CN115161201A - 一种栅列藻藻株及其培养方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种栅列藻Desmodesmus communis藻株YYAW001，以保藏号CGMCC No.24296保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为2022年4月6日。本发明还提供培养栅列藻YYAW001的方法、藻粉的制备方法及其应用。本发明提供的栅列藻YYAW001，具有生长速度快，细胞中蛋白质含量高等优点，可用于制备生物油脂、生物柴油、藻类蛋白、天然色素和家禽、鱼虾类等的养殖饲料。

Description

一种栅列藻藻株及其培养方法和用途

技术领域

本发明属于微生物和生物能源技术领域，尤其涉及一种栅列藻藻株及其培养方法和用途。

背景技术

有限的化石燃料储量持续燃烧导致的全球变暖是人类面临的重大挑战之一。二氧化碳(CO₂)等温室气体的排放无疑是导致全球变暖的主要因素之一。

微藻是一种光合微生物，能够吸收二氧化碳并产生有价值的生物活性分子，如色素和脂肪酸。这些生物活性分子被用于许多领域，如化妆品、农业、制药工业、食品和饲料，以及废水处理。由于微藻拥有巨大的经济价值潜力，微藻培养、藻株分离和各种生物活性分子的分离变得具有重要意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供了一种栅列藻藻株及其培养方法和用途。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种栅列藻Desmodesmus communis藻株 YYAW001，以保藏号CGMCC No.24296保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

第二方面，本发明提供一种培养栅列藻的方法，包括：将如上所述的栅列藻藻株接种于培养基中，并在温度为16-30℃，连续光照强度为 5～200μmol·m^-2·s^-1，pH值为6.5-9，以及通入CO₂的条件下培养。

可选地，以1～1×10⁵个细胞/mL的接种密度将栅列藻藻株接种于培养基中；培养基为BG11培养基、BBM培养基、MCM培养基和TAP培养基中的一种，培养周期为5-10天。

可选地，培养过程中，温度为20-25℃，连续光照强度为20～50μmol·m^-2·s^-1，pH值为7-8。

可选地，培养基为BG11培养基；BG11培养基中的N源包括1.3～1.7 g/L的NaNO₃。

第三方面，提供本发明的栅列藻藻株YYAW001在生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、天然色素或生物质中的应用。

第四方面，提供本发明的栅列藻藻株YYAW001在水质净化中的应用。

第五方面，本发明提供一种制备栅列藻藻粉的方法，包括：

S1、对本发明的栅列藻藻株YYAW001进行自养培养，获得种子液。

S2、将种子液接种到光生物反应器中进行扩大培养。

S3、收集扩大培养的细胞，获得栅列藻藻泥；对栅列藻藻泥进行干燥，获得栅列藻藻粉。

作为制备栅列藻藻粉方法的一种改进，S1中，使用如上所述的培养栅列藻的方法对栅列藻藻株YYAW001进行扩大化培养。

作为制备栅列藻藻粉方法的一种改进，S2中，将种子液接种到光生物反应器中，在温度24-30℃，连续光照强度50～500μmol·m^-2·s^-1，pH值 6.5-9的条件下进行通入CO₂培养。通入CO₂包括依次进行的两个阶段；第一阶段CO₂的通入量为0.5vvm，时间为3-5天；第二阶段CO₂的通入量为1.0vvm，时间为5-10天。

第六方面，本发明提供将上述制备方法获得的栅列藻藻粉在食品、保健品或药品中的应用。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

1、本发明提出的栅列藻Desmodesmus communis藻株YYAW001，能够从中分离生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、天然色素和生物质，并且栅列藻藻株YYAW001经自养培养生产后的栅列藻藻泥还能够用作食品、保健品或药品的原料，应用潜力巨大。

2、本发明提出的栅列藻藻株YYAW001，可在较短周期内生长达到平台期，能够快速积累大量生物质，因此在生产一定质量生物质的情况下，缩短培养周期，提高生产效率，降低生产成本。

3、本发明提出的栅列藻藻株YYAW001，蛋白质含量高，可达到 60.91％，培养周期5-10天，培养周期短。

4、本发明提出的栅列藻藻株YYAW001可高效利用二氧化碳，进而可利用栅列藻藻株YYAW001实现碳固定，同时也用于水质净化。

附图说明

图1为根据本发明实施例2的扩增序列与NCBI数据库的比对结果示意图；

图2为根据本发明实施例2的YYAW001的18S rDNA的系统发育树；

图3为根据本发明实施例3的YYAW001的生长曲线示意图；

图4为根据本发明实施例4的YYAW001的形态示意图；

图5为根据本发明实施例6的不同培养基培养下的藻粉干重结果示意图；

图6为根据本发明实施例6的不同培养基培养的藻液中叶绿素的含量结果示意图；

图7为根据本发明实施例7的不同N源BG-11培养基培养下的 YYAW001的生长曲线示意图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

栅列藻又称栅列藻Desmodesmus communis，栅列藻属于绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，栅列藻科，栅列藻属。

本发明从自然水体中分离出一种微藻，经形态学分析和生化分析，初步鉴定该株微藻为栅列藻属。通过18S rDNA序列分析，进一步鉴定该株微藻为栅列藻，命名为YYAW001。

因此，在第一方面，本发明提供一种栅列藻藻株YYAW001，以保藏号CGMCCNo.24296于2022年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所)。

在第二方面，本发明还提供用于培养栅列藻藻株YYAW001的方法。

在一些实施方式中，将栅列藻藻株YYAW001接种于培养基中，并在温度为16～30℃，连续光照强度为5～200μmol·m^-2·s^-1，pH值为6.5-9，以及通入CO₂的条件下培养。

优选地，培养在温度为20-25℃，连续光照强度为20～50μmol·m^-2·s^-1， pH值为7-8的条件下进行。

在一些实施方式中，以1～1×10⁵个细胞/mL的接种密度将栅列藻藻株接种于培养基中。优选地，以1×10⁵个细胞/mL的接种密度将栅列藻藻株接种于培养基中。

在一些实施方式中，培养基为BG11培养基、BBM培养基、MCM培养基和TAP培养基中的一种。优选地，培养基为BG11培养基。进一步优选地，培养基为BG11培养基，BG11培养基中的N源包括1.3～1.7g/L 的NaNO₃。

在一些实施方式中，培养结束后收集细胞。在一些实施方式中，从所收集的细胞中分离油脂。在一些实施方式中，从所收集的细胞中分离生物柴油。在一些实施方式中，从所收集的细胞中分离藻类蛋白。在一些实施方式中，从所收集的细胞中分离天然色素。在一些实施方式中，从所收集的细胞中分离生物质。

由于本发明提供的栅列藻藻株YYAW001可高效利用二氧化碳，进而可利用栅列藻藻株YYAW001实现碳固定，在第三方面，提供本发明的栅列藻藻株YYAW001在水质净化中的应用。

在第四方面，本发明还提供制备栅列藻藻粉的方法。

在一些实施方式中，将本发明的栅列藻藻株YYAW001进行自养培养，获得种子液；然后将种子液接种到柱状光生物反应器中进行扩大培养；最后收集扩大培养的细胞，获得栅列藻藻泥，对栅列藻藻泥进行干燥，获得栅列藻藻粉。

其中，采用本发明提供的培养栅列藻藻株的方法对栅列藻藻株 YYAW001进行自养培养，以获得种子液。

在一些实施方式中，将种子液接种到光生物反应器中，在温度24- 30℃，连续光照强度50～500μmol·m^-2·s^-1，pH值6.5-9的条件下进行通入 CO₂培养，实现扩大培养。其中，通入CO₂包括依次进行的两个阶段；第一阶段CO₂的通入量为0.3～0.6vvm，时间为3-5天；第二阶段CO₂的通入量为0.9～1.2vvm，时间为5-10天。优选地，第一阶段CO₂的通入量为0.5vvm，第二阶段CO₂的通入量为1.0vvm。

在一些实施方式中，通过离心或膜过滤的方式收集扩大培养后的细胞。在一些实施方式中，通过热风干燥、喷雾干燥或者真空冷冻干燥对栅列藻藻泥进行干燥。

在第五方面，提供本发明制备的栅列藻藻粉在食品、保健品或药品中的应用。

以下通过实施例来更好地阐述本发明，而非意在限定本发明的范围。如无特殊说明，下列实施例中的实验方法均为常规方法。如无特殊说明，下列实施例中所用的试验材料均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1.栅列藻藻株YYAW001的分离和纯化

收集来自野外湖泊的水样，对水样进行离心处理以富集水样中的藻，获得藻样；将藻样制片，在显微镜下观察藻的形态，初步确定该藻的可能种属，并配置BG11培养基(平板+液体)。

取1-10mL水样，离心富集水样中的藻，用移液器吸去上清，留下约1mL水体；水体漩涡混匀后，取100uL水体涂布在平板上，进行涂布3- 6个，剩余水体则接种到15mlL液体培养基上；将平板和液体培养基均置于50μmol·m^-2·s^-1光照，25±0.5℃下培养。

其中，剩余水体接种液体培养基，以作为样品留存，以免平板未筛选到藻株时留有备份。

平板培养9天，观察到平板上有明显的微藻群落生长，将其接种到 50mL烧瓶用液体培养基进行培养。

在烧瓶用液体培养基培养至微藻稳定生长时，取5-10mL藻液，在 2500-4000rpm下离心富集藻；然后根据需求配置不同抗性的平板和液体培养基，使用培养基对富集的藻液进行洗涤，重复三次。

取1mL新鲜液体培养基重悬藻细胞(即步骤14中洗涤后获得的藻液)，然后进行梯度稀释到10^5倍，取100ul稀释10^5、10^4、10^3倍的藻液进行到相应的抗性平板进行涂布，每个浓度至少涂布3个，得到稀释10^6、10^5、10^4倍的涂布平板；50μmol·m^-2·s^-1光照，25±0.5℃下培养12天，观察到有单藻落生长。

挑取单藻落到100uL液体培养基中，再次进行梯度稀释至10^3倍，取10^3、10^2倍的稀释液进行涂布，获得10^4、10^3倍稀释的平板，置于50μmol·m^-2·s^-1光照，25±0.5℃下培养，培养10天，观察是单藻落。

将步骤16中的单藻落进行四分区平板划线培养，重复传代9次，直至获得纯化培养的单藻落。经过分离纯化获得2株微藻。

实施例2.微藻的鉴定

选取实施例1中的一株微藻于显微镜下观察微藻的形态，结合文献以及《中国淡水藻类-系统、分类及生态》对微藻进行初步分类鉴定，鉴定该株微藻为栅列藻属。之后对该株微藻进行18S rDNA测序鉴定分析，其中用于18S rDNA的扩增引物为：

F：GAAGTCGTAACAAGGTTTCC

R：TCCTGGTTAGTTTCTTTTCC

将扩增所得序列(如SEQ ID No.1所示序列)与NCBI数据库进行比对，如图1所示，比对结果显示，该株微藻为栅列藻(Desmodesmus communis)，即进一步鉴定该株微藻为栅列藻，并将其命名为栅列藻 YYAW001(Desmodesmus communis YYAW001)。

该栅列藻保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年4月6日，保藏登记号为CGMCC No.24296。

利用Mega-X软件进行栅列藻YYAW001的18S rDNA基因选定的序列进行比对并构建系统进化树，如图2所示。

实施例3.栅列藻YYAW001的生长曲线、保种和培养

配置BG-11培养基，并对BG-11培养基进行高温灭菌。

活化：将单藻落接种至50mL培养基中，于25℃，连续光照强度为 20μmol·m^-2·s^-1，pH值为7，光暗周期为14：10，以及通入CO₂的条件下培养5天，获得活化藻液。

保种：将活化藻液接种至3个平行的100mL液体培养基中，接种量为1×10⁵个细胞/mL；每天取样测定OD₆₈₀的吸光值，记录数据并绘制生长曲线，如图3所示。在实验室条件下，将上述YYAW001藻液以试管斜面或圆形平板培养基划线保存，所用培养基为BG-11，每1-2个月进行一次转接保种，保种的斜面培养温度在22℃，光暗比14：10。

培养：将活化藻液接种至100mL液体培养基中作为初始种子液，对初始种子液进行培养，当种子液细胞浓度达到10⁷个细胞/mL，接种10％种子液到1000mL灭菌培养基中进行种子液的扩培，进而获得扩大培养的种子液。以此方式扩大培养至所需要的一级种子液。

其中，BG-11培养基的成分包括：H₃BO₃：2.86mg/L，Co(NO₃)2·6H₂O： 0.05mg/L，ZnSO₄·H₂O：0.22mg/L，MnCl₂·4H₂O：1.86mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O：0.40mg/L，CuSO₄·5H₂O：0.05mg/L，MgSO₄·7H₂O： 7.5mg/L，CaCl₂·2H₂O：0.036g/L，NaNO₃：1.5g/L，K₂HPO：0.04g/L，EDTA-Na₂：0.001g/L，Na₂CO₃：0.02g/L，柠檬酸：0.006g/L，柠檬酸铁0.006g/L。

实施例4.栅列藻细胞形态的观察

配置BG-11培养基，并对BG-11培养基进行高温灭菌。将单藻落接种至50mL培养基中，于25℃，连续光照强度为20μmol·m^-2·s^-1，pH值为 7，光暗周期为14：10，以及通入CO₂的条件下培养5天。

然后取少量藻液进行制片，于显微镜下观察并拍照，测量大小。并与文献(UraniaLortou，2019；Fusun Akgul，2019)进行比较。

显微镜下观察到YYAW001细胞呈圆柱形、水滴形或梨形，长5-20μm，宽2-10μm；细胞呈单个、两个或四个并列排布，如图4所示。

通过以上实验，确认所分离纯化获得的藻株为一株栅列藻。

实施例5.栅列藻的扩大培养

将实施例3获得的种子液接种到柱式光生物反应器中，在温度26℃，连续光照强度400μmol·m^-2·s^-1，pH值8的条件下进行通入CO₂培养。通入CO₂包括依次进行的两个阶段；第一阶段CO₂的通入量为0.5vvm，时间为5天；第二阶段CO₂的通入量为1.0vvm，时间为10天。离心收集栅列藻藻泥，真空冷冻干燥栅列藻藻泥24h后获得YYAW001藻粉。

采用国标GB-5009.5-2016中的分光光度法分别对BG-11培养基、TAP培养基和BBM培养基培养的YYAW001藻粉进行蛋白质含量测定，结果如下表。

培养基	BG-11	TAP	BBM
				蛋白含量(％)	60.13	60.19	58.87

由上表结果可知，采用BG-11培养基有利于在栅列藻细胞中获得更高含量的蛋白质。

实施例6.不同培养基的培养效果比对

配置BG-11、TAP和BBM三种培养基，分装至250mL摇瓶，每瓶装100mL培养基，高温高压灭菌后，分别接种1×10⁵个细胞/mL，于光照培养箱静置培养，每天摇动两次。

在连续光照强度20μmol·m^-2·s^-1，光暗比14：10，温度25℃，以及通入CO₂的条件下培养10天，离心收集藻液。

将不同培养基培养的藻液在60℃烘干24h，称重，获得不同培养基培养下的藻粉干重，结果如图5所示。通过图可以看到，BG-11和TAP培养基培养下的藻粉，干重无显著差异，均为1.23g/L，高于BBM培养基培养下的藻粉干重(0.9833g/L)。同时测定了不同培养基培养的藻液中叶绿素的含量，结果如图6所示。通过图可以看到，BG-11和TAP培养基下培养的栅列藻的叶绿素含量高于BBM培养基下培养的栅列藻叶绿素含量，说明在BG-11、TAP培养基下栅列藻生长较快。

实施例7.培养基中N源的优化

分别配置N源不同的3种BG-11培养基，第一种BG-11培养基的N 源为NaNO₃，第二种BG-11培养基的N源为KNO₃，第三种BG-11培养基的N源为NH₄Cl。这3种BG-11培养基除N源外的其他成分相同， BG-11培养基的其他成分包括：H₃BO₃：2.86mg/L，Co(NO₃)₂·6H₂O： 0.05mg/L，ZnSO₄·H₂O：0.22mg/L，MnCl₂·4H₂O：1.86mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O：0.40mg/L，CuSO₄·5H₂O：0.05mg/L，MgSO₄·7H₂O： 7.5mg/L，CaCl₂·2H₂O：0.036g/L，K₂HPO：0.04g/L，EDTA-Na₂：0.001g/L，Na₂CO₃：0.02g/L，柠檬酸：0.006g/L，柠檬酸铁0.006g/L。

对这3种BG-11培养基进行高温高压灭菌后分装到250mL摇瓶，每个摇瓶100mL培养基，分别接种1×10⁵个细胞/mL，于光照培养箱静置培养，每天摇动两次。在连续光照强度20μmol·m^-2·s^-1，光暗比14：10，温度25℃的条件下培养10天。每天取样测定OD680，绘制生长曲线，如图7所示。

从图7可知，在生长前期，3种N源培养基培养下的栅列藻生长无显著差异，进入对数期后，以NaNO₃为N源的培养基，以KNO₃为N源的培养基培养下的栅列藻生长较以NH₄Cl为N源的培养基好，在平台期，以NaNO₃为N源的培养基培养下的栅列藻的生物量最高。由此认为NaNO₃为YYAW001的优选N源。优选浓度为1.5g/L。

实施例8

本实施例提供一种饲料，该饲料包括：实施例5生产的栅列藻粉1～6％，豆粕18～25％、熟豆粉13～16％、鱼粉10～15％、海带粉3～5％、面粉 12～18％、玉米粉8～10％，大豆分离蛋白2～6％、膨润土2～3％、水产酵母0.5～1％、鱼油1～2％、复合维生素0.5～1％、乳酸菌0.5～1％、鱿鱼膏0.2～0.5％、大豆油1-3％。将以上成分混合均匀后经过螺杆膨化机膨化制粒，后经干燥即得到饲料成品，该饲料成品可用于家禽、鱼类以及对虾等水产的养殖。

需要理解的是，以上对本发明的具体实施例进行的描述只是为了说明本发明的技术路线和特点，其目的在于让本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但本发明并不限于上述特定实施方式。凡是在本发明权利要求的范围内做出的各种变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 珠海元育生物科技有限公司

<120> 一种栅列藻藻株及其培养方法和用途

<130> EJS220564I

<141> 2022-05-26

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 647

<212> DNA

<213> Desmodesmus abundans

<400> 1

gggactgcgg agacttgata tgcaaaccac agcacgcact ctctacttgt gtaccgacgc 60

taggtcacac acgcaagtgt ggggcctatt tacaacttac acacaattga ccaaccatca 120

atcaaaccaa actctgaagc tatgactgct gttaatcggc agttctaaca aaaacaactc 180

tcaacaacgg atatcttggc tctcgcaacg atgaagaacg cagcgaaatg cgatacgtag 240

tgtgaattgc agaattccgt gaaccatcga atctttgaac gcatattgcg ctcgacccct 300

cggggaagag catgtctgcc tcagcgtcgg tttacaccct cacccctata tcactgttgt 360

gtccgttgga ccagcactgg ggtggatctg gcctcctcaa ttaaatcaat ttgattgggc 420

tggctgaagc acagaggctt aaactgggac ccgtatcggg ctcaactgga taggtagcaa 480

caccctcggg tgcctacacg aagttgtgtc tgtggacctg gttaggagcc aagcaggaaa 540

catggaaaca tgtactctgt attcgacctg agctcaggca aggctacccg ctgaacttaa 600

gcatatcact aagcgaggaa aaaaaccccc ccccaaaaaa agggggg 647

Claims (10)

1.一种栅列藻Desmodesmus communis藻株YYAW001，以保藏号CGMCC No.24296保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种培养栅列藻的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1所述的栅列藻藻株接种于培养基中，并在温度为16～30℃，连续光照强度为5～200μmol·m^-2·s^-1，pH值为6.5-9，以及通入CO₂的条件下培养。

3.根据权利要求2所述的培养栅列藻的方法，其特征在于，

以1～1×10⁵个细胞/mL的接种密度将栅列藻藻株接种于培养基中；

培养基为BG11培养基、BBM培养基、MCM培养基和TAP培养基中的一种，培养周期为5-10天。

4.根据权利要求2所述的培养栅列藻的方法，其特征在于，

培养过程中，温度为20-25℃，连续光照强度为20～50μmol·m^-2·s^-1，pH值为7-8。

5.根据权利要求2所述的培养栅列藻的方法，其特征在于，

培养基为BG11培养基；

BG11培养基中的N源包括1.3～1.7g/L的NaNO₃。

6.根据权利要求1所述的栅列藻藻株YYAW001在生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、天然色素或生物质中的应用。

7.根据权利要求1所述的栅列藻藻株YYAW001在水质净化中的应用。

8.一种制备栅列藻藻粉的方法，其特征在于，包括：

S1、对权利要求1所述的栅列藻藻株YYAW001进行自养培养，获得种子液；

S2、将种子液接种到光生物反应器中进行扩大培养；

S3、收集扩大培养的细胞，获得栅列藻藻泥；对栅列藻藻泥进行干燥，获得栅列藻藻粉。

9.根据权利要求8所述的制备栅列藻藻粉的方法，其特征在于，

S2中，将种子液接种到光生物反应器中，在温度24-30℃，连续光照强度50～500μmol·m^-2·s^-1，pH值6.5-9的条件下进行通入CO₂培养；

通入CO₂包括依次进行的两个阶段；第一阶段CO₂的通入量为0.5vvm，时间为3-5天；第二阶段CO₂的通入量为1.0vvm，时间为5-10天。

10.根据权利要求8所述的制备方法获得的栅列藻藻粉在食品、保健品或药品中的应用。

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