KR101241831B1 - 신균주 클로렐라 불가리스 ｙｓｗ04 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신균주 클로렐라 불가리스 YSW04[KACC93106P]에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신균주 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P]는 폐수 내성이 강하여 폐수 내 질소와 인을 제거할 수 있고, 특히 폐수에서 배양시 높은 올레인산(C 18:1n9c) 함량을 가지고 있어 고품질 바이오디젤 생산에 매우 효과적이므로 폐수 처리와 동시에 바이오 에너지 생산이 가능하다.

Description

신균주 클로렐라 불가리스 ＹＳＷ04{Novel strain Chlorella vulgaris YSW04}
본 발명은 폐수 내성 및 지질 함량이 높은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주에 관한 것이다.
최근 바이오디젤을 안정적이며 경제적으로 생산할 수 있는 에너지원으로 조류를 개발하고 있으며, 이는 조류가 식물(곡물)을 대체할 수 있는 다음과 같은 특징 때문이다. 1) 조류는 독립, 종속 영양 광합성균으로 태양에너지와 물을 비롯하여 이산화탄소가 있으면 어느 곳(바다, 호수, 강 등)에서 성장되는 특성을 지니고 있다. 2) 다른 물질(예: 콩, 옥수수, 사탕수수 등) 보다 생산성이 좋고[Becker, 1994. Measurement of algal growth. In: Microalgae biotechnology and microbiology. Cambridge University Press, P 56-62.], 3)　바이오디젤의 생산물질인 지질 함량을 높게 갖고 있다고 보고된 바 있다[Sheehan, J., Dunahay, T., Benemann, J., Roessler, P., 1998. A look back at the U.S. Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae. Close-Out report. National Renewable Energy Lab, Department of Energy, Golden, Colorado, U.S.A. Report number NREL/TP-580-24190.]. 4) 불포화지방산 탄소 결합이 높은 특성을 지니고 있어 낮은 온도에서도 연료 사용 가능성의 특성이 있다. 최근까지 연구된 대부분 조류는 해양에 서식하는 해양 조류이며, 폐수 및 하수에서 배양되어 디젤화 용도로 쓰여진 경우가 드물다. 따라서, 폐수 내성을 갖는 미세조류 균주종을 분리한다면 미세조류 배양기에 공급되는 폐수에서 영양분을 섭취하고 있으므로 질소ㆍ인의 인위적 주입을 고려하지 않아 공정의 경제성을 향상시킬 수 있을 것이다. 이러한 폐수에서의 생육 보고가 미미하며 지질 함량 및 생장 속도에 대한 자료가 부족하므로 새로운 미세조류의 분리가 절실히 필요하며 고품질 바이오 생산용 미세조류 배양이 중요하다.
이에, 본 발명자들은 폐수에 대해 내성을 갖는 미세조류 균주를 확보하기 위해 연구한 결과, 폐수에 내성을 가지며, 고품질 바이오디젤 생산 물질인 올레인산(C18:1n9c) 함량 50% 이상의 지질 성분을 가지는 미세조류 종을 자연 환경으로부터 분리하여 고품질 바이오디젤 생산에 유용함을 알게됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 신규한 미세조류를 폐수 처리에 사용하여 환경오염 문제를 해결하고, 그 과정에서 생성된 미세조류를 바이오디젤 생산용 원료로 활용하여 대체에너지를 해결하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 폐수 내성 및 지질 함량이 높은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주를 그 특징으로 한다.
또한, 28s rDNA가 서열번호 1의 염기서열인 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04) 균주를 포함한다.
또한, 본 발명은
지질을 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법에 있어서,
상기 지질은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주 또는 이의 배양액으로부터 분리된 지질인 바이오디젤의 생산방법을 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 폐수 처리용 미생물제제를 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
조류를 이용하여 폐수 내 질소 및 인을 제거하는 방법에 있어서,
상기 조류는 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주인 질소 및 인의 제거방법을 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신균주를 배양하는 방법을 포함한다.
본 발명은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주를 이용하여 폐수 내성과 바이오디젤 생산원인 지질 함유를 검토하여 고품질 바이오디젤 생산용 신균주로서의 가능성을 확보하였다.
본 발명의 신균주는 폐수 내성이 강하며, 폐수에 함유된 N, P의 직접 적용이 가능하여 배양의 경제성을 크게 향상시키는 효과를 가진다.
또한, 폐수에서 성장된 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P]는 높은 함량의 지질을 함유하고 있어 고품질 바이오디젤 생산에 기여토록 하는 효과를 가진다.
도 1은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P]의 사진이다.
도 2는 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P]의 계통수를 나타낸 것이다.
도 3은 폐수와 BBM에서 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P]의 질소 및 인 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P]의 지방산 분포를 나타낸 것이다[리놀렌산(C18:3n6), 리놀레산(C18:3n 3), 올레산(C18:1n9c), 스테아린산(C18:0), 헵타데칸산(C17:0), 팔미토레산(C16:1), 팔미틴산(C16:0), 미리스틴산(C14:0), 라우릴산(C12:0)].
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 신균주 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)는 본 발명자들에 의해 최초로 분리 동정된 것으로서, 하ㆍ폐수처리장에서 BBM 배지를 이용하여 균주를 분리하였으며, 분리한 균주를 28s rDNA 시퀀싱 서열 검색에 의해 분자 유전학적인 방볍으로 분석한 결과, 표준 균주인 클로렐라 불가리스 AB237642과 97% 유사한 신균주임을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 분리 동정된 클로렐라 불가리스 YSW04라 명명하였으며, 2010년 6월 1일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC93106P 를 부여받았다.
또한, 상기 클로렐라 불가리스 YSW04는 20 내지 30 ℃(보다 바람직하게는 25 내지 27 ℃), pH 7.0 내지 8.0(보다 바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6)에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, BBM 배지(KH2PO4, CaCl2ㆍ2H2O, MgSO4ㆍ7H2O, NaNO3, K2HPO4, NaCl, H3BO3 및 미량원소를 함유하는 배지)에서 배양할 수 있으며, 상기 미량원소는 ZnSO4ㆍ7H2O, MnCl2ㆍ4H2O, MoO3, CuSO4ㆍ5H2O, Co(NO3)2ㆍ6H2O, Na2EDTA, KOH, FeSO4 및 H2SO4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
특히, 클로렐라 불가리스 YSW04는 폐수에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 YSW04은 고농도의 질소, 인(500 mg/L, 12 mg/L) 조건 하에서도 생육이 가능하므로 폐수의 희석 배율을 크게 낮추지 않고도 배양이 가능하다.
또한, 폐수 내 오염원인 질소, 인 제거 효과를 나타내므로 폐수 처리에 활용 가능하다.
국내의 축산 농가는 11만 가구 이상으로 많은 양의 질소, 인의 성분이 폐수처리장으로 유입된다. 기존 질소, 인 제거는 물리, 화학, 생물학적 방법이 전부 이용되며, 경제적인 부분에 많은 단점이 있으나, 조류 재배 시 광합성에 필요한 빛은 자연 상태인 태양으로부터 섭취하며 부가적 성장 요소인 질소, 인을 폐수에서 자연스럽게 섭취하므로 처리 공정이 단순하다. 따라서, 조류를 이용한 폐수 처리 공정은 공정 시설에 필요한 투자비와 운전비용이 대단히 낮아 상용화 가능성은 매우 높다.
상기와 같이, 본 발명은 클로렐라 불가리스 YSW04[KACC93106P] 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 폐수 처리용 미생물제제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 조류를 이용하여 폐수 내 질소 및 인을 제거하는 방법에 있어서, 상기 조류는 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주인 질소 및 인의 제거방법을 포함한다.
한편, 폐수를 활용하여 배양시킨 본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 YSW04은 빠른 성장 속도와 동시에 지질이 풍부한 종(균체 건조 중량의 지질 함유량 20% 이상)으로서, 특히 불포화지방산 중 상대적으로 산화안정성이 좋은 올레산(C18:1n9c)이 총 지방산 중 50% 이상 구성되어 고품질 바이오 디젤을 생산할 수 있는 성분 제공 요소로 사용 가능하다.
따라서, 본 발명은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주 또는 이의 배양액으로부터 지질을 분리하고 상기 지질을 이용하여 고품질 바이오디젤을 생산하는 방법도 포함한다. 일반적으로 지질을 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법으로는 에테르교환 반응(transesterification), D- 글리세린 생산법 등이 있으며, 본 발명 역시 상기와 같은 통상의 바이오디젤 생산법으로 고품질의 바이오디젤을 생산할 수 있다.
조류의 지질을 분리하는 방법으로는 Sulfophosphovanillin 법, Kunkel 법, Brugdon 법 등으로 가능하며, 이러한 방법으로 본 발명의 또는 이의 배양액으로부터 지질을 분리하였다.
또한, 이렇게 분리한 지질 내 지방산을 분석한 결과, 폐수에서 배양 시 올레인산(oleic acid)이 총 지방산 함량에 대하여 50 중량% 이상 포함되어 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 신균주의 분리 및 배양
강원도 원주 지역의 하ㆍ폐수처리장 주변에서 시료를 채취하였다. 채취 시료는 200 mL 시험관에 다음 표 1에 나타낸 바와 같은 BBM 액체 배지를 넣고 약 2주간 정치 배양하였다. 폐수의 농도는 질소ㆍ인이 각각 800 mg/L, 10 mg/L로 공급하며 형광등을 광원으로 하여 배양 시험관 표면에서 조도를 약 24 watt로 조절한 후 직접 배양하였다. 예비 배양한 시료 1 mL를 10 mL의 멸균 증류수가 포함된 30 mL시험관에 넣고 잘 혼합하여 미세조류 세포를 분산시켰다. 이로부터 마이크로 피펫을 사용하여 0.1 mL의 시료를 취한 후 멸균 증류수가 포함된 시험관에 넣고 혼합하였다. 이러한 조작을 5회 반복한 후 각각의 시험관에서 약 0.1 mL의 시료를 취하고, 이를 다음 표 2에 나타낸 바와 같은 조성의 BBM 배지가 놓인 페트리디쉬(Petri dish)에 접종한 다음, 온도 25 ~ 27 ℃ 및 조도 50 μmol/㎡-sec의 배양기에서 2 ~ 3주간 정치 배양하였다. 미세조류의 군락(Colony)이 나타나면 현미경으로 확인하면서 백금이를 사용하여 각각의 군락을 웰 세포 배양 플레이트(well cell culture plate)에 옮겨 분리를 시작하였다. 각각의 홀에는 조류군락과 BBM배지를 1:1의 중량비로 하여 투여 후 10 ~ 14일간 배양하였다. 일부 미생물의 성장을 억제하게 위해 본 연구에서는 항생제 스트렙토마이신(Streptomycin)을 사용하여 조류만을 성장하도록 하였다. 이때 사용된 항생제의 양은 배지 1L 당 0.15 μm/mL를 사용하였다. 일정 기간 후 각각의 홀에 배양된 군락을 현미경 관찰하였다. 이때, 대부분의 홀에서는 특성 미세조류만 성장하며, 같은 모양을 지닌 종을 BBM 배지로 준비된 페트리디쉬에서 배양하였다. 일정기간 후 배양된 조류 군락은 한 종류의 군락으로 우세하게 배양되며, 이 군락을 채취하여 100 m의 BBM 배지가 들어있는 250 mL 삼각 플라스크에 이식하여 본 배양을 시작하였다.
미세조류 배양용 액체 배지(BBM)의 조성
성분 함량 (per liter)
KH2PO4 17.5 g
CaCl2ㆍ2H2O 2.5 g
MgSO4ㆍ7H2O 7.5 g
NaNO3 25 g
K2HPO4 7.5 g
NaCl 2.5 g
H3BO3 11.42 g
미량원소 모액
ZnSO4ㆍ7H2O 8.82 g
MnCl2ㆍ4H2O 1.44 g
MoO3 0.71 g
CuSO4ㆍ5H2O 1.57 g
Co(NO3)2ㆍ6H2O 0.49 g
용액 (1)
Na2EDTA 50 g
KOH 3.1 g
용액 (2)
FeSO4 4.98 g
H2SO4 1 mL
미세조류 배양용 배지(BBM) 아가의 조성
성분 함량 (per liter)
KH2PO4 17.5 g
CaCl2ㆍ2H2O 2.5 g
MgSO4ㆍ7H2O 7.5 g
NaNO3 25 g
K2HPO4 7.5 g
NaCl 2.5 g
H3BO3 11.42 g
미량원소 모액
ZnSO4ㆍ7H2O 8.82 g
MnCl2ㆍ4H2O 1.44 g
MoO3 0.71 g
CuSO4ㆍ5H2O 1.57 g
Co(NO3)2ㆍ6H2O 0.49 g
용액 (1)
Na2EDTA 50 g
KOH 3.1 g
용액 (2)
FeSO4 4.98 g
H2SO4 1 mL
아가
아가 분말 15 g
도 1은 분리 균주인 클로렐라 불가리스 YSW04균주를 나타낸 것이다.
실시예 2: 분리 균주 배양
상기 표 1의 BBM 배지를 이용하여 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04) 균주를 25 내지 27 ℃, pH 7.2 내지 7.6 하에서 250 mL 삼각플라스크에 10 mL의 상기 균주를 넣고 형광교반 배양기에서 약 14일간 배양을 하였다. 교반은 150 rpm으로 유지하였으며, 조도 50 μmol/㎡-sec를 유지하였다.
실시예 3: 분리 균주의 동정
상기 실시예 1의 분리 균주의 염기서열 분석은 28s rDNA 염기서열 시퀀스분석법으로 분석하였다. 샘플의 상태는 클로렐라 불가리스 집락이 있는 평판배지 상태로 의뢰하였으며, 의뢰 내역으로는 추출-gDNA, PCR 증폭에 의한 PCR 생성물을 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 분석하였다. 분석에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
정방향 프라이머: 5'-AGCGGAGGAAAAGAAACTA-'3 (서열번호 2)
역방향 프라이머: 5'-TACTAGAAGGTTCGATTAGTC-'3 (서열번호 3)
28s rDNA 염기서열 분석 결과를 첨부된 서열번호에 기재하였으며, 계통학적 결과는 쥬크-캔터(Jukes-Cantor) 모델을 적용한 네이버-조이닝(Neighbour-joining) 방법에 따라 계통수(phylogenetic tree) 결과를 도 3에 나타내었다.
분리 균주의 염기서열[서열번호 1]은 NCBI에서 상동성을 조사한 결과, 다음 표 3에 나타낸 바와 같이 클로렐라 불가리스로 분류되었다.
미세조류 균주 서열길이 (nta) 근연종 %
상동성
Chlorella vulgaris YSW04 881 Chlorella vulgaris AB237642 97
이상에서와 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 분리한 미세조류균은 폐수의 내성과 높은 함량의 지질을 함유하는 점을 제외하고는 형태 및 최적 온도, pH 등의 특성을 종합 고려할 때 클로렐라 불가리스에 속하는 것으로 밝혀졌다.
이에, 본 발명에 따른 신균주를 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)으로 명명하였고, 2010년 6월 1일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC93106P를 부여받았다.
실시예 4: 폐수 내성 및 질소, 인 제거 확인
MF(Micro Filtration)을 거친 폐수에 상기 실시예 2에 의해 확보된 조류 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)에서 질소와 인 제거를 검토하기 위하여 각각 다른 유입원에 따라 조류를 식종(seeding)하였다. 각각의 반응조는 20 내지 22 ℃의 실온을 유지하였으며, pH는 7.7 내지 7.9로 자연 상태로 유지하였고 회분 실험 형태로 진행하였다. 처음 식종 후 조류가 적응하는 데까지 걸리는 시간은 10 일 내외로 그 이후 폐수의 초기 농도에 관계없이 질소와 인의 제거가 발생되었다.
도 3에서는 조류 적응이 진행된 후로 10 ~ 12일 내로 질소와 인의 저감이 빠르게 진행되었다. 이는 반응기에 정상 상태(steady-state)의 조류를 적용 시 빠른 인, 질소의 제거가 발생될 것으로 판단된다.
실시예 5: 지질 생산 및 지방산 추출
조류는 탄수화물, 단백질, 지질 등으로 구성되어 있는 종속/독립영양으로 광합성 작용을 통해 성장한다.
지방산 함량 및 조성은 Lepage와 Roy[Lepage, G., C.C. Roy (1984) Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification, Journal of Lipid Research, 25, 1391-1396.]의 방법을 변형하여 분석하였다. 표준물질로 지방산 메틸 에스테르 혼합물(Fatty acid methyl ester mixture)인 Mix RM3, Mix RM5, GLC50, GLC70(Supelco, USA)와 헵타데카논산(Heptadecanoic acid), 감마-리놀렌산(gamma-Linolenic acid)[Supelco, USA]를 사용하였다. 테프론 마개를 가진 유리 튜브(11 mL, DH.GL28020, Daihan Scientific, Korea)에 질량을 측정한 미세조류 지질 시료 넣고 클로로포름-메탄올(2:1, vol/vol) 2 mL을 주입한 후 상온에서 10분간 보르텍스 믹서(vortex mixer, Vorex Genius 3. Ika, Italy)로 섞었다. 내부표준물질인 노나데카논산(nonadecanoic acid, Sigma Co., USA)를 함유한 클로로포름 1 mL (500 ㎍/L), 메탄올 1 mL, 황산 300 ㎕를 순차적으로 유리 튜브에 첨가한 후 5분간 믹서로 섞었다. 튜브를 항온수조에 넣고 100 ℃에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 상온까지 냉각시킨 후 증류수 1 mL을 주입하고, 믹서로 5분 정도 격렬히 섞은 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 층분리시켰다. 아래층(유기상)을 1회용 PP 재질 주사기(Norm-ject, Germany)로 뽑아 1회용 0.22 ㎛ PVDF 실린지 필터(Millex-Gv, Millipore, USA)로 여과 후 자동 주입기를 가진 가스크로마토그래피(Model 7890, Agilent, USA)로 분석하였다.
본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04) 균주는 균체 건조 중량의 약 20 중량%의 지질이 함유되어 있는 것으로 확인되었다[표 4]. 또한, BBM 배양과 비교하였을 시 구성하고 있는 지질 함량의 차이가 나타났으며[표 5], 지방산 중 고품질 바이오디젤 생산이 가능한 올레산의 차이가 발생됨을 검토하였다.
구분 성장조건 바이오매스 생산성
(g dwt/L)		 지질 생산성
(g/L)		 지질 함량
(% biomass)
Chlorella vulgaris YSW04 폐수 1.65 ±0.07 0.44 ±0.05 26.83
Chlorella vulgaris YSW04 BBM 0.97 ±0.03 0.32 ±0.03 21.12
구분　 Chlorella
vulgaris YSW04
(폐수)		 Chlorella
vulgaris YSW04 (BBM)
라우릴산 C12:0 7% -　
미리스틴산 C14:0 3% 1%
팔미틴산 C16:0 17% 23%
팔미올레산 C16:1 7% 0%
스테아린산 C18:0 4% 　-
올레산 C18:1n9c 54% 24%
리놀레산 C18:2n6c 　- 14%
감마-리놀렌산 C 18:3n6 8% 5%
리놀렌산 C18:3n3 　- 33%
총 지방산 (%) 100% 100%
또한, 구성하고 있는 지방산 중 팔미틴산(16:0), 스테아린산(C18:0), 올레산(C 18:1n9c), 및 리놀레산(C18:3n3)는 바이오디젤 생산화를 위한 지방산으로 알려져 있다.
도 4는 클로렐라 불가리스 YSW04 균주의 지방산 분포를 나타낸 것으로 올레인산(C 18:1n9c)이 가장 많이 분포되어 있음을 알 수 있다. 특히, 현재까지 보고된 모든 미세조류의 바이오디젤 생산과정에 불포화지방산 중 상대적으로 산화안정성이 높은 지방산은 올레인산(C 18:1n9c)으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명에 따른 신균주 클로렐라 불가리스 YSW04는 전체 지방산 중 50 중량% 이상의 올레산(C 18:1n9c)으로 구성되어 고품질 바이오디젤 생산이 가능하다.
농업생명공학연구원 KACC93106 20100601
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Novel strain Chlorella vulgaris YSW04 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 811 <212> DNA <213> Chlorella vulgaris YSW04 <400> 1 gatgccctta gtaacggcga gcgaaccggg caaagcccaa cttgaaaatc tccagcctcc 60 ggctggcgaa ttgtagtcta gagaagcgct ctctgcctca ccccggcccc aagtcccctg 120 gaaaggggcg tcagagaggg tgagaacccc gttgggaccg gatgcgtgag gctccacgag 180 acgctttcgt agagtcgggt tgtttgggaa tgcagcccaa agaaggtggt aaatcccatc 240 taaggctaaa tacagacggg agaccgatag cgaacaagta ccgtgaggga aagatgaaaa 300 gaactttgaa aagagagtta aaaagtactt gaaattgttg agagggaagc gattggatcc 360 tacgggtgcg cccaggcaca cgcctgccta acggttggct gaatgcgctg ggtgctggtc 420 agcatgggtt ggccgggcgg gataaacccg ggggttgtta ccccggctat gtcgcctggc 480 cgaccgagga acgaagggcg ctctttgagt cctccgggaa ctgcgccctc aagatgctgg 540 cggaaaggtt ctaatcggcc cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtctaac atgcatgcga 600 gctggtgggt ggcaaaccca tgaagcgcaa gtaacctgac tggtgggatg gcctgtgcct 660 gcaccatcga ccgcgcatga tcttctgtga aaggttcgga gtacgagcat gcactgttgg 720 gacccgaaag atggtgaact atgcctgagc agggcgaagc cagaggaaac tctggtggag 780 gctcgtagat gtgctgacgt gcaaatcgct t 811

Claims (10)

  1. 폐수 내성 및 지질 함량이 높은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주.
  2. 28s rDNA가 서열번호 1의 염기서열인 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04) 균주.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 균주 내 지질 함량이 균체 건조 중량의 20 중량% 이상인 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04) 균주.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 균주 내 올레산이 총 지방산 중 50% 이상 함유된 클로렐라 불가리스 YSW04 (Chlorella vulgaris YSW04) 균주.
  5. 지질을 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법에 있어서,
    상기 지질은 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주 또는 이의 배양액으로부터 분리된 지질인 바이오디젤의 생산방법.
  6. 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 폐수 처리용 미생물제제.
  7. 조류를 이용하여 폐수 내 질소 및 인을 제거하는 방법에 있어서, 상기 조류는 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주인 질소 및 인의 제거방법.
  8. 클로렐라 불가리스 YSW04(Chlorella vulgaris YSW04)[KACC93106P] 균주를 20 내지 30 ℃, pH 7.0 내지 8.0 하에서 배양하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 균주를 폐수에서 배양하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alimentos e Nutricao, vol. 17, no. 4, pp. 429-436, 2006 *
Grasas y Aceites, vol. 57, no. 3, pp. 270-274, 2006 *
Quimica Nova, vol. 31, no. 7, pp. 1609-1612, 2008 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101576480B1 (ko) 2014-03-27 2015-12-11 경북대학교 산학협력단 신규한 미세조류 클로렐라 불가리스 knua007 균주 및 이로부터 지방산, 지방 알코올 및 에고스테롤 생산 방법

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