CN109234167B - 一种小球藻及其在沼液净化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小球藻，其保藏编号为CGMCC NO.15496。本发明还提出所述的小球藻的应用，应用于沼液的净化。本发明提出的的小球藻，在适宜的培养条件下，可在猪粪沼液中生长，利用猪粪沼液中的污染物氨氮作为自身生长氮源，利用猪粪沼液中的污染物总磷作为自身生长磷源，对猪粪沼液起到脱氮除磷的净化作用。与其他商业藻种库购买的小球藻藻株相比，所述的小球藻无论是在生物量的积累上还是在对猪粪沼液脱氮除磷的效果上都具有明显优势。

Description

一种小球藻及其在沼液净化中的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种小球藻及其应用。

背景技术

近年来,随着世界范围内畜禽养殖业集约化生产的迅猛发展,畜禽粪污的污染问题也日益严重，联合国粮农组织已把集约化畜禽养殖列为世界环境问题三大污染源之一。利用沼气工程技术处理禽畜废弃物既可治理污染,又能实现废弃物资源化利用，能够收获能源、环保和经济等多重效益，符合人类社会可持续发展的理念。但是,大中型沼气工程的发展本身也面临着诸多环境问题，这其中畜禽粪污厌氧发酵后产生的沼液如何处理利用的问题尤为显著。大中型沼气工程每天产生的沼液量十分可观，只经过厌氧处理的沼液，其中仍含有大量的氮、磷等营养成分,直接排入水体易引起富营养化,造成二次污染。同时，大多数大中型沼气工程多数建在市郊,沼液的就地消纳有一定的难度，且一次性消纳远超过农作物施肥的一般规律，若远距离输送,又存在能耗大、成本高的问题。因此,如何就地对沼液进行低成本的、深度的处理,是发展大中型沼气工程亟待解决的主要问题之一。

沼液是厌氧发酵后残留的液体，主要包括发酵过程中分解释放的有机、无机盐类，如铵盐、钾盐、磷酸盐等可溶性物质，总固体含量小于1％。与沼渣相比，沼液中的养分主要是速效性养分，据研究显示，畜禽粪污沼液中不仅含有丰富的氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰等中微量元素，还含有吲哚乙酸、细胞分裂素、赤霉素等植物生长调节物质以及喹啉酮、糖类、维生素、多胺等生物活性成分，因此，沼液虽然本身是一种废水，但是如果合理加以利用，它也是一种营养成分十分丰富的资源。

微藻是一种可快速生长繁殖的光合自养水生微生物，它光合效率高，细胞结构简单，适应环境的能力强，对环境中营养元素利用率高，且培养微藻不需要占用耕地面积。微藻生物质既可以作为生物燃油、生物天然色素(类胡萝卜素、虾青素、藻蓝蛋白等)的提炼原料，又可以加工成人类的保健食品和动物饲料、水产饵料，还能够用作有机缓释肥施于土壤中促进作物生长，因而是一种附加值高、用途广泛的微生物原料。人工培养微藻需要含有充足的碳、氮、磷等营养元素的液体培养基，而一些有机废水中的营养成分与微藻培养基类似，因而利用废水培养微藻迅速成为了微藻生物技术研究中的热点。微藻培养除了需要大量的营养盐以外，还需要消耗大量的水资源，微藻培养基的成本占到微藻培养总成本的30％-60％。利用废水培养微藻，微藻可以吸收废水中的碳、氮、磷等营养元素促进自身生长，在此过程中对废水起到净化的作用。

利用微藻净化畜禽沼液，其中一项重要的技术难点在于，寻找针对特定沼液具有良好耐受性的微藻藻株，该藻株可以在一定浓度范围内的特定沼液中生长，摄取沼液中的氮磷污染物作为自身的营养源，并对沼液中的氨氮、病原微生物、养殖饲料药物残留等有毒有害的物质具有耐受性。

发明内容

针对上述背景中提到的问题，本发明从被猪粪沼液污染过的土壤环境中分离、纯化而获得一株野生微藻，该株微藻可以在猪粪沼液中生长，并摄取猪粪沼液中的氮磷等污染物作为自身的氮磷营养源以促进藻体细胞生长，同时能够对猪粪沼液起到良好净化的作用。同时，对猪粪沼液中的有毒有害物质具有一定的耐受性。即，本发明的第一个目的是提出一种小球藻。

本发明的第二个目的是提出所述小球藻的应用。

实现本发明上述目的技术方案为：

一种小球藻(Chlorella sp.)，保藏编号为CGMCC NO.15496。

所述的小球藻菌株，于2018年3月29日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

进一步地，所述小球藻对氨氮浓度在10～300mg/L的污水具有耐受性。

本发明还提出所述的小球藻的应用，其应用于沼液的净化。

应用所述的小球藻净化沼液的方法，包括：

以干重0.02～0.2g/L的接种量所述小球藻的菌种接种于沼液中，所述沼液的COD为100～600mg/L，氨氮为10～300mg/L，总磷为0～50mg/L，悬浮固体为0～500mg/L，pH值为7～8.5。

接种量中，g是指微藻的干重，用烘干比重法可测得；L是指微藻的培养体积，液体成分主要是沼液，由于小球藻的细胞直径在微米尺度级别，因此在宏观计算培养接种量时，微藻细胞可视作固体颗粒。

利用微藻净化沼液，要求COD和悬浮固体的浓度不能大到对微藻具有毒害的程度，特别是悬浮固体，原始沼液的浓度太高，颜色呈黑褐色，会严重影响微藻光合作用的受光。可采用已有的预处理方式，使悬浮物降到光可以透进去的程度。

进一步地，用生长有所述小球藻的液体培养基接种，以0.05～0.09g/L的接种量，将所述小球藻的菌种接种于沼液中。如果是在人工培养基中对微藻进行纯培养，那么为了尽量获得多的生物量，接种量在0.04～0.07g/L左右即可。但是如果将培养的微藻用于净化沼液，也就是污水培养，那么考虑到污水中的复杂成分可能抑制微藻生长，为了保证微藻可以存活，在接种时应适当提高接种量。当然，接种量也不是越大越好，过大的接种量会使细胞之间互相遮蔽而降低光合效率，所以我们进行多次实验后确定的一个优化值在0.07～0.1g/L左右。

其中，将所述小球藻在BG11液体培养基中培养至对数生长期，接种于沼液中。

其中，所述小球藻的菌种培养条件为：温度24～30℃，pH值为7～7.5。

其中，所述小球藻在液体培养基里培养时，光照强度为100～200μmol/m²/s，光周期为光暗比(12～20)：(4～12)；和/或，每天摇动培养容器3～4次。

本发明的一种优选技术方案为，包括步骤：

1)猪粪沼液经过预处理，达到COD 100～600mg/L，氨氮10～300mg/L，总磷0～50mg/L，悬浮固体0～500mg/L，pH值为7～8.5的条件；

2)加入小球藻的菌种进行培养，培养的条件为：光照强度为100～200μmol/㎡/s，光周期为光暗比(12～20)：(4～12)，温度为24～28℃。

更优选地，步骤2)培养的条件为：光照强度为130～150μmol/m²/s，光周期为光暗比19:5，温度为26±0.5℃。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的保藏编号为CGMCC NO.15496的小球藻，其在适宜的培养条件下，可在猪粪沼液中生长，利用猪粪沼液中的污染物氨氮作为自身生长氮源，利用猪粪沼液中的污染物总磷作为自身生长磷源，对猪粪沼液起到脱氮除磷的净化作用。与其他商业藻种库购买的小球藻藻株相比，所述保藏编号为CGMCC NO.15496的小球藻无论是在生物量的积累上还是在对猪粪沼液脱氮除磷的效果上都具有明显优势。

附图说明

图1为本发明小球藻藻株CGMCC NO.15496在光学显微镜下的细胞形态(目镜10倍×物镜40倍)。

图2为本发明中基于小球藻藻株CGMCC NO.15496构建的系统发育树。

图3为本发明分离纯化获得的小球藻藻株CGMCC NO.15496与另外两株从商业藻种库随机购买的蛋白核小球藻FACHB-05和普通小球藻FACHB-24两株微藻在猪粪沼液中21天内的生长对比图。

图4为本发明分离纯化获得的小球藻藻株CGMCC NO.15496与另外两株从商业藻种库随机购买的蛋白核小球藻FACHB-05和普通小球藻FACHB-24在猪粪沼液中21天内对氨氮去除的对比。

图5为本发明分离纯化获得的小球藻藻株CGMCC NO.15496与另外两株从商业藻种库随机购买的蛋白核小球藻FACHB-05和普通小球藻FACHB-24在猪粪沼液中21天内对总磷去除的对比。

具体实施方式

下面通过最佳实施例来说明本发明。本领域技术人员所应知的是，实施例只用来说明本发明而不是用来限制本发明的范围。

实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。

实施例1：藻株的分离、纯化

(1)样品采集

本发明所涉及的藻株是从北京市平谷区大兴庄镇西柏店村沼气服务站内经猪粪厌氧消化沼液污染过的土壤中取样分离得到的。从选定地点土壤表层采集土样，置于密封袋中，放在4℃冰箱内保存备用。

(2)藻株分离、纯化及藻株培养

取约0.5g土壤样品于24孔组织培养皿中，并加入BG11液体培养基(BG11培养基具体组成如表1所示)置于环境参数可调节的光照培养箱中进行藻种富集培养，培养3-4天后，培养基颜色可以明显看到由无色变为淡绿色。然后在BG11固体平板培养基(经灭菌处理的BG11液体培养基加入1.5％-2％的琼脂粉制备而得)上利用平板划线法进行分离纯化，直至平板中藻落单一，然后挑取无菌的单藻落接种到液体BG11培养基中，置于光照培养箱中培养。用光学显微镜观察经培养后的微藻藻株是否细胞形态一致，若一致则达到分离的目的，若不一致则重复平板划线的工作，直至细胞形态单一。

藻株培养阶段所使用的培养容器为100mL锥形瓶(有效培养体积为50mL)，BG11液体培养基，培养条件为温度28±0.5℃，光照强度150μmol/m²/s，光照周期12:12，每天人工摇瓶三次。

表1 BG11培养基配方及用量

实施例2藻株最适培养条件研究

在获得足够生物量的上述微藻藻种后，为探究其适宜的培养条件，本发明对光照强度、光周期、温度、接种量四个微藻培养常见的技术参数进行了单因素试验—正交试验—响应面试验等一系列优化研究，各参数取值范围为：光照强度：50μmol/m²/s～250μmol/m²/s；光周期：(12～20)/(4～12)；温度：20℃-30℃；接种量：0.04～0.15g/L。

最终得到该株微藻的最适宜培养条件为光照强度为140μmol/m²/s，光周期为19:5(光:暗)，温度为26±0.5℃，接种量为0.058g/L该阶段使用的培养容器为250mL锥形瓶(有效培养体积为150mL)，BG11液体培养基，置于环境参数可调的光照培养箱内，每天人工摇瓶三次。

实验例：藻株的鉴定和保藏

藻株的鉴定分两个步骤进行，首先进行形态学初步观察，然后再进行分子生物学鉴定。使用光学显微镜对分离纯化的微藻藻株进行观察并照相(10倍目镜×40倍物镜)。观察该藻株的细胞形态、大小、结构等特征。光学显微镜观察下的藻株形态如图1所示。

本发明分离纯化获得的这株微藻，在显微镜下观察，藻体呈绿色，为单细胞群体，细胞呈椭圆形。对藻株行分子生物学鉴定，以提取的DNA为模板，使用DNAMAN和Primer 5.0软件设计引物，(引物序正向5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，反向5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。对ITS基因进行PCR扩增，建立PCR反应体系均为50μL。其中DNA模板1μL，正反引物各1μL，dNTP 4μL，5×Q5反应缓冲溶液10μL，Q5DNA聚合酶0.5μL，5×Q5High GC Enhancer 10μL。ITS基因PCR扩增程序为：94℃预变性30s，然后98℃变性5s，52℃退火30s，68℃延伸75s，共30个循环，最后68℃延伸5min。该过程委托北京艾普希隆生物科技有限公司测序。将所得序列在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLAST进行同源检测，跟藻种库中已有藻种基因进行比对，最后确定其种属。对藻株进行PCR扩增后，得到ITS的片段。测序后得到其ITS片段的长度为765bp。将此序列与NCBI数据库进行同源性分析，发现其与小球藻(Chlorella sp.)的亲缘关系最近，同源性达到99％。使用MEGA5.10对ITS序列构建系统发育树，结果如图2所示。

藻株的保藏

上述经分离纯化获得并鉴定的小球藻藻株，于2018年3月29日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.15496。

为探究上述分离、纯化、保藏的小球藻藻株CGMCC NO.15496在净化猪粪沼液方面的潜力，本发明开展了利用真实猪粪沼液培养小球藻藻株CGMCC NO.15496的试验研究。在下面示出的试验研究中，除了本发明所述的小球藻CGMCC NO.15496藻株外，还研究了另外两株从商业藻种库随机选择购买的小球藻藻株净化猪粪沼液的能力及其在猪粪沼液中的生长状况，以期与本发明所述的藻株进行对比。

下面的试验中，所有试验组均设置三个重复。

实施例3应用小球藻藻株CGMCC NO.15496净化猪粪沼液

(1)试验材料

本试验所用猪粪沼液取自北京市平谷区大兴庄镇西柏店村沼气服务站沼液储存罐内，该储存罐中的原沼液中含有较高浓度的氨氮(＞900mg/L)和大量的悬浮固体(700-800mg/L)，对原沼液进行了絮凝—气浮的预处理，使得氨氮浓度和悬浮固体浓度降到微藻能够耐受的程度。经过预处理的猪粪沼液的水质如表2所示。

表2经预处理后的猪粪沼液水质

本实施例用的藻株为上述的本发明分离、纯化的小球藻藻株CGMCC NO.15496，采用实施例2提出的最适宜培养条件，在BG11培养基中培养至对数生长期后用于本试验研究。

(2)试验方法

处于对数生长期的微藻投加到250mL锥形瓶(有效培养体积150mL)中并添加经预处理后的猪粪沼液作为微藻培养基，置于环境参数可调的光照培养箱中培养，具体培养条件为:接种量0.089g/L，光照强度140μmol/㎡/s，光周期16:8(光:暗)，温度26±0.5℃。共培养21天。

对比例1

作为对比，本菌株为从中国科学院武汉水生所淡水藻种库随机选择购买的蛋白核小球藻藻株FACHB-05，采用和实施例3同样的条件在BG11培养基中培养至对数生长期后用于本试验研究。

对比例2

作为对比，本菌株为从中国科学院武汉水生所淡水藻种库随机选择购买的普通小球藻藻株FACHB-24。采用和实施例3同样的条件在BG11培养基中培养至对数生长期后用于本试验研究。

所有试验组共培养21天，每天人工摇瓶三次，每天取样6mL测定生物量及水质。

试验结果

实施例3、对比例的三株微藻在猪粪沼液中的生长状况如图3所示。21天的培养时间内，三株微藻均能够在猪粪沼液中不同程度地生长，其中，小球藻藻株CGMCC NO.15496在猪粪沼液中的生长效果最好，第21天生物量可达到0.691g/L；普通小球藻藻株FACHB-24其次，第21天生物量可达到0.595g/L；蛋白核小球藻藻株FACHB-05的生长情况最差，第21天的生物量为0.436g/L。试验结果表明，与商业藻种库随机选择购买的小球藻藻株相比，本发明分离纯化获得的小球藻藻株在猪粪沼液中的耐受性最好，积累生物质的能力也最强。

猪粪沼液中氨氮的变化如图4所示。21天的培养时间内，三株微藻均能够对猪粪沼液中的氨氮进行不同程度的摄取去除。其中，小球藻藻株CGMCC NO.15496对猪粪沼液中氨氮的去除能力最强，21天氨氮的去除率可达99.90％；普通小球藻藻株FACHB-24其次，21天氨氮的去除率为90.04％；蛋白核小球藻藻株FACHB-05对氨氮的去除能力最差，21天的去除率仅为58.19％。

猪粪沼液中总磷的变化如图5所示。21天的培养时间内，小球藻藻株CGMCCNO.15496对猪粪沼液中总磷的去除率为100％，普通小球藻藻株FACHB-24对总磷的去除率为91.60％，蛋白核小球藻藻株FACHB-05对总磷的去除率仅为67.51％。

综上所述，本发明分离、纯化获得的小球藻藻株CGMCC NO.15496对一定浓度的猪粪沼液具有良好的耐受性，利用猪粪沼液培养该株微藻，可以对猪粪沼液起到良好的净化作用，脱氮除磷的效果显著。与商业藻种库随机购买的两株小球藻相比，本发明涉及的这种从自然环境中分离的野生藻株，在猪粪沼液中的生长能力更好，因而是一种处理猪粪沼液的理想微生物材料，具有广阔的应用前景。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种小球藻及其在沼液净化中的应用

<130> KHP181115745.3

<141> 2018-09-05

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一种小球藻（Chlorella sp.），其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.15496。

2.权利要求1所述的小球藻的应用，其特征在于，应用于沼液的净化。

3.应用权利要求1所述的小球藻净化沼液的方法，其特征在于，包括：

以干重0.02~0.2 g/L的接种量将所述小球藻的菌种接种于沼液中，所述沼液的COD为100~600mg/L，氨氮为10~300mg/L，总磷为0~50mg/L，悬浮固体为0~500mg/L，pH值为7.0~8.5。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用生长有所述小球藻的液体培养基接种，以干重0.05~0.09g/L的接种量，将所述小球藻的菌种接种于沼液中。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述小球藻在BG11 液体培养基中培养至对数生长期，接种于沼液中。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小球藻的菌种培养条件为：温度20~30℃，pH值为7~7.5。

7.根据权利要求4~6任一项所述的方法，其特征在于，所述小球藻在液体培养基里培养时，光照强度为50~250 μmol/m²/s，光周期为光暗比（12~20）：（4~12）；和/或，每天摇动培养容器3~4次。

8.根据权利要求3~6任一项所述的方法，其特征在于，包括步骤：

1）猪粪沼液经过预处理，达到COD 100~600mg/L，氨氮10~300mg/L，总磷0~50mg/L，悬浮固体0~500mg/L，pH值为7~8.5的条件；

2）加入小球藻的菌种进行培养，培养的条件为：光照强度为100~200 μmol/m²/s，光周期为光暗比（12~20）：（4~12），温度为24~28℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)培养的条件为：光照强度为130~150μmol/ m²/s，光周期为光暗比19:5，温度为26±0.5℃。

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