CN106467897A - 一种富含油脂的栅藻及其培养应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富含油脂的栅藻及其培养应用，该藻株为MH-04，其分类命名为栅藻（Desmodesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10764。本发明的栅藻能够耐受高浓度的CO₂和SO₂，可利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中富含油脂，能够进行生物柴油的生产。

Description

一种富含油脂的栅藻及其培养应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种富含油脂的栅藻及其培养应用。

背景技术

由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO₂的急剧增加引起的温室效应越来越严重，除此之外来自石油和化工行业的工业废气中，除了含有高浓度CO₂气体（15v%-30v%）外，SOx、NOx等酸性气体的浓度也很高。微藻的生长周期短、光合效率高，CO₂固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10倍以上，不仅可以减少CO₂排放，同时也降低了培养成本；除CO₂外，废气中的一些SOx、NOx 等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

但是实际应用中，当环境中CO₂体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率；而通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、NOx等气体也会抑制微藻生长和降低固碳效率。目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻（Scenedemus sp.）藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO₂的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产，但该专利所提供的藻株并未涉及该菌株的油脂含量和对CO₂的耐受性。

CN201110427579.6 公开了一株栅藻藻株(Desmodesmus sp.) ENN2203A，该栅藻藻株具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，可用于含氮磷污水的污处理，可用于二氧化碳减排，用于生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料等。但是，该藻株在培养过程中，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，培养进行到第16 天，最终干重达到10.93g/L。CN201110448718.3 涉及一种栅藻藻株ENN2201A(Desmodesmus sp.)，该藻株能够在较大的温度范围内生长，生长速度快且易于收集，并且能够有效产生脂肪酸、类胡萝卜素等物质，具有在污水处理、生物柴油生产、以及饲料或食品行业等应用的潜力。该藻株在培养期内，通过向培养液中通入空气和二氧化碳的混合气体（含体积分数为1.5-2％的二氧化碳），CO₂浓度不高。并且需要培养17天，培养时间较长。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种富含油脂的栅藻及其培养应用。本发明的栅藻能够耐受高浓度的CO₂和SO₂，可利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中富含油脂，能够进行生物柴油的生产。

本发明富含油脂的栅藻MH-04，其分类命名为栅藻（Desmodesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10764。

本发明提供的富含油脂的栅藻MH-04在显微镜下藻细胞呈绿色，常聚集成群，单个细胞呈卵形，细胞壁平滑，内有色素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约5-6μm，宽约2-3μm。

本发明提供的富含油脂的栅藻MH-04能够耐受CO₂的浓度达40v%，耐受SO₂的浓度达400×10^-6（v/v）。

本发明提供的富含油脂的栅藻MH-04的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。本发明富含油脂的栅藻MH-04的培养方法，在光照生物反应器中，利用BG11、SE等淡水培养基培养，在光照强度1500-20000Lux，pH值为6-9，温度为15-40℃下培养，从反应器底部通入CO₂含量为5v%-40v%的气体，培养8天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞。经检测，藻细胞干重达到5g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

本发明的栅藻在固定CO₂中的应用。该藻株能够耐受高达40v%的CO₂浓度，具有较高的CO₂固定效率。

本发明的栅藻在生产微藻油脂中的应用。该栅藻藻株在适宜的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

本发明的栅藻在利用含CO₂和SO₂的废气或烟气生产微藻油脂同时固定CO₂中的应用。该藻株可以利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO₂含量不超过40v%，SO₂含量不超过400×10^-6（v/v），利用BG11、SE等淡水培养基培养，培养的光照强度1500-20000Lux，PH值为6-9，温度为15-40℃下培养，培养8天进入稳定期；培养结束后，收获藻细胞。经检测，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

1、本发明选育的栅藻能够耐受高浓度的CO₂和SO₂，可以利用废气中的CO₂进行自养生长，固定CO₂，缓解目前工业社会带来的温室效应问题；同时能够耐受废气中的SO₂，避免了微藻利用废气生长时高浓度的SO₂对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。

2、该藻株的生长速率快，生长周期短，仅为8天左右，所含的总脂含量高，适于生产生物柴油，可以解决生物柴油生产的油脂来源的问题。

3、该藻种培养稳定期后沉降迅速，12小时内，沉降基本完全，容易收集。

附图说明

图1是本发明方法选育的栅藻（Desmodesmus sp.）MH-04的形态特征图。

生物材料保藏说明

本发明提供的栅藻（Desmodesmus sp.）MH-04，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 10764；保藏日期：2015年4月24日。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，v%为体积分数。

实施例1 分离和驯化筛选获得栅藻MH-04

（1）出发藻株的获得：2011年10月从黑龙江大庆明湖取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50ml接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10^-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养10天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为MH-4。

（2）CO₂的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为25℃，通入的气体中CO₂的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养10天后结束，反复驯化培养3次。

（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。

（4）SO₂的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO₂含量为20v%的混合气，培养光照为5000Lux，温度为25℃，混合气中注入SO₂气体对藻种进行SO₂的耐受性培养，培养过程中混合气中SO₂的含量从50×10^-6（v/v）逐级提高到400×10^-6（v/v），培养过程中每天提高100×10^-6（v/v），培养10天结束，反复驯化培养3次，收获耐受SO₂的藻液。

（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（1），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为MH-04。

实施例2 藻株的鉴定

将获得MH-04藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Desmodesmus sp.有最大的相似性，其BLASTn值为3145，Max index值为99%，可以确定MH-04为栅藻（Desmodesmus sp.）。

实施例3 栅藻MH-04的应用

将对数生长期的MH-04的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后培养液的OD₆₉₀为0.2。从反应器底部通入CO₂含量为30v%的烟气，其中SO₂含量为400×10^-6（v/v）。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，PH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量；并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。测得MH-04藻株的生物质产量为5.7966g/L，细胞总脂含量占细胞干重的 43.63%。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

实施例4 MH-04和MH-4的生长效果的比较

将对数生长期的MH-04和MH-4的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后的密度调整为OD₆₉₀为0.2。根据试验需要，组配不同含量的CO₂和SO₂混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，PH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表3。

表3 不同CO₂和SO₂含量的效果比较

从结果可以看出，经过驯化筛选的栅藻MH-04比初始藻株MH-4对CO₂和SO₂有更好的耐受性，生物量稳定性好。

实施例5 MH-04沉降效果检测

将培养8天后处于稳定期的MH-04藻液静置大约12小时，上清液清澈，基本上所有藻细胞都沉降到容器底部，说明MH-04易于沉降，比较容易收集。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院

<120> 一种富含油脂的栅藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1767

<212> DNA

<213> Desmodesmus sp.

ccaacctggt tgatcctgcc agtagtcata tgcttgtctc aaagattaag ccatgcatgt 60

ctaagtataa actgcttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt 120

atttggtggt accttcttac tcggaataac cgtaagaaaa ttagagctaa tacgtgcgta 180

aatcccgact tctggaaggg acgtatatat tagataaaag gccgaccggg ctctgcccga 240

cccgcggtga atcatgatat cttcacgaag cgcatggccc tgtgccggcg ctgttccatt 300

caaatctctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg cctaccatgg tggtaacggg 360

tgacggagga ttagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa 420

ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cctgatacgg ggaggtagtg acaataaata 480

acaataccgg gcatttcatg tctggtaatt agaatgagta caatctaaat cccttaacga 540

ggatccattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt 600

atatttaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttggatt tcgggtgggt ttcagcggtc 660

cgcctatggt gagtactgct gtggccttcc ttactgtcgg ggacctgctt ctgggcttca 720

ttgtccggga cagggattcg gcatgattac tttgagtaaa ttagagtgtt caaagcaggc 780

ttacgccgtg aatactttag catgcaataa catgatagga ctctgcccta ttttgttggc 840

ctgtaggagt ggagtaatga ttaagaggaa cagtcggggg cattcgtatt tcattgtcag 900

aggtgaaatt cttggattta tgaaagacga actactgcga aagcatttgc caaggatgtt 960

ttcattaatc aagaacgaaa gttgggggct cgaagacgat tagataccgt cgtagtctca 1020

accataaacg atgccgacta gggattggcg gacgtttttg catgactccg tcagcacctt 1080

gagagaaatc aaagtttttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1140

gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1200

aaaacttacc aggtccagac ataggaagga ttgacagatt gagagctctt tcttgattct 1260

atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtgggttgt cttgtcaggt tgattccggt 1320

aacgaacgag acctcagcct ttaaatagtc actgtcgctt tttgcggctg gctttgactt 1380

cttagaggga cagttggcgt ttagtcaacg gaagtatgag gcaataacag gtctgtgatg 1440

cccttagatg ttctgggccg cacgcgcgct acactgatgc attcaacaag cctatcccta 1500

gccgaaaggc tcgggtaatc tttgaaactg catcgtgatg gggatagatt attgcaatta 1560

ttagtcttca acgaggaatg cctagtaagc gcaattcatc agattgcgtt gattacgtcc 1620

ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctcc taccgattgg gtgtgctggt gaagtgttcg 1680

gattggcagt tgaaggtggc aacaccgtcg attgccgaaa agttcattaa accctcccac 1740

ctagaggaag gtgaagtcgt taacaag 1767

Claims (10)

1.一种富含油脂的栅藻MH-04，其分类命名为栅藻（Desmodesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10764。

2.按照权利要求1所述的栅藻，其特征在于：该藻株在显微镜下藻细胞呈绿色，常聚集成群，单个细胞呈卵形，细胞壁平滑，内有色素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约5-6μm，宽约2-3μm。

3.按照权利要求1所述的栅藻，其特征在于：该藻株耐受CO₂的浓度达40v%，耐受SO₂的浓度达400×10^-6（v/v）。

4.权利要求1至3任一权利要求所述的栅藻MH-04的培养方法，其特征在于：在光照生物反应器中，利用BG11或SE淡水培养基培养，在光照强度1500-20000Lux，pH值为6-9，温度为15-40℃下培养，从反应器底部通入CO₂含量为5v%-40v%的气体，培养8天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞。

5.按照权利要求1所述的栅藻MH-04在固定CO₂中的应用。

6.按照权利要求1所述的栅藻MH-04在生产微藻油脂中的应用。

7.按照权利要求1所述的栅藻MH-04在利用含CO₂和SO₂的废气或烟气生产微藻油脂同时固定CO₂中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：废气或烟气中CO₂含量不超过40v%。

9.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：废气或烟气中SO₂含量不超过400×10^-6（v/v）。

10.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：该藻株利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，利用BG11或SE淡水培养基培养，培养的光照强度1500Lux-20000Lux，PH值为6-9，温度为15-40℃下培养，培养8天进入稳定期，培养结束后，收获藻细胞。