CN107916226A - 一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选 - Google Patents

一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，将猪场污水稀释光照摇床培养，经液体培养基培养和固体培养基划线分离获得纯种微藻。对纯种微藻进行曝气培养，并测试培养过程中污水氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD去除率及微藻生物量、单位生物量粗蛋白和油脂积累量。有益效果为：筛选得到的微藻经鉴定为Chlorella sorokiniana，其生长速度快，生物量和油脂积累快，能高效降解污水中的氨氮、总氮、硝态氮和总磷、COD和污水色度降低明显，对水中悬浮物有絮凝沉降作用。

Description

一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选。
背景技术
微藻是指一些微观的单细胞、或多细胞群体或丝状的藻类，如小球藻、盐藻、螺旋藻等，大多数是浮游藻类，生物量大、分布广。具有简单细胞结构的微藻，相对于与陆生高等植物更有效地转化太阳能（光合作用转化效率可达到10%以上），并且繁殖速度较快，单位面积产量是陆生高等植物的若干倍。微藻通过热解可获得生物质燃油，是重要的可再生生物能源；许多微藻能够在细胞中积累大量的油脂，最高含量可达到细胞干重的70%以上，通过生物炼制的方法从这些富含油脂的微藻细胞中提取油脂，用于制备食用油和生物柴油；微藻细胞中还含有多种维生素、类胡萝卜素、蛋白质、多不饱和脂肪酸等营养成分，是生物医药、功能食品、以及化妆品生产的重要原料来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可筛选出生长速度快，生物量和油脂积累快，能高效降解污水中的氨氮、总氮、硝态氮和总磷、COD和污水色度降低明显，对水中悬浮物有絮凝沉降作用的微藻的筛选方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，包括纯种微藻的获取、曝气培养、微藻品种及性质鉴定。上述方法筛选得到的微藻光自养进行的同时还可以利用有机物通过发酵进行异养生长，因此其对光照强度、温度的要求较低，生长速率和细胞浓度均高于一般微藻。上述微藻异养发酵产生的CO2，在光自养过程中被固定，光自养和异养相互协同，在短时间内能够实现高密度高生物量和高油脂的积累，具有应用于生物能源和生物饲料的巨大潜力。上述微藻通过同化作用，将污水中的污染物降解合成自身物质，不仅能高效降解污水中的氨氮、总氮、硝态氮和总磷，COD降低明显，还具有生物絮凝功能，对水中悬浮物和总磷有吸附作用，降低水质色度。纯种微藻的获取步骤为：将猪场污水稀释光照摇床培养，转接液体培养基培养，固体培养基划线分离，光照条件下培养后挑选形态有明显差异的单藻群落，分别接种到液体培养基中摇瓶培养后再次划线纯化分离，最后接种到无菌液体培养基中获得纯种微藻。
作为优选，猪场污水稀释为原来的4~6倍，光照强度2000~4000lux，温度为20~28℃，摇床培养5~9d。营造适合微藻生长的环境，缩短微藻培养时间，得到充足的筛选所需的微藻数量。第一次划线分离后在光照下培养8~12d，挑选形态有明显差异的单藻群落，分别接种到液体培养基中，摇瓶至培养液变成深绿色，再次划线纯化分离。上述操作可避免和减少非目标微藻特别是杂菌在平板上的生长，使目标微藻快速生长。曝气培养步骤为：将获得的纯种微藻接种到液体培养基和氨氮浓度为80~120mg/L的稀释畜禽污水中培养，培养6~10d后测定畜禽污水污染物降解率及污水的吸光度；培养12~18d后测其生物量、单位生物量粗蛋白和油脂积累含量。培养条件均为2000~4000lux，20~30℃，曝气培养。微藻品种及性质鉴定步骤为：挑选曝气培养后单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的纯种微藻，对其进行16srDNA鉴定，确定微藻种类，并观察其微观形态。上述筛选得到的微藻经过16srDNA鉴定，与Chlorella sorokiniana 序列相似度最高，在显微镜下呈圆形，直径5~6.5cm，密度大易沉降通过重力沉降辅助以粗过滤就可以实现固液分离，上清液不会悬浮有藻类，可以极大简化微藻分离步骤，节约成本。筛选得到的微藻保藏号为CCTCC M 2017461，保藏日期为2017-08-31，分类命名为Chlorella sorokiniana CS-3，保藏单位为CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉。
3号微藻16srDNA序列为：
AGGTCTGTTAGATTAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACTGCTTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTACTACTCGGATACCCGTAGTAAATCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGACCGACCGGGCTTGCCCGACTCGCGGTGAATCATGATAACTTCACGAATCGCATGGCCTCGTGCCGGCGATGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACTGGGCCTTTTCAGGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAACCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGGCCTGCCGGTCCGCCGTTTCGGTGTGCACTGGCAGGGCCCACCTTGTTGCCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCACTGTCCGGGACTCGGAGTCGGCGCTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTACGCTCTGAATACATTAGCATGGAATAACACGATAGGACTCTGGCCTATCCTGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCCTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATCGGCGGATGTTTCTTCGATGACTCCGCCGGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGCCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCACGGTTGGCTCGCCAGCCGGCGGACTTCTTAGAGGGACTATTGGCGACTAGCCAATGGAAGCATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACGAGCCTAGCCTTGGCCGAGAGGCCCGGGTAATCTTTGAAACTGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCGACCGGGGGCGGTCTCCGCTCTCGGCCGCCGAGAAGTTCATTAAACCCTCCCACCTAGAGAAGAGAAGTCGAGATTCCCAC。
作为优选，液体培养基包括以下成分及其浓度： NaNO3 12~18g/100mLdH2O、K2HPO41~8g/100mLdH2O、MgSO4·7H2O6.5~8.5g/100mLdH2O 、CaCl2·2H2O3.0~4.0g/100mLdH2O、柠檬酸0.4~0.8g/100mLdH2O、AA（花生四烯酸）0.002~0.003g/100mldH2O、TPP（磷酸三苯酯）0.0010~0.0018g/100mldH2O、柠檬酸铁胺0.4~0.8g/100mldH2O、 EDTANa2 0.08~0.12g/100mldH2O、 NaCO31.5~2.5g/100mldH2O、微量元素溶液A50.6~1.5ml/L、H3BO3 2.50~3.00g/LdH2O、MnCl2·4H2O1.75~1.95g/LdH2O、ZnSO4·7H2O0.18~0.28g/LdH2O、Na2MoO4·2H2O0.018~0.025g/LdH2O、CuSO4·5H2O0.06~0.10g/L dH2O、Co(NO3)2·6H2O0.04~0.06g/LdH2O。产油微藻的培养过程分为两个阶段，上述液体培养基可提供微藻光自养第一个阶段所需的碳源、氮源、磷源和微量元素等物质，藻细胞增殖和膨大，积累大量的生物量，细胞生长速率快，但细胞内积累很少的油脂，主要是蛋白质和碳水化合物等。随着上述培养基中氮源的消耗，微藻的生长进入第二阶段，进行油脂的积累。相对于现有微藻培养基，上述培养基在不添加抗生素的情况下抑菌效果优良，培养的微藻的生长周期明显缩短，且生物量和油脂积累量大。其中，AA（花生四烯酸）和TPP（磷酸三苯酯）的加入可促进微藻进行发酵异养生长，降低微藻对光照强度、温度的要求，在短时间内能够实现高密度高生物量和高油脂的积累。
作为优选，固体培养基为液体培养基中加入0.9~1.1%琼脂制得。琼脂浓度过高，微藻不易生长，琼脂浓度过低会导致琼脂失去支持物的作用，同时也使细菌等容易通过琼脂的缝隙运动，使纯化分离失败。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1. 本发明筛选得到的微藻通过同化作用，将污水中的污染物降解合成自身物质，不仅能高效降解污水中的氨氮、总氮、硝态氮和总磷，COD降低明显，还具有生物絮凝功能，对水中悬浮物和总磷有吸附作用，降低水质色度；
2. 本发明筛选得到的微藻光自养进行的同时还可以利用有机物通过发酵进行异养生长，因此其对光照强度、温度的要求较低，生长速率和细胞浓度均高于一般微藻。上述微藻异养发酵产生的CO2，在光自养过程中被固定，光自养和异养相互协同，在短时间内能够实现高密度高生物量和高油脂的积累，具有应用于生物能源和生物饲料的巨大潜力；
3. 本发明筛选得到的微藻密度大，细胞直径长，沉降性能优良，不会出现出水中混杂有大量悬浮藻类的现象，通过后续单元的重力沉降和粗过滤就可以保证出水感官良好。这种特性容易在胞内积累油脂和蛋白质，极大的简化了后期藻类分离和加工的工艺，降低了处理成本，减少了絮凝剂的使用。
附图标记
图1为实施例1中四种微藻划线纯化图；
图2为根据3号微藻16srDNA构建的NJ系统进化树；
图3为实施例1中1号微藻OD680与生物量关系图；
图4为实施例1中2号微藻OD680与生物量关系图；
图5为实施例1中3号微藻OD680与生物量关系图；
图6为实施例1中4号微藻OD680与生物量关系图；
图7为实施例1中3号微藻时间-生物量关系图；
图8为实施例1中四种微藻收获后生物量生产率、蛋白生产率和蛋白含量图；
图9为实施例1中四种微藻收获后生物量生产率、油脂生产率和油脂含量图；
图10为实施例1培养3号微藻的污水中氨氮含量变化图；
图11为实施例1培养3号微藻的污水中总氮含量变化图；
图12为实施例1培养3号微藻的污水中硝态氮含量变化图；
图13为实施例1培养3号微藻的污水中总磷含量变化图；
图14为实施例1培养3号微藻的污水中COD值变化图；
图15为实施例1培养3号微藻的污水中OD450变化图
附图标记说明：图11~15中CK曲线分别为不培养微藻的污水中氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD值和OD450。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，具体操作步骤为：
1）纯种微藻的获取：将猪场污水稀释为原来的5倍，光照摇床培养，光照强度3000lux，温度为25℃，摇床培养7d。在污水颜色变为绿色后，转接液体培养基培养7d，用固体培养基划线分离，光照条件下培养10d后挑选形态有明显差异的单藻群落。将挑选的单藻群落分别接种到液体培养基中摇瓶培养至培养液变成深绿色，划线纯化分离，进行二次纯化，最后接种到无菌液体培养基中获得如图1所示四种纯种微藻。液体培养基成分及其浓度：NaNO3 15.0g/100mLdH2O、 K2HPO44g/100mLdH2O、MgSO4·7H2O7.5g/100mLdH2O 、CaCl2·2H2O3.6g/100mLdH2O、柠檬酸0.6g/100mLdH2O、AA0.003g/100mldH2O 、TPP0.0015g/100mldH2O、柠檬酸铁胺0.6g/100mldH2O、 EDTANa2 0.1g/100mldH2O 、Na2CO3 2.0g/100mldH2O 、微量元素溶液A51ml/L 、葡萄糖40g/LdH2O 、H3BO3 2.86g/LdH2O、 MnCl2·4H2O1.86g/LdH2O、 ZnSO4·7H2O0.22g/LdH2O 、Na2MoO4·2H2O0.021g/LdH2O 、CuSO4·5H2O 0.08g/LdH2O 、Co(NO3)2·6H2O 0.05g/LdH2O 。固体培养基为液体培养基中加入0.98%琼脂制得；
2）曝气培养：将获得的四株纯种微藻编号并接种到液体培养基和氨氮浓度为100mg/L的稀释畜禽污水中培养，培养条件均为3000lux，25℃，曝气培养，初始OD680为0.1。培养8d后3号微藻对畜禽污水污染物降解效率最高，氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD去除率分别为96%、97%、95%、99%和46%。污水色度明显降低，450nm吸光值从0.345降至0.119，主要因为微藻在凝集成团后对悬浮物具有一定的吸附作用。培养15d后生物量分别达到1.5，1.6，1.8，0.63g/L，单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的为3号微藻，分别为34%和36%；
3）微藻品种及性质鉴定：挑选曝气培养后单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的纯种微藻，对其进行16srDNA鉴定，与Chlorella sorokiniana 序列相似度最高。并且基于NJ法进行进化树的构建，如图2所示，3号微藻属于小球藻。该小球藻显微镜下程圆形，直径5~6.5um左右，密度大，易沉降。在筛选出的四株微藻中沉降速率最快，相同吸光度（680nm）生物量最高，通过重力沉降辅助以粗过滤就可以实现固液分离，上清液中不会悬浮有藻类，可以极大简化微藻分离步骤，节约成本。
实施例2：
一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，具体操作步骤为：
1）纯种微藻的获取：将猪场污水稀释为原来的5倍，光照摇床培养，光照强度3000lux，温度为25℃，摇床培养7d。在污水颜色变为绿色后，转接液体培养基培养7d，用固体培养基划线分离，光照条件下培养10d后挑选形态有明显差异的单藻群落。将挑选的单藻群落分别接种到液体培养基中摇瓶培养至培养液变成深绿色，划线纯化分离，进行二次纯化，最后接种到无菌液体培养基中获得纯种微藻。液体培养基成分及其浓度：NaNO3 17.0g/100mLdH2O、K2HPO43g/100mLdH2O、MgSO4·7H2O6.9g/100mLdH2O 、CaCl2·2H2O3.4g/100mLdH2O、柠檬酸0.62g/100mLdH2O、AA0.002g/100mldH2O 、TPP0.0017g/100mldH2O、柠檬酸铁胺0.6g/100mldH2O、 EDTANa2 0.1g/100mldH2O 、Na2CO3 2.0g/100mldH2O 、微量元素溶液 A51ml/L、麦芽糖45g/LdH2O 、H3BO3 2.86g/LdH2O、 MnCl2·4H2O1.86g/LdH2O、 ZnSO4·7H2O0.22g/LdH2O 、Na2MoO4·2H2O0.021g/LdH2O 、CuSO4·5H2O 0.08g/LdH2O 、Co(NO3)2·6H2O 0.05g/LdH2O 。固体培养基为液体培养基中加入1%琼脂制得；
2）曝气培养：将获得的四株纯种微藻编号并接种到液体培养基和氨氮浓度为100mg/L的稀释畜禽污水中培养，培养条件均为3000lux，25℃，曝气培养，初始OD680为0.1。培养8d后3号微藻对畜禽污水污染物降解效率最高，氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD去除率分别为96%、98%、95.8%、99.2%和53%。污水色度明显降低，450nm吸光值从0.342降至0.105，主要因为微藻在凝集成团后对悬浮物具有一定的吸附作用。培养15d后生物量分别达到1.52，1.67，1.91，0.57g/L，单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的为3号微藻，分别为34.7%和37.1%；
3）微藻品种及性质鉴定：挑选曝气培养后单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的纯种微藻，对其进行16srDNA鉴定，与Chlorella sorokiniana 序列相似度最高。该小球藻显微镜下程圆形，直径5~6.5um左右，密度大，易沉降。在筛选出的四株微藻中沉降速率最快，相同吸光度（680nm）生物量最高，通过重力沉降辅助以粗过滤就可以实现固液分离，上清液中不会悬浮有藻类，可以极大简化微藻分离步骤，节约成本。
实施例3：
一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，具体操作步骤为：
1）纯种微藻的获取：将猪场污水稀释为原来的5倍，光照摇床培养，光照强度3000lux，温度为25℃，摇床培养7d。在污水颜色变为绿色后，转接液体培养基培养7d，用固体培养基划线分离，光照条件下培养10d后挑选形态有明显差异的单藻群落。将挑选的单藻群落分别接种到液体培养基中摇瓶培养至培养液变成深绿色，划线纯化分离，进行二次纯化，最后接种到无菌液体培养基中获得纯种微藻。液体培养基成分及其浓度：NaNO3 16.0g/100mLdH2O、K2HPO44g/100mLdH2O、MgSO4·7H2O、7.5g/100mLdH2O 、CaCl2·2H2O3.6g/100mLdH2O、柠檬酸0.7g/100mLdH2O、AA0.003g/100mldH2O 、TPP0.0015g/100mldH2O、柠檬酸铁胺0.6g/100mldH2O、 EDTANa2 0.1g/100mldH2O 、Na2CO3 2.0g/100mldH2O 、微量元素溶液 A51ml/L、葡萄糖35g/LdH2O 、低聚果糖12g/LdH2O 、H3BO3 2.65g/LdH2O、 MnCl2·4H2O1.86g/LdH2O、ZnSO4·7H2O0.22g/LdH2O 、Na2MoO4·2H2O0.021g/LdH2O 、CuSO4·5H2O 0.08g/LdH2O 、Co(NO3)2·6H2O 0.05g/LdH2O 。固体培养基为液体培养基中加入0.98%琼脂制得；
2）曝气培养：将获得的四株纯种微藻编号并接种到液体培养基和氨氮浓度为100mg/L的稀释畜禽污水中培养，培养条件均为3000lux，25℃，曝气培养，初始OD680为0.1。培养8d后3号微藻对畜禽污水污染物降解效率最高，氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD去除率分别为98.1%、98.7%、97.5%、99.87%和58%。污水色度明显降低，450nm吸光值从0.358降至0.095，主要因为微藻在凝集成团后对悬浮物具有一定的吸附作用。培养15d后生物量分别达到1.7，1.7，2.1，0.71g/L，单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的为3号微藻，分别为45%和48%；
3）微藻品种及性质鉴定：挑选曝气培养后单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的纯种微藻，对其进行16srDNA鉴定，与Chlorella sorokiniana 序列相似度最高。该小球藻显微镜下程圆形，直径5~6.5um左右，密度大，易沉降。在筛选出的四株微藻中沉降速率最快，相同吸光度（680nm）生物量最高，通过重力沉降辅助以粗过滤就可以实现固液分离，上清液中不会悬浮有藻类，可以极大简化微藻分离步骤，节约成本。
实施例4：
生物量测定：在680nm处测实施例1中四种微藻液的OD值，同时显微计数，小于10μm的微藻，用血球计数板计数，大于10μm的藻用0.1mL浮游植物计数框计数细胞密度（至少计数3次）。以OD值对细胞密度作图，求其吸光系数。然后利用公式（lg（m）=-1.0465ln（x）+4.255，其中，m为生物量，x为吸光系数）将吸光系数转化为生物量。测定结果如图3~6所示，在相同吸光度下3号微藻的生物量积累最多。按上述方法测定实施例1中3号微藻在不同时间段的生物量，测定结果如图7所示。3号微藻的生物量积累速度快，在培养15d时生物量高达1.8g/L。
粗蛋白含量测定：采用微量凯式定氮法测定实施例1中四种微藻中粗蛋白含量，测定结果如图8所示，单位生物量粗蛋白积累最高的为3号微藻，为34%。
油脂含量测定：采用苏丹黑 B 染色法测定实施例1中四种微藻中油脂含量，测定结果如图9所示，单位油脂积累含量最高的3号微藻，为36%。
氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD含量测定：参照国家标准《水质氨氮的测定流动注射-水杨酸分光光度法 》（HJ 666-2013)，测定实施例1中培养3号微藻的污水中氨氮含量；参照国家标准《水质总氮的测定流动注射-盐酸萘乙二胺分光光度法 》（HJ 668-2013)，测定实施例1中培养3号微藻的污水中总氮含量；参照国家标准《水质.亚硝氮和硝态氮以及通过通量分析(CFA和FIA)的测定.光谱测定》（NF T90-012-1996（R2002）），测定实施例1中培养3号微藻的污水中硝态氮含量；参照国家标准《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》（GB/T11893-1989），测定实施例1中培养3号微藻的污水中总磷含量；参照国家标准《化学需氧量(COD)测定仪》（GB/T 32208-2015），测定实施例1中培养3号微藻的污水中COD值。上述氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD含量测定时均设有不培养微藻的污水的对照组，排除污水的自净作用，测定结果如图10~14所示，培养8d后3号微藻对畜禽污水污染物降解效率高，氨氮、总氮、硝态氮、总磷、COD去除率分别为96%、97%、95%、99%和46%。
污水色度测定：参照国家标准《水质色度的测定 》（GB/T 11903-1989），测定实施例1中培养3号微藻的污水450nm处吸光值。测定结果如图15所示，污水色度明显降低，450nm吸光值从0.345降至0.119，主要因为微藻在凝集成团后对悬浮物具有一定的吸附作用。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1734
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
aggtctgtta gattagccat gcatgtctaa gtataaactg ctttatactg tgaaactgcg 60
aatggctcat taaatcagtt atagtttatt tgatggtacc tactactcgg atacccgtag 120
taaatctaga gctaatacgt gcgtaaatcc cgacttctgg aagggacgta tttattagat 180
aaaagaccga ccgggcttgc ccgactcgcg gtgaatcatg ataacttcac gaatcgcatg 240
gcctcgtgcc ggcgatgttt cattcaaatt tctgccctat caactttcga tggtaggata 300
gaggcctacc atggtggtaa cgggtgacgg aggattaggg ttcgattccg gagagggagc 360
ctgagaaacg gctaccacat ccaaggaagg cagcaggcgc gcaaattacc caatcctgac 420
acagggaggt agtgacaata aataacaata ctgggccttt tcaggtctgg taattggaat 480
gagtacaatc taaacccctt aacgaggatc aattggaggg caagtctggt gccagcagcc 540
gcggtaattc cagctccaat agcgtatatt taagttgctg cagttaaaaa gctcgtagtt 600
ggatttcggg tggggcctgc cggtccgccg tttcggtgtg cactggcagg gcccaccttg 660
ttgccgggga cgggctcctg ggcttcactg tccgggactc ggagtcggcg ctgttacttt 720
gagtaaatta gagtgttcaa agcaggccta cgctctgaat acattagcat ggaataacac 780
gataggactc tggcctatcc tgttggtctg taggaccgga gtaatgatta agagggacag 840
tcgggggcat tcgtatttca ttgtcagagg tgaaattctt ggatttatga aagacgaact 900
actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc attaatcaag aacgaaagtt gggggctcga 960
agacgattag ataccgtcct agtctcaacc ataaacgatg ccgactaggg atcggcggat 1020
gtttcttcga tgactccgcc ggcaccttat gagaaatcaa agtttttggg ttccgggggg 1080
agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc aggcgtggag 1140
cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag gtccagacat agtgaggatt 1200
gacagattga gagctctttc ttgattctat gggtggtggt gcatggccgt tcttagttgg 1260
tgggttgcct tgtcaggttg attccggtaa cgaacgagac ctcagcctgc taaatagtca 1320
cggttggctc gccagccggc ggacttctta gagggactat tggcgactag ccaatggaag 1380
catgaggcaa taacaggtct gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac 1440
tgatgcattc aacgagccta gccttggccg agaggcccgg gtaatctttg aaactgcatc 1500
gtgatgggga tagattattg caattattaa tcttcaacga ggaatgccta gtaagcgcaa 1560
gtcatcagct tgcgttgatt acgtccctgc cctttgtaca caccgcccgt cgctcctacc 1620
gattgggtgt gctggtgaag tgttcggatt ggcgaccggg ggcggtctcc gctctcggcc 1680
gccgagaagt tcattaaacc ctcccaccta gagaagagaa gtcgagattc ccac 1734

Claims (9)

1.一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于筛选得到的微藻的保藏号为CCTCC M 2017461。
2.根据权利要求1所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的筛选步骤包括纯种微藻的获取、曝气培养、微藻品种及性质鉴定。
3.根据权利要求2所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的纯种微藻的获取步骤为：将猪场污水稀释光照摇床培养，转接液体培养基培养，固体培养基划线分离，光照条件下培养后挑选形态有明显差异的单藻群落，分别接种到液体培养基中摇瓶培养后再次划线纯化分离，最后接种到无菌液体培养基中获得纯种微藻。
4.根据权利要求2所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的猪场污水稀释为原来的4~6倍，光照强度2000~4000lux，温度为20~28℃，摇床培养5~9d。
5.根据权利要求2所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的第一次划线分离后在光照下培养8~12d，挑选形态有明显差异的单藻群落，分别接种到液体培养基中，摇瓶至培养液变成深绿色，再次划线纯化分离。
6.根据权利要求2所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的曝气培养步骤为：将获得的纯种微藻接种到液体培养基和氨氮浓度为80~120mg/L的稀释畜禽污水中培养，培养条件为2000~4000lux，20~30℃，曝气培养，培养6~10d后测定畜禽污水污染物降解率及污水的吸光度；培养12~18d后测其生物量、单位生物量粗蛋白和油脂积累含量。
7.根据权利要求2所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的微藻品种及性质鉴定步骤为：挑选曝气培养后单位生物量粗蛋白和油脂积累含量最高的纯种微藻，对其进行16srDNA鉴定，确定微藻种类，并观察其微观形态。
8.根据权利要求2所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的液体培养基包括以下成分及其浓度： NaNO3 12~18g/100mLdH2O、K2HPO41~8g/100mLdH2O、MgSO4·7H2O6.5~8.5g/100mLdH2O 、CaCl2·2H2O3.0~4.0g/100mLdH2O、柠檬酸0.4~0.8g/100mLdH2O、AA0.002~0.003g/100mldH2O、TPP0.0010~0.0018g/100mldH2O、柠檬酸铁胺0.4~0.8g/100mldH2O、 EDTANa2 0.08~0.12g/100mldH2O、 NaCO31.5~2.5g/100mldH2O、微量元素溶液A50.6~1.5ml/L、H3BO3 2.50~3.00g/LdH2O、MnCl2·4H2O1.75~1.95g/LdH2O、ZnSO4·7H2O0.18~0.28g/LdH2O、Na2MoO4·2H2O0.018~0.025g/LdH2O、CuSO4·5H2O0.06~0.10g/L dH2O、Co(NO3)2·6H2O0.04~0.06g/LdH2O。
9.根据权利要求3所述的一株可高效处理猪场畜禽污水并资源化利用的微藻的筛选，其特征在于：所述的固体培养基为液体培养基中加入0.9~1.1%琼脂制得。
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