CN114507604B - 一株富含油脂的纺锤纤维藻及其培养应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株富含油脂的纺锤纤维藻及其培养应用，该藻株为纺锤纤维藻HC‑DY4，其分类命名为纺锤纤维藻（Ankistrodesmus fusiformis），已于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19981。本发明提供的纺锤纤维藻能够利用二氧化碳进行光能快速生长，获得富含油脂的生物质；同时具备耐受NOX和耐低温性能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种富含油脂的纺锤纤维藻的及其培养应用。
背景技术
进入21世纪以来，经济的发展与能源的消耗存在着密切的关系，能源安全问题是各国战略性的问题，寻找一种清洁、经济、高效、可再生的新能源成为了当前急需解决的问题，其中生物能源一直作为一个重要储备技术方向，各个国家都对此保持着兴趣。在诸多的生物质能源中，微藻具有细胞结构简单、光合效率高、生长速率快、单位面积油脂产量高、可积累高附加值生物产品、同时可吸收二氧化碳、净化环境等优势，成为能源研究领域关注的焦点。
微藻细胞在生长过程中积累油脂、淀粉、蛋白、色素等成分，某些藻类中淀粉和糖原含量占细胞干重的30%，也有一些藻类在特定培养条件下油脂含量可高达80%。如何有效的筛选获得具有高油脂含量、环境适应能力强、可规模化培养且成本较低的新藻种，便成了各国工作者研究的重点。
CN105713836A公开了一株富含油脂的纤维藻（Ankistrodesmus sp.）SS-B7及其培养应用，该纤维藻能够耐受高浓度的CO2和NOx，固碳效率高，获得的生物质中细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。但该藻株并不耐受低温，在低温下生长缓慢甚至会停止生长。
温度对微藻的生长和繁殖的影响比较大，通常微藻的最适宜生存温度是15-28℃，温度过低会导致微藻生长缓慢甚至停止生长，而且在冬天寒冷的天气下，微藻生长需要耗能比较多。因此还需选育具备耐低温的微藻，或者选育具备多功能的微藻，以使其更适于工业应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株富含油脂的纺锤纤维藻及其培养应用。本发明提供的纺锤纤维藻能够利用二氧化碳进行光能快速生长，获得富含油脂的生物质；同时具备耐受NOX和耐低温性能。
本发明富含油脂的纺锤纤维藻HC-DY4，其分类命名为纺锤纤维藻（Ankistrodesmus fusiformis），已于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19981。
本发明提供的纺锤纤维藻HC-DY4在显微镜下藻细胞为绿色，常聚集成群，单个细胞为纺锤形，自中央向两端渐尖细，末端尖，长大约20-30μm，中央宽约2-5μm。
本发明提供的纺锤纤维藻HC-DY4能够耐受的CO2浓度可达40v%，能够耐受的NOx的浓度可达0.07v%，能够耐受的低温可达5℃。
本发明提供的纺锤纤维藻HC-DY4的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的纺锤纤维藻HC-DY4与已公布的纺锤纤维藻的18SrDNA数据存在差异。
本发明的纺锤纤维藻HC-DY4的培养方法，在光生物反应器中，利用淡水培养基培养，具体如BG11培养基、SE培养基或D1培养基等，通入CO2含量为1.0v%-40v%的气体。进一步的，通入气体中同时含有NOx，NOx的浓度不高于0.07v%。培养条件为：光照强度1500-20000Lux，pH值为6-11，温度为5-35℃，优选10-30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养结束，收获微藻细胞。经检测，藻细胞干重达6g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的45%以上。
本发明的纺锤纤维藻HC-DY4在固定CO2中的应用。该藻株能利用CO2进行光照自养生长，能够耐受的CO2浓度可达40v%，具有较高的CO2固定效率。
本发明的纺锤纤维藻HC-DY4在生产微藻油脂中的应用。该藻株在适宜的生长条件下进行光照自养生长获取富含油脂的藻细胞，藻细胞干重达6g/L以上，细胞总脂含量可占细胞干重的45%以上，能够作为生物燃料及其他油脂产品的生产原料。
本发明的纺锤纤维藻HC-DY4在净化含CO2和NOx的废气或烟气中的应用。废气或烟气中的CO2浓度≤40v%，NOx的浓度≤0.07v%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明选育的纺锤纤维藻HC-DY4，能够利用CO2在自养条件高效生长、固定，固碳效率高，缓解目前工业社会所带来的CO2温室效应问题。
（2）该藻株同时具备耐受NOx和耐低温的功能。在废气中同时存在CO2和NOx时，能够避免微藻利用废气生长时NOx对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。该藻株耐低温能力强，即使在5-15℃下，仍能保持较快的生长速率，在冬季养殖降低培养成本。
（3）该藻株所得产品的经济性高，经过8天培养后，藻细胞干重达6g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的45%以上，适于生产生物柴油。
生物材料保藏说明
本发明提供的纺锤纤维藻HC-DY4（Ankistrodesmus fusiformis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No. 19981；保藏日期：2020年5月12日；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。本发明中，v%为体积分数。
实施例1 分离和驯化筛选获得纺锤纤维藻HC-DY4
（1）出发藻株的获得：2016年10月从吉林省珲春市珲春河取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50ml接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为15℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为15℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为15℃，光照强度为5000Lux，培养8天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为HC-D4。
（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为10℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养8天后结束，反复驯化培养3次。
（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。
（4）NOx的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气，光照强度为5000Lux，温度为10℃，混合气中注入NO气体对藻种进行NOx的耐受性培养，培养过程中混合气中NO的含量从0.01%逐级提高到0.07%，培养过程中每天提高0.01%，培养结束后，反复驯化培养3次，收获耐受NOx藻液。
（5）将步骤（4）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为HC-DY4。
实施例2 藻株的鉴定
将获得HC-DY4藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Ankistrodesmus fusiformis有最大的相似性，其BLASTn值为2848，Max index值为99.68%，可以确定HC-DY4为纺锤纤维藻（Ankistrodesmus fusiformis）。
实施例3纺锤纤维藻HC-DY4的应用
将对数生长期的纺锤纤维藻的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD690为0.23。从反应器底部通入CO2含量为40v%的烟气，其中NO含量0.07%。。培养过程中光照强度为8000Lux，培养温度为20℃，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天，结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测，HC-DY4藻株的生物质产量为6.59g/L，细胞总脂含量占细胞干重的48.79%。
表1 BG11培养基
*表2表1中A5+Co solution的组成
实施例4 HC-DY4和HC-D4的培养效果比较
将对数生长期的HC-DY4和HC-D4的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.23。根据试验需要，组配不同含量的CO2和NO混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为8000Lux，在不同的CO2和NO浓度下培养，pH值控制在7-8之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，并用正己烷：乙酸乙酯法测得细胞总脂含量。结果如表3。
表3 HC-DY4和HC-D4培养结果对比
从表3可以看出，本发明筛选的HC-DY4比初始藻株HC-D4对CO2和NO有更好的耐受性。在NO存在下，不影响微藻的正常生长。但是，该藻株与初始藻株在常规培养条件下对NO的去除率均不高。
实施例5 HC-DY4和HC-D4的培养温度比较
将对数生长期的HC-DY4和HC-D4的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.23。从反应器底部通入CO2含量为10v%的烟气，其中NO含量0.03。培养过程中光照强度为8000Lux，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天。培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表4。
表4 HC-DY4和HC-D4的培养结果对比
从表4可以看出，本发明HC-DY4比初始藻株HC-D4具有更好低温耐受性，但是二者均不耐受高温。
比较例1
同实施例3，不同在于采用CN107177505A公开的栅藻HCS-02（Scenedesmus sp.），保藏编号为CGMCCNo.10766，培养8天结束。经检测，HCS-02藻株的生物质产量为3.1g/L，细胞总脂含量占细胞干重的20.78%。
比较例2
同实施例3，不同在于采用CN107177505A公开的栅藻SHJ-02（Scenedesmus sp.），保藏编号为CGMCCNo.10763，培养8天结束。经检测，SHJ-02藻株的生物质产量为2.09g/L，细胞总脂含量占细胞干重的15.7%。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院
<120> 一株富含油脂的纺锤纤维藻及其应用
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<400> 2
tgatcctgcc agtagtcata tgcttgtctc aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa 60
actgcttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt atttgatggt 120
acctctactc ggataaccgt agtaattcta gagctaatac gtgcgcaaat cccgacttct 180
ggaagggacg tatttattag ataaaaggcc gaccgggctc tgcccgaccc gcggtgaatc 240
atgataactt cacgaatcgc atagcctcgt gctggcgatg tttcattcaa atttctgccc 300
tatcaacttt cgatggtagg atagaggcct accatggtgt aacgggtgac ggaggattag 360
ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc 420
gcgcaaatta cccaatcctg atacggggag gtagtgacaa taaataacaa taccgggcat 480
tcaatgtctg gtaattggaa tgagtacaat ttaaatccct taacgaggat ccattggagg 540
gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat ttaagttgtt 600
gcagttaaaa agctcgtagt tggatttcgg gtgggttcca gcggtccgcc tatggtgagt 660
actgctgtgg ccctcctttt tgccggggac ggtctcctgg gctttactgt ccgggaatcg 720
gagtcggcga tgatactttg agtaaattag agtgttcaaa gcaagcctac gctctgaata 780
ctttagcatg gaatatcgcg ataggactct ggcctatctc gttggtctgt aggaccggag 840
taatgattaa gagggacagt cgggggcatt cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcgga 900
tttatgaaag acgaactact gcgaaagcat ttgccaagga tgttttcatt aatcaagaac 960
gaaagttggg ggctcgaaga cgattagata ccgtcgtagt ctcaaccata aacgatgccg 1020
actagggatt ggaggatgtt cttttgatga cttctccagc accttatgag aaatcaaagt 1080
ttttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact taaaggaatt gacggaaggg 1140
caccaccagg cgtggagcct gcggcttaat ttgactaaca cgggaaaact taccaggtcc 1200
agacatagtg aggattgaca gattgagagc tctttcttga ttctatgggt ggtggtgcat 1260
ggccgttctt agttggtggg ttgccttgtc aggttgattc cggtaacgaa cgagacctca 1320
gcctgctaaa tagtcacttt cgctttttgc ggatggccga cttcttagag ggactgtggc 1380
gttctagcca acggaagtat gaggcaataa caggtctgtg atgcccttag atgttctggg 1440
ccgcacgcgc gctacactga cgcattcaac gagcctatcc ttgaccgaga ggtctgggta 1500
atctgtgaaa ttgcgtcgtg atggggatag attattgcaa ttattagtct tcaac 1555
Claims (9)
1. 一株富含油脂的纺锤纤维藻HC-DY4，其分类命名为纺锤纤维藻（Ankistrodesmus fusiformis），已于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19981。
2.一种权利要求1所述的纺锤纤维藻HC-DY4的培养方法，其特征在于：在光生物反应器中，利用淡水培养基培养，通入CO2含量为1.0v%-40v%的气体培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述的淡水培养基培养为BG11培养基、SE培养基或D1培养基。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：通入气体中含有NOx，NOx的浓度不高于0.07v%。
5.根据权利要求2、3或4所述的培养方法，其特征在于：培养条件为：光照强度1500-20000Lux，pH值为6-11，温度为5-35℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：温度为10-30℃。
7.权利要求1所述的纺锤纤维藻HC-DY4在固定CO2中的应用。
8.权利要求1所述的纺锤纤维藻HC-DY4在生产微藻油脂中的应用。
9.权利要求1所述的纺锤纤维藻HC-DY4在净化含CO2和NOx的废气或烟气中的应用。
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