 균주 배양 배지는 당업계에서 일반적으로 통용되는 배지를 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단계에서 균주의 배양액으로부터 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)을 추출하는 방법은 당업계의 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 추출용매는 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 톨루엔, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시 예 1. 시료 채집 및 미세조류 분리
미세조류 시료를 2010년 1월 남극대륙 사우스 셰틀렌드 제도의 킹조지섬에 있는 세종기지(62°13'S, 58°47'W) 인근의 해빙수를 채집하였다. 그 후, 채집한 시료를 실험실로 가져와서 시료 중 1 ㎖를, 100 ㎍/㎖ 농도의 광범위 항생제 이미페넴(imipenem, Choongwae Pharma Corporation, Seoul, South Korea)을 함유하고 있는 100 ㎖ BG-11 배지(Rippka 등 1979)에 접종하였다. 상기 플라스크들을 15℃, 160 rpm으로 설정한 오비탈(orbital) 진탕배양기(Vision Scientific Co. Ltd., 한국, 부천)에서 약 70 μmole·m-2·sec-1의 광도 하에서 조류의 성장이 나타날 때까지 낮:밤(16:8 시간) 주기로 배양하였다.
상기 배양액(1.5 ㎖)을 3,000×g에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 펠렛을 이미페넴(20 ㎍/㎖)을 함유하는 BG-11 한천 상에 획선분획하고, 그 후 상기와 같은 조건 하에서 다시 배양하였다. 미세조류 단일 콜로니가 한천 상에 자라났을 때, 이를 새로운 BG-11 한천 배지로 무균적으로 접종시켜 무균 상태의 단일 미세조류 배양물을 분리하였고 이를 KNUA007로 명명하였다.
실시 예 2. 형태학 및 분자적 분류학적 분석
실시 예 1에서 분리한 KNUA007 균주의 형태학적 분석을 위하여 이를 20일 동안 BG-11 배지에서 배양하였다. 살아있는 세포들을 3,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 회수하고, 차등간섭대비(DIC) 광학렌즈가 설치된 Zeiss Axioskop 2광 현미경(Carl Zeiss, Standort Goetingen, Vertrieb, Germany) 상에서 1,000× 배율로 관찰하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, KNUA007 균주는 독립적이고, 운동성이 없으며, 지름이 약 5㎛인 구형의 형태를 갖는 것으로 관찰되었다. 또한 상기 균주의 세포벽은 단일 평활층으로 이루어져있고, 상기 균주 내에는 뚜렷한 컵 모양의 엽록체가 존재하였다. 전체적으로, 균주 KNUA007의 형태학적 특징들을 통해 상기 균주가 클로렐라(Chlorella) 속에 속한다는 것을 확인하였다.
또한 실시 예 1에서 분리한 KNUA007 균주의 분자적 분류학적 위치를 확인하기 위하여, 18S rRNA 유전자 서열분석을 실시하였다. 상기 KNUA007 균주의 DNA는 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였고, 18S rRNA 유전자 단편들의 증폭에는 White 등(1990)에 의해 설명된 프라이머 세트인 NS1과 NS8를 사용하였다. Large subunit의 D1-D2 영역 (LSU, 28 rRNA)은 NL1과 NL4 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였고(O'Donnell 등 1993), ITS(internal transcribed spacer) 부분은 ITS1 및 ITS4 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다(White 등 1990). 본 연구에서 사용된 프라이머들의 합성 및 DNA 서열분석은 Macrogen사(社)(Macrogene, Seoul, 대한민국)에서 수행하였다. 본 연구에서 얻어진 DNA 염기서열들을 NCBI 데이터베이스에 제출하고, 이들과 기존 클로렐라 불가리스 균주의 상동성과 DNA 염기서열의 유사성을 비교하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, KNUA007 균주의 18S rRNA, LSU, ITS 유전자 마커의 염기서열이 기존에 알려진 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주들과 염기서열이 일부 상이한 것을 확인하였다.
[표1] KNUA007의 18S rRNA, ITS 및 LSU 블라스트 검색(BLAST search) 결과
Figure 112014029619613-pat00001

이상의 분석 결과를 통하여, 상기 KNUA007 균주가 신규한 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 균주임을 확인하였으며, 이를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2014년 1월 15일자로 기탁하였다(기탁번호:KTCT 12543BP).
실시 예 3. 클로렐라 불가리스( Chlorella vulgaris ) KNUA007 균주의 내냉성 확인
클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주의 내냉성을 확인하기 위하여, 온도 조건을 달리하면서 실험을 진행하였다. 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주 배양액 1 ㎖를 BG-11 배지에 접종하고 20일 동안 배양하였으며, 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 분리 균주의 최적 생장 온도를 알기 위하여, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주의 생존 및 성장을 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ℃에서 각각 측정하였다. 상기 균주의 광학 밀도(OD, optical density)를 Optimizer 2120UV 분광기(Mecasys Co. Ltd., 대전, 대한민국)를 이용하여 680 nm에서 측정함으로써 상기 각 온도에서의 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주의 생존 및 성장 정도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 일반 미세조류 배양배지 BG-11 조건에서의 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주의 생장 온도는 5 ℃ 에서 30 ℃ 인 것을 확인하였으며, 최적 생장 온도는 20 ℃ 임을 확인하였다. 또한 35 ℃ 에서는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주가 거의 생존 및 생장 할 수 없음을 확인하였다.
실시 예 4. GC/MS 분석
상기 실시 예 1.에서 분리된 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주를 BG-11 배지에서 20 일 동안 별도의 탄소원을 공급하지 않고 광독립영양적으로 배양하고, 지방산 분석을 위해서 세포를 회수하였다. 샘플은 추출효율을 향상시키기 위해 동결건조하였다. 건조된 각 샘플의 100 mg 을 클로로포름 및 50%의 메탄올이 동량으로 혼합된 혼합물을 첨가한 후, 25℃에서 16시간 동안 추출하였다. 추출 후에, 클로로포름 추출물을 분리하고 회전 증발기로 건조시켰다. 건조된 추출물은 에스테르교환반응(transesterification)을 위하여 메탄올과 수산화칼륨(KOH)으로 만들어진 용액으로 처리하였다. 상기 혼합물로부터 지방산 메틸 에스테르(FAME, fatty acid methyl acetate)를 분리하기 위하여 상기 혼합물에 헥산(hexane) 2 ml을 첨가하였다. 상기 혼합물을 30℃에서 10시간 동안 교반하였다. 그 다음, 상기 혼합물을 냉각하고 메탄올 및 헥산층을 분리하였다. 노란색 헥산 층은 다음의 실험을 위하여 분리해두었다. FAME의 함량을 계산하기 위하여 외부표준물질로서 GLC-90(Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 사용하였다. 상기 FAME 조성물은 5973N 질량분석 6890N 가스 크로마토그래프(Agilent, Santa, CA, USA)에서 HP-5MS 모세관 컬럼(30m×0.25 mm ID×0.25㎛ 필름 두께)을 이용하여 분석하였다. 시료 피크의 질량데이터와 표준 라이브러리 데이터(Wiley/NBS 라이브러리)를 비교하여 피크의 화학적 구조와 분자량을 규명하였다. 그 결과를 도 3 및 표 2에 나타내었다.
[표 2] 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 지방산, 지방알코올, 에고스테롤 조성 성분
Figure 112014029619613-pat00002

도 3 및 표 2에 나타낸 바와 같이, GS/MS 결과들은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) NUA007 균주가 팔미틱 산, 올레익 산, 헥사데카디에노익 산, 8-메틸-헵타데칸과 같은 지방산, 오메가 3 불포화지방산인 헥사데카트리에노익산(C 16:3) 및 알파-리놀레익산(C 18:3), 오메가 6 불포화지방산인 리놀레익산(C 18:2), 지방알코올인 헥사데세놀(C20H40O) 및 에고스테롤(C28H44O) 등을 생합성할 수 있음을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12543BP 20140115

Claims (8)

  1. C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)을 생산하는 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP).

  2. 제 1항에 있어서, 상기 C16 내지 C18의 지방산은 헥사데카트리에노익산(C 16:3), 알파-리놀레익산(C 18:3), 및 리놀레익산(C 18:2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP).


  3. 제 1항에 있어서, 상기 지방 알코올은 헥사데세놀(C20H40O)인 것을 특징으로 하는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP).

  4. 1) 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KNUA007 균주(KTCT 12543BP)를 배양하는 단계;
    2) 상기 1) 단계에서 얻은 배양액으로부터 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)을 추출하는 단계;를 포함하는 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)의 생산 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 1) 단계에서 균주의 배양 온도는 5℃에서 30℃ 인 것을 특징으로 하는 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)의 생산 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 C16 내지 C18의 지방산은 헥사데카트리에노익산(C 16:3), 알파-리놀레익산(C 18:3) 및 리놀레익산(C 18:2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)의 생산 방법.

  7. 제4항에 있어서, 상기 지방 알코올은 헥사데세놀(C20H40O)인 것을 특징으로 하는 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)의 생산 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 2)단계에서 추출 용매는 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 톨루엔, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 C16 내지 C18의 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤(C28H44O)의 생산 방법.





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