CN105713836B - 一株富含油脂的纤维藻及其培养应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株富含油脂的纤维藻及其培养应用，该藻株为SS‑B7，其分类命名为纤维藻（Ankistrodesmus sp.），已于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7478。本发明的纤维藻SS‑B7能够耐受高浓度的CO₂和NOx，固碳效率高，获得的生物质中细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

Description

一株富含油脂的纤维藻及其培养应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一株耐受高浓度CO₂和NO_X的富含油脂的纤维藻及其培养应用。

背景技术

由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO₂的急剧增加引起的温室效应越来越严重，除此之外来自石油和化工行业的工业废气中，除了含有高浓度CO₂气体外，SOx、NOx等酸性气体的浓度也很高。微藻的生长周期短、光合效率高，CO₂固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10 倍以上，不仅可以减少CO₂排放，同时也降低了培养成本；除CO₂外，废气中的一些SOx、NOx等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

但是实际应用中，当环境中CO₂体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率；而通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、NOx等气体也会抑制微藻生长并降低固碳效率。目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO₂的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻(Nannochloropsis gaditana )藻株及其应用，该藻株可在PH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonases sp .）及其用于生产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸 C18:3和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。CN102703326A公开了一种高CO₂耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。

刘平怀等（有机碳源对单针藻细胞生长、油脂积累和光合作用的影响，生物工程，2012，33(18): 224-246）介绍了利用有机碳源培养单针藻的一种生产方式，培养结束虽然生物量超过了10g/L，但这种方式为单针藻异养培养方式，培养过程中利用葡萄糖等有机碳源来实现细胞生长，这种培养方式没有利用CO₂等无机碳源经济，而且有机碳源的加入，在培养过程易产生染菌问题，影响藻细胞的生长。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一株富含油脂的纤维藻及其培养应用。本发明的纤维藻能够耐受高浓度的CO₂和NOx，固碳效率高，获得的生物质中细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

本发明富含油脂的藻株SS-B7，其分类命名为纤维藻（Ankistrodesmus sp.），已于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 7478。

本发明提供的纤维藻SS-B7在显微镜下藻细胞为绿色，镰形或弓形、丛生、弯曲，自中央向两端渐尖细，末端尖，长大约5-6μm，中央宽约2μm，具体形态见附图1。

本发明的纤维藻SS-B7可以耐受的CO₂浓度可达40v%，可以耐受的NOx的浓度可达400×10^-6（v/v）。

本发明富含油脂的纤维藻SS-B7的培养方法，在光照生物反应器中，利用BG11、SE等淡水培养基培养，在光照强度1500-10000Lux，pH值为6-9，温度为15-40℃下培养，从反应器底部通入CO₂含量为5v%-40v%的气体；培养8天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

本发明的纤维藻SS-B7在固定CO₂中的应用。该藻株能够耐受高达40v%的CO₂浓度，具有较高的CO₂固定效率。

本发明的纤维藻SS-B7在生产微藻油脂中的应用。该纤维藻在适宜的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

本发明纤维藻SS-B7在净化含CO₂和NOx的废气或烟气中的应用。该藻株可以利用含CO₂和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO₂含量不超过30v%，NOx含量不超过400×10^-6（v/v）。在光照生物反应器中，利用BG11或SE淡水培养基培养，从反应器底部通入CO₂含量为5v%-30v%，NO和/或NO₂含量为100×10^-6-400×10^-6（v/v）的废气或烟气，在光照强度1500-10000Lux，pH值为7-9，温度为20-40℃下处理废气，处理8天后结束；收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

1、本发明选育的纤维藻SS-B7能够耐受高浓度的CO₂和NOx，可以利用废气中的CO₂进行自养生长，固定CO₂，缓解目前工业社会带来的温室效应问题；同时能够耐受废气中的NOx，避免了微藻利用废气生长时高浓度的NOx对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长；

2、该藻株在固定烟气中CO₂ 的同时，可以利用烟气中的部分NOx作为氮源生长使用，在促进藻株生长的同时能够很好的进行CO₂的固定，并能脱除烟气的NOx，净化烟气；

3、该藻株的生长速率快，生长周期短，仅为8天左右，最终生物量较高，细胞干重超过10g/L，生物量产率超过了1.3g/(L·d)，所含的总脂含量高，适于生产生物柴油，可以解决生物柴油生产的油脂来源的问题。

生物材料保藏说明

本发明提供的纤维藻SS-B7（Ankistrodesmus sp.）藻株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 7478；保藏日期：2013年4月15日。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，v%为体积分数。

实施例1 分离和驯化筛选获得单针藻SS-B7

（1）出发藻株的获得：2011年10月从黑龙江杜博尔特蒙古族自治县寿山休闲度假村龙虎湖取回水样50mL，将水样接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10^-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养8天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为SS-7。

（2）CO₂的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为25℃，通入的气体中CO₂的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养8天后结束，反复驯化培养3次。

（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（2），培养至对数生长期。

（4）NOx的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO₂含量为20v%的混合气，光照强度为5000Lux，温度为25℃，混合气中注入NO气体对藻种进行NOx的耐受性培养，培养过程中混合气中NO的含量从100×10^-6（v/v）逐级提高到400×10^-6（v/v），培养过程中每两天提高100×10^-6（v/v），培养8天结束，反复驯化培养3次，收获耐受NOx的藻液。

（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（2），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为SS-B7。

实施例2 藻株的鉴定

获得的SS-B7藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Ankistrodesmus sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2702，Max index值为99%，可以确定SS-B7为纤维藻（Ankistrodesmus sp.）。

实施例3 纤维藻SS-B7的培养应用

将对数生长期的SS-B7的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD₆₉₀为0.2。从反应器底部通入CO₂含量为30v%的烟气，其中NO₂含量为300×10^-6（v/v）。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。测得培养8天的SS-B7藻株的生物质产量为11.2g/L，细胞总脂含量占细胞干重的43.43%。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

实施例4 SS-B7和SS-7的生长效果的比较

将对数生长期的SS-B7和SS-7的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD₆₉₀为0.2。根据试验需要，组配不同含量的CO₂和NO混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为5000Lux，温度为28℃，pH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为10天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表3所示。

表3 SS-B7和SS-7培养结果对比

从结果可以看出，经过驯化筛选的SS-B7比初始藻株SS-7对CO₂和NO有更好的耐受性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院

<120> 一株富含油脂的纤维藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<160> 1

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 1502

<212> DNA

<213> Ankistrodesmus sp.

<400> 1

aacctggttg atcctgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcatgtct 60

aagtataaac tgcttatact gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatagtttat 120

ttgatggtac ctctactcgg ataaccgtag taattctaga gctaatacgt gcgcaaatcc 180

cgacttctgg aagggacgta tttattagat aaaaggccga ccgggctctg cccgacccgc 240

ggtgaatcat gataacttca cgaatcgcat agcctcgtgc tggcgatgtt tcattcaaat 300

ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat agaggcctac catggtggta acgggtgacg 360

gagaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag 420

gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctga tacggggagg tagtgacaat aaataacaat 480

accgggcatt caatgtctgg taattggaat gagtacaatt taaatccctt aacgaggatc 540

cattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat agcgtatatt 600

taagttgttg cagttaaaaa gctcgtagtt ggatttcggg tgggttccag cggtccgcct 660

atggtgagta ctgctgtggc cctccttttt gccggggacg gtctcctggg ctttactgtc 720

cgggaatcgg agtcggcgat gatactttga gtaaattaga gtgttcaaag caagcctacg 780

ctctgaatac tttagcatgg aatatcgcga taggactctg gcctatctcg tcaaagcaag 840

cctacgctct gaatacttta gcatggaata tcgcgatagg actctggcct atctcgttgg 900

tctgtaggac cggagtaatg attaagaggg acagtcgggg gcattcgtat ttcattgtca 960

gaggtgaaat tcttggattt atgaaagacg aactactgcg aaagcatttg ccaaggatgt 1020

tttcattaat caagaacgaa agttgggggc tcgaagacga ttagataccg tcgtagtctc 1080

aaccataaac gatgccgact agggattgga ggatgttctt ttgatgactt ctccagcacc 1140

ttatgagaaa tcaaagtttt tgggttccgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa 1200

aggaattgac ggaagggcac caccaggcgt ggagcctgcg gcttaatttg acttaacacg 1260

ggaaaactta ccaggtccag acatagtgag gattgacaga ttgagagctc tttcttgatt 1320

ctatgggtgg tggtgcatgg ccgttcttag ttggtgggtt gccttgtcag gttgattccg 1380

gtaacgaacg agacctcagc ctgctaaata gtcactgccg ctttttgcgg ttggccgact 1440

tcttagaggg acagatgcta caaaagcatc ggaagtatga ggcaataaca ggtctgtgat 1500

gc 1502

Claims (9)

1.一株富含油脂的纤维藻，该纤维藻为SS-B7，其分类命名为纤维藻（Ankistrodesmus sp），已于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7478。

2.按照权利要求1所述的纤维藻，其特征在于：该纤维藻在显微镜下藻细胞为绿色，镰形或弓形、丛生、弯曲，自中央向两端渐尖细，末端尖，长5-6μm，中央宽2μm。

3.按照权利要求1所述的纤维藻，其特征在于：该纤维藻能够耐受CO₂的浓度达40v%，耐受NOx的浓度达400×10^-6 v/v。

4.按照权利要求1所述的纤维藻SS-B7的培养方法，其特征在于：该纤维藻在光照生物反应器中，利用BG11或SE淡水培养基培养，在光照强度1500-10000Lux，pH值为6-9，温度为15-40℃下培养，从反应器底部通入CO₂含量为5v%-40v%的气体；培养8天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

5.按照权利要求1所述的纤维藻SS-B7在固定CO₂中的应用。

6.按照权利要求1所述的纤维藻SS-B7在生产微藻油脂中的应用。

7.按照权利要求1所述的纤维藻SS-B7在净化含CO₂和NOx的废气或烟气中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：该纤维藻利用含CO₂和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO₂不超过30v%，NOx含量不超过400×10^-6 v/v。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：在光照生物反应器中，利用BG11或SE淡水培养基培养，从反应器底部通入CO₂含量为5v%-30v%，NO和/或NO₂含量为100×10^-6-400×10^-6 v/v的废气或烟气，在光照强度1500-10000Lux，pH值为7-9，温度为20-40℃下处理废气，处理8天后结束；收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。