CN103952314A - 一株淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05 及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物能质源技术领域，具体涉及一株保藏号为CCTCC M2013609的淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05，该藻株能够高效固定0.03%～30%的CO2，CO2固定效率为90～370mg/L/d，生物量（干重）浓度为700～3800mg/L，油脂含量为20%～43%，其油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，适合生物柴油的生产。本发明的栅列藻株还可通过耦合工业烟道气减排及市政废水深度净化，其中废水氮磷去除率可达95%以上，并得到高产量的微藻油脂，因此可以大大降低微藻油脂生产成本，为高效减排高污染源CO2，污水处理以及清洁能源的制备提供了一株优良的生产藻种。

Description

一株淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05 及其应用
技术领域
本发明涉及生物质能源技术领域，具体涉及一株淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05及其在固定工业烟道气CO2耦合市政废水深度处理及生产微藻生物柴油中的应用。 
背景技术
能源危机、温室效应以及水污染是21世纪全球面临的三大危机，随着我国工业化步伐的加快，危机日益加重，直接影响国家经济的发展并威胁人类健康。 
近些年来，开发可持续的清洁能源成为各国可持续发展的首选。其中某些微藻藻种因含油量高、易于培养、单位面积产量高，可耦合工业废气及污水的综合治理等优点，而被用于可再生能源微藻生物柴油的生产，利用微藻制备生物柴油技术也被认为是新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油制备的原料。 
美国，澳洲、日本、西欧、印度和南非的政府或企业也投入巨资进行微藻生物柴油的研究。美国著名实验室和科学家组成的National Alliance，该联盟中的Live Fuels公司宣布了由国家能源局支持的“微型曼哈顿计划”，即微藻能源计划，计划在2010年实现微藻制备生物柴油的工业化。日本国际贸易和工业部曾资助了一项名为“地球研究更新技术计划”的项目。该项目利用微藻来生物固定CO2,并着力开发密闭式光生物反应器技术，通过微藻吸收火力发电厂烟气中的CO2来生产生物质能源。2008年，英国碳基金公司启动了目前世界上最大的藻类生物燃料项目，投入2600万英镑用于发展相关技术和基础设施，该项目预计到2020年实现商业化。荷兰AlgaeLink公司是一家拥有工业化藻类培养设备和藻油加工技术的跨国公司，该公司向全球销售其反应器，并提供相关技术支持。2008年4月该公司与荷兰航空公司签订了利用藻油开发航空燃油的协议。此外，以色列一家公司于2007年对外展示了利用海藻吸收CO2，将太阳能转化为生物质能的技术，每5千克藻类可生产1升燃料。 
近年来，微藻生物柴油技术也引起了我国政府科研机构和企业的重视，被列为科技部863计划、973基础规划、十二五生物技术发展规划的重点项目之一。各高校和科研院所都开展了这方面的研究，主要集中于藻种的筛选、微藻培养生物反应器设计及下游加工技术。 目前，一些企业及研究机构也正在进行微藻生产生物柴油的中试培养。新奥科技发展有限公司的“CO2—微藻—生物柴油”关键技术研究项目已经通过中试，并在内蒙古达拉特旗建设280hm2的微藻养殖基地。2009年，中国石化股份有限公司与中科院联合启动了“微藻生物柴油成套技术”项目，目标计划到2015年完成万吨级工业生产装置。 
虽然微藻生物柴油目前在技术上是可行的，但是与化石柴油相比，微藻生物柴油的生产面临着两大“瓶颈”，使得微藻生物柴油的生产严重受阻。其一是微藻生物柴油生产成本高，故产品价格也较高，还无法适应当前的市场需求，且因微藻的大规模培养水平尚有限，这也使得微藻生物柴油的价格居高不下；二是微藻生物质自养培养细胞密度低导致后续加工处理过程成本高。而将“微藻生物柴油生产”、“CO2减排”“市政废水”三者高度耦合研究，不仅可以降低微藻生物柴油生产成本，而且可以提高微藻细胞培养密度，更为重要的是可以实现温室气体的减排及废水的深度净化处理。这种新理念为缓解当前能源紧缺、大气污染以及水污染提供了一条新的技术工艺。 
但是，并不是所有的微藻都能同时满足以上耦合系统的要求，获得优势特色藻种是该技术工艺走向工业化应用的关键环节。 
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株优势特色淡水栅列藻，该栅列藻藻株可以转化工业烟道气CO2，并利用废水生长累积生物柴油制备的原材料，该发明可以有效解决当前工业源大气污染物的治理同时耦合市政废水的深度净化及微藻生物柴油生产成本过高的问题。 
本发明首先公开了一种栅列藻株Desmodesmus communes GS05，其保藏号为：CCTCCM2013609。 
本发明从取自甘肃天水发电厂附近微酸性废水样中分离筛选到一株栅列藻，命名为Desmodesmus communes GS05，该菌株已于2013年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M2013609。 
本发明分离的淡水藻株在以BG-11培养基为基础营养盐培养基培养时，该藻株呈卵形，直径在4～8μm之间，具有两根鞭毛，具有一个或多个眼点，每个细胞内有一个周生、杯状或片状的色素体，具有1个细胞核；细胞壁较薄。普通培养条件下，测定其蛋白含量为50% 左右，油脂含量为20～43%，多糖含量为25%左右，富含绿叶素。在通入高浓度二氧化碳时，细胞内可以累积大量脂滴，脂质含量最高可达51%。 
经形态学鉴定和18S rRNA，ITS-2以及rbcL扩增序列发育树分析，确定该藻株为栅列藻（按照国际命名规则：属名+种名+株名对该藻株进行命名，属名、种名、株名分别为Desmodesmus、communes和GS05），命名为Desmodesmus communes GS05，保藏号为：CCTCCM2013609。该藻株适合培养温度和pH范围较广，适宜培养温度范围为10～45℃，适宜pH值范围为4.0～11，可以耐受的CO2浓度范围为0.03～30%之间，比较适合在日照较好、温度较高、水体偏酸性的内陆地区培养。 
优选的，所述栅列藻株Desmodesmus communes GS05固定二氧化碳并在细胞内累积油脂，细胞内脂质含量为20～51wt%。 
更优选的，所述栅列藻株Desmodesmus communes GS05固定二氧化碳并在细胞内累积油脂，细胞内脂质含量为20～43wt%。 
更优选的，所述小球藻C.sorokiniana GS03中，C16及C18短链脂肪酸的含量＞84wt%。可见，油脂的脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，适合生物柴油的生产。 
本发明第二方面公开了栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵并固定CO2的方法，步骤如下： 
1）种子液的制备：无菌条件下挑取栅列藻Desmodesmus communes GS05单藻落到灭菌的BG-11培养液中培养至对数生长期，获得微藻种子液； 
2）生物发酵：将经过对数期培养的微藻种子液接种到灭菌的BG-11培养液中进行培养，培养温度为10～45℃，培养基pH值4.0～11，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为0.03～30v/v %，培养10-14天，收获栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵液。 
优选的，步骤1）所述藻株种子液的培养条件为：培养温度为10～45℃，培养基pH值4.0～11，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为0.03v/v%，培养10天。 
优选的，步骤2）所述藻株种子液的接种量为5～15v/v%。 
本发明所述光暗比为8～24：16～0，是指每天光照时间为A小时，黑暗时间为B小时，A：B为8～24：16～0，并且A+B=24小时。 
优选的，步骤2）所述发酵培养的条件为：温度25～35℃，培养基pH值5～7，光照强度5000～12000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为5～20v/v%，培养14天后发酵结束，获得发酵液。 
更优选的，步骤2）所述发酵培养的条件为：温度28℃，培养基pH值8.0，光照强度7500lux，光暗比为12：12，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm，CO2含量为0.03～15v/v%，培养14天后发酵结束，获得发酵液。 
本发明第三方面公开了栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵制备生物柴油的工艺，工艺步骤如下： 
1.采用前述栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵并固定CO2的方法制备获得栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵液； 
2.将前一步骤获得的发酵液固液分离，收集微藻细胞获得藻泥； 
3.将前一步骤所得的藻泥干燥，获得藻粉； 
4.将前一步骤获得的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。 
优选的，步骤2还包括检测藻泥的CO2固定效率，以及藻株生物量产率的检测。微藻生物量及微藻产率的检测为常规分析过程，具体方法可参考现有技术。CO2固定效率的测定，可以利用微藻细胞平均碳含量及生物量产率间接计算得知。 
优选的，步骤2所述干燥的方法为60～90℃烘干，或者真空冷冻干燥。 
优选的，步骤3还包括对藻粉的油脂含量进行检测。油脂含量的测定方法为常规分析方法，具体可采用氯仿甲醇法分析油脂含量。 
优选的，步骤4还包括对制备的脂肪酸甲酯的组成进行分析，为通过气象色谱质谱技术分析脂肪酸甲酯的种类和相对含量。 
本发明第四方面公开了栅列藻Desmodesmus communes GS05耦合市政废水的深度净化方法，步骤如下： 
A.采用前述栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵并固定CO2的方法制备获得栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵液； 
B.将前一步骤获得的发酵液固液分离，收集微藻细胞获得藻泥； 
C.将前一步骤所得的藻泥接种于市政废水中培养，接种量为0.05-0.2g/L（每升污水加0.05-0.2g藻泥），培养温度为10～45℃，培养基pH4～11，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24:16～0，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为0.03%～30v/v%，处理6-14天后处理结束。 
优选的，所述藻株废水培养处理的时间为8天。 
所述市政废水的主要来源是生活污水，是人们在日常生活活动中产生的废水，主要是生活废料、人和畜的排泄物，其中包括厨房洗涤、淋浴、洗衣等的废水以及冲洗厕所等的污水。 
本发明第五方面公开了栅列藻Desmodesmus communes GS05在生物质能源领域的应用。 
优选的，栅列藻Desmodesmus communes GS05的应用为固定二氧化碳并生产生物柴油。 
本发明最后一方面公开了栅列藻Desmodesmus communes GS05在环境及污水治理领域的应用。 
优选的，为栅列藻Desmodesmus communes GS05在市政废水深度净化处理中的应用。 
所述市政废水为废水处理厂二级流出口废水。 
本发明的栅列藻Desmodesmus communes GS05能够高效固定CO2，因此可以在高效减排高浓度工业烟道气CO2的基础上耦合市政废水，并同时产生极高的生物量和微藻油脂，用作生物产品及生物质能源。 
有益效果：本发明提供的淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05能够耐受0.03～45v/v%的CO2，并能够高效固定0.03～15v/v%的CO2，CO2固定效率为90～370mg/L/d，生物量（干重）浓度为700～3800mg/L。本发明提供的淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05还能在高效减排高浓度工业烟道气CO2的基础上高产生物量及微藻油脂。同时本发明提供的淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05还能在高效减排高浓度工业烟道气CO2的基础上耦合市政废水高产生物量及微藻油脂。该株淡水小球藻可以在气升式光合生物反应器中， 选择适合的培养条件，能高效的利用CO2、快速的形成生物量并积累微藻油脂，，油脂含量可达20%～43%，其油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸（＞84%），其油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，适合生物柴油的生产。 
此淡水栅列藻与已报道的微藻藻株相比具有将废水处理、工业烟道气的减排及微藻生物柴油的生产高度耦合的性能。因此可以大大降低微藻油脂生产成本，为高效固定典型工业烟道气环境中CO2，市政废水的深度净化处理以及微藻油脂制备生物柴油提供了一株优良的生产藻种。 
本发明藻株保藏信息如下： 
藻株名称：Desmodesmus communes GS05； 
保藏号为：CCTCC M2013609； 
保藏日期：2013年11月27日； 
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心； 
保藏单位简称：CCTCC； 
保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。 
附图说明
图1：淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05的藻细胞扫描电镜照片 
图2：淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05的藻细胞光学显微镜照片 
图3：淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05的藻细胞内部脂肪滴染色显微照片 
图4：生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析 
图5：淡水栅列藻Desmodesmus communes GS05处理市政污水过程，废水中氮、磷去除曲线 
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。 
实施例1 
无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养12天，生长到指数末期获得微藻种子液。 
配制BG-11培养基，按5v/v%接入已扩大培养的微藻种子液。初始pH4.0，温度25℃，12000lux光照强度下，通入1vvm的空气（CO2含量为0.03v/v%），培养14天。 
离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为700mg/L，生物量产率为50mg/L/d，CO2固定效率为90mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为20%。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的93%以上，微藻细胞的扫描电镜照片、光学显微镜照片，以及脂肪滴染色照片见图1-3。 
实施例2 
无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。 
配制BG-11培养基，接入已扩大培养的细胞。初始pH7.0，温度45℃，2500lux光照强度下，通入0.33vvm的5%CO2（v/v），培养10天。 
离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2000mg/L，生物量产率为200mg/L/d，CO2固定效率为370mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为43%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的84%以上，产物的HPLC分析图谱见图4。 
实施例3 
无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。 
配制BG-11培养基按15%接种量接入已扩大培养的细胞。初始pH11.0，温度10℃， 7500lux光照强度下，通入0.2vvm的30%CO2（v/v），培养14天。 
离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2100mg/L，生物量产率为200mg/L/d，CO2固定效率为350mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为41%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的96%以上。 
实施例4 
无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。 
配制BG-11培养基接入已扩大培养的细胞。初始pH5.0，温度35℃，7500lux光照强度下，通入0.33vvm的15%CO2（v/v），培养12天。 
离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2600mg/L，生物量产率为200mg/L/d，CO2固定效率为200mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为41%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的95%以上。 
实施例5 
无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以15v/v%接种比例扩大培养，离心获得藻泥。 
接入0.48g藻泥于2.4L市政废水中（上海市闵行区废水处理厂二级出口废水），初始pH7.0，温度28℃，7500lux光照强度下，通入0.33vvm的15%CO2（v/v），培养8天。 
离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为1800mg/L，生物量产率为225mg/L/d，CO2固定效率为235mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为51%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的96%以上。 
实施例6 市政污水处理 
无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于 光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养10天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养，以相同条件发酵培养10天后，离心获得藻泥。 
接入0.12g藻泥于2.4L市政废水中（上海市闵行区废水处理厂二级出口废水），控制初始pH7.0，温度28℃，7500lux光照强度下，通入0.33vvm的15%CO2（v/v），培养8天。 
培养过程中废水中氮、磷去除曲线见图5（A1\A2），氮、磷去除效率可达90%以上。同时利用该废水可收获微藻生物量1600mg/L，获得微藻油脂960mg/L。 

Claims (8)

1.一种栅列藻株Desmodesmus communes GS05，其保藏号为：CCTCC M2013609。
2.栅列藻株Desmodesmus communes GS05发酵并固定CO2的方法，步骤如下：
1）种子液的制备：无菌条件下挑取权利要求1所述栅列藻Desmodesmus communes GS05单藻落到灭菌的BG-11培养液中培养至对数生长期，获得微藻种子液；
2）生物发酵：将经过对数期培养的微藻种子液接种到灭菌的BG-11培养液中进行培养，培养温度为10～45℃，培养基pH值4.0～11，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为0.03～30v/v %，培养10-14天，收获栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述藻株种子液的培养条件为：培养温度为10～45℃，培养基pH值4.0～11，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为0.03v/v%，培养10天。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）所述发酵培养的条件为：温度28℃，培养基pH值8.0，光照强度7500lux，光暗比为12：12，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm，CO2含量为0.03～15v/v %，培养14天后发酵结束，获得发酵液。
5.栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵制备生物柴油的工艺，工艺步骤如下：
(1)采用权利要求2-4任一权利要求所述栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵并固定CO2的方法制备获得栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵液；
(2)将前一步骤获得的发酵液固液分离，收集微藻细胞获得藻泥；
(3)将前一步骤所得的藻泥干燥，获得藻粉；
(4)将前一步骤获得的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。
6.栅列藻Desmodesmus communes GS05耦合市政废水的深度净化方法，步骤如下：
A.采用权利要求2-4任一权利要求所述栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵并固定CO2的方法制备获得栅列藻Desmodesmus communes GS05发酵液；
B.将前一步骤获得的发酵液固液分离，收集微藻细胞获得藻泥；
C.将前一步骤所得的藻泥接种于市政废水中培养，接种量为0.05～0.2g/L，培养温度为10～45℃，培养基pH4～11，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24:16～0，通气量为0.2～1vvm，其中CO2含量为0.03～30v/v%，6～14天后处理结束。
7.权利要求1所述栅列藻Desmodesmus communes GS05在生物质能源领域的应用。
8.权利要求1所述栅列藻Desmodesmus communes GS05在环境及污水治理领域的应用。
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