CN103695482A - 一种利用提油后藻渣生产微藻油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用提油后藻渣生产微藻油脂的方法，按如下步骤：将藻渣用硫酸进行两步水解；将藻渣水解液配成微藻生长的培养液；将微藻藻种接种于上述培养液中，采用基于CO2浓度的两步法培养；用正己烷和乙醇提取油脂。本发明培养过程操作简单，生产成本低，油脂产率高，无环境污染，可规模化，实现废弃物资源化，提供一种新的微藻产油模式，是一种满足工业化需求、实用性很强的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及化工技术领域。
背景技术
微藻油脂，又称单细胞油脂，是制备生物柴油的良好原料。部分微藻富含油脂等代谢产物，其油脂可用来制备生物柴油。与其他油料作物相比，利用微藻培养生产生物柴油具有以下优势。首先，利用微藻培养生产生物柴油所需占地面积最少，同时微藻培养可以利用滩涂地、荒废地等非耕地，因此微藻培养生产生物柴油不会导致世界粮食供应问题。从所需用地面积占全球总面积角度看，利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。此外，微藻还能通过光合作用固定CO2合成油脂，可实现CO2减排。再者，微藻生长过程能利用废水中的N、P等物质，可以实现废水的净化。微藻油脂制备的生物柴油与其他油料作物制备的生物柴油及石油基柴油在性能方面差异不大利用微藻油脂这一新的油脂资源，可实现能源和环境的和谐而可持续发展。
微藻细胞除含油脂外，还含大量的碳水化合物，蛋白质等，因此在微藻制备高品质生物柴油过程中会产生大量的残余物质，以上物质若不加以利用将造成藻体残渣高价值多元组成的浪费和环境污染。实际上，藻体残渣是重要的生物质资源。首先，微藻一直是水产饵料。理论上，油脂提取后的藻渣可用作水产饵料，但目前一般采用有机溶剂大规模提取微藻油脂，藻渣中往往会残留有机溶剂；若将藻渣用作水产动物饵料，将对水产动物生长造成严重影响，甚至引起水产动物死亡。此外，可以将藻渣转化成高附加值产品，即从藻渣中提取多糖、色素、生长因子等活性成分。再者，可以通过微生物转化直接将藻渣发酵成沼气或氢气或将藻渣与秸秆共发酵产沼气或氢气等。
21世纪初，世界经济的快速发展，石油枯竭和价格上涨，美国等发达国家的政府和企业域纷纷投入大量资金并计划投入巨资进行微藻生物柴油中试和产业化，在国际上掀起了一股势不可挡的微藻生物柴油开发热潮。2007年，美国宣布由国家能源局支持的微型曼哈顿计划，计划在2010年实现微藻制备生物柴油工业化，各项技术研发全面提速。美国还制订了微藻生物燃料技术路线图。在2008年12月9~10日的会议上提出了实现商业规模微藻生物燃料工业的难关和战略，指导在微藻科学与工程领域里微藻的培育、生产、加工和转化；并制订了技术经济模型，用于指导研发、政策、商业发展的决策。一些发达国家也都纷纷启动了微藻生物柴油方面的科研项目，目前全球已有150多家专门从事微藻生物柴油开发研究的公司，可以说微藻生物柴油已经成为世界各国重点研究的战略方向。美国能源部(DOE)每年投资数百万美元以推进该项目的商业化进程。目前微藻产生物柴油尚未实现工业化生产，目前生产方式微藻产油效率比较低，还没有发现一种可将提油后藻渣充分利用的方法。本专利即为一种利用提油后藻渣水解液培养微藻生产油脂的方法，大大提高微藻产油效率，该工艺路线尚未有文献报道。
发明内容
针对现有技术中提油后藻渣未被充分利用，自养微藻油脂产率低，微藻生物能源生产系统成本偏高的问题，本发明的目的在于提供一种利用提油后藻渣生产微藻油脂的方法，该方法高效产油、藻渣水解效率高、微藻油脂生产成本大大降低、藻渣水解液利用效率高、反应条件温和、环境友好、操作过程简单。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种利用提油后藻渣生产微藻油脂的方法，其特征在于按以下步骤。
（1）将藻渣与质量分数为0.1~5%的稀硫酸以1∶1~5的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度80~200℃，时间2~10分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液。
（2）将藻渣水解液配成微藻生长的培养液：水与藻渣水解液之比为9~4:1，并加入100~800mg/L的硝酸钠或氯化铵，10~35000mg/L的氯化钠和10~150mg/L的磷酸二氢钠，高氯化钠含量有助于抑制带菌微藻培养过程中其他微生物生长。
（3）将微藻藻种接种于步骤（2）的培养液中，置于敞开式或密闭式反应器生长，培养过程中温度25~30℃、pH 6.0~9.0、通气量0.1~1.0vvm、自然光或人工光光照强度500~5000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养。培养前期为培养起始5~7天，培养液中碳源较充足，故使用低浓度CO2为1~3%；培养后期为5~8天CO2浓度调高至10%~40%，强化碳源的供给；通过CO2浓度改变来改变培养液中C、N比而促进微藻生物质和油脂积累，低C、N比有利于小球藻积累生物质，高C、N比有利于微藻积累油脂；CO2浓度改变通过空气和沼气发酵产生的CO2在气体混合装置中混合来实现。
（4）收集步骤（3）中的微藻，用水冲洗，经微波炉预处理（80~150℃，1500~3000MHz，3~15分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：1~3，其中有机相经旋转蒸发（温度30~50℃，转速20~80转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。
本发明步骤（4）所述的微波炉预处理的最优方案是120℃，2500MHz，10分钟。
本发明利用高效液相色谱仪检测藻渣水解液中糖含量，用氨基酸分析仪测定藻渣水解液中氨基酸含量，用紫外分光光度计测定微藻生物量，用正己烷和乙醇提取油脂，烘干后用电子天平测油脂重量。
本发明微藻油脂的生产是利用藻渣，微藻培养过程通入CO2可调控油脂积累代谢，提高油脂产率，培养过程操作简单，生产成本低，无环境污染，可规模化，实现废弃物资源化，提供一种新的微藻产油模式，是一种满足工业化需求、实用性很强的新方法。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
以下实施例所用到的小球藻，可从中国典型微生物保藏中心（武汉）获得，其保藏编号为CCTCC M209256；所用到的微拟球藻、原核小球藻和雨生红球藻，可从美国德州大学UTEX藻种库获得，其保藏编号分别为LB2164、256和2505; 所用到的莱茵衣藻，可从中国科学院水生生物研究所淡水藻种库获得，其保藏编号为FACHB-265。
实施例1。
将小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：氯化钠 24000，Na2EDTA 10，FeSO4·7H2O 50，KH2PO4 20，MgCl2 20 和NaNO3 100 置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。在光照培养箱中生长的100g小球藻，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用蒸馏水冲洗5次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：2，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到藻渣，藻渣与质量分数为5%的稀硫酸以1比3的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度180℃，时间3分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液；检测其中糖和氨基酸含量。
将藻渣水解液配成小球藻生长的培养液：自来水与藻渣水解液之比为7:1，并加入300mg/L的硝酸钠，30000mg/L的氯化钠和50mg/L的磷酸二氢钠。将小球藻藻种接种于灭菌后含藻渣水解液的培养液中置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度30℃、pH 7.0、通气量0.5vvm、白炽灯光照强度3000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养，培养前期为培养起始5天，使用的CO2浓度为3%；培养后期为5天，期间CO2浓度调至30%，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用水冲洗3次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：1，其中有机相经旋转蒸发（温度35℃，转速20转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。结果见表1。
实施例2。
将原核小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：蛋白胨1000，NaCl 25，CaCl2·2H2O 25，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4·7H2O 75 和NaNO3 250置于光照培养箱中培养，培养温度28℃，光照强度5000lx，培养10天。在光照培养箱中生长的100g原核小球藻，絮凝（FeCl3.6H2O，加入量50 mg/L）收集获得藻体，用蒸馏水冲洗5次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：1，水相经离心（10000转/分钟，15分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到藻渣，藻渣与质量分数为5%的稀硫酸以1比1的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度100℃，时间10分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液；检测其中糖和氨基酸含量。
将藻渣水解液配成微拟球藻生长的培养液：蒸馏水与藻渣水解液之比为1:1，并加入100mg/L的氯化铵，35000mg/L的氯化钠和50mg/L的磷酸二氢钠。将微拟球藻藻种接种于灭菌后含藻渣水解液的培养液中置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度25℃、pH 8.0、通气量0.3vvm、太阳光光照强度5000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养，培养前期为培养起始5天，使用的CO2浓度为1%；培养后期为5天，期间CO2浓度调至20%，培养结束后；絮凝（FeCl3.6H2O，加入量50 mg/L）收集获得藻体，用水冲洗3次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：2，其中有机相经旋转蒸发（温度40℃，转速40转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。结果见表1。
实施例3。
将雨生红球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：NaCl 25，Na2EDTA 50，FeSO4·7H2O 4.98，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4·7H2O 75, ZnSO4·7H2O 8.82, CaCl2·2H2O 25，CuSO4·5H2O 1.57，MnCl2 1.44，MoO3 0.71，H3BO3 11.42，KOH 31和NaNO3 250置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度5000lx，培养10天。在光照培养箱中生长的100g雨生红球藻，过滤（滤膜直径0.5μm）收集获得藻体，用自来水冲洗5次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：3，水相经离心（12000转/分钟，15分钟）后，用自来水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到藻渣，藻渣与质量分数为5%的稀硫酸以1比3的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度180℃，时间3分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液；检测其中糖和氨基酸含量。
将藻渣水解液配成小球藻生长的培养液：自来水与藻渣水解液之比为7:1，并加入800mg/L的硝酸钠，30000mg/L的氯化钠和50mg/L的磷酸二氢钠。将小球藻藻种接种于灭菌后含藻渣水解液的培养液中置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度30℃、pH 8.0、通气量0.5vvm、白炽灯光照强度2000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养，培养前期为培养起始7天，使用的CO2浓度为2%；培养后期为8天，期间CO2浓度调至25%，培养结束后；过滤（滤膜直径0.5 μm）收集获得藻体，用水冲洗3次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：3，其中有机相经旋转蒸发（温度35℃，转速50转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。结果见表1。
实施例4。
将微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：NaCl 30000，Na2EDTA 20，FeSO4·7H2O 30，NaH2PO4 30，MgCl2 20 和NaNO3 200置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。在光照培养箱中生长的100g微拟球藻，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用自来水冲洗5次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：3，水相经离心（12000转/分钟，15分钟）后，用自来水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到藻渣，藻渣与质量分数为5%的稀硫酸以1比3的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度180℃，时间3分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液；检测其中糖和氨基酸含量。
将藻渣水解液配成原核小球藻生长的培养液：蒸馏水与藻渣水解液之比为7:1，并加入300mg/L的硝酸钠，25 mg/L的氯化钠和100mg/L的磷酸二氢钠。将原核小球藻藻种接种于灭菌后含藻渣水解液的培养液中置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度30℃、pH 8.0、通气量0.5vvm、白炽灯光照强度2000 lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养，培养前期为培养起始7天，使用的CO2浓度为2%；培养后期为8天，期间CO2浓度调至15%，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用水冲洗3次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：3，其中有机相经旋转蒸发（温度30℃，转速40转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。结果见表1。
实施例5。
将莱茵衣藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：NaCl 25，Na2EDTA 0.05，FeCl3·6H2O 0.5，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4·7H2O 75 和NaNO3 250 置于光照培养箱中培养，培养温度26℃，光照强度3000 lx，培养10天。在光照培养箱中生长的100g莱茵衣藻，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用自来水冲洗5次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：3，水相经离心（12000转/分钟，15分钟）后，用自来水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到藻渣，藻渣与质量分数为5%的稀硫酸以1比3的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度180℃，时间3分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液；检测其中糖和氨基酸含量。
将藻渣水解液配成小球藻生长的培养液：自来水与藻渣水解液之比为7:1，并加入200mg/L的氯化铵，20000mg/L的氯化钠和100mg/L的磷酸二氢钠。将小球藻藻种接种于含藻渣水解液的培养液中置于敞开式平板反应器生长，培养温度30℃、pH 8.0、通气量0.5vvm、太阳光光照强度4000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养，培养前期为培养起始7天，使用的CO2浓度为2%；培养后期为8天，期间CO2浓度调至10%，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用水冲洗3次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：2，其中有机相经旋转蒸发（温度35℃，转速20转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。结果见表1。
实施例6。
将小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：氯化钠 24000，Na2EDTA 10，FeSO4·7H2O 50，NaH2PO4 20，MgCl2 20 和NaNO3 100 置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。在光照培养箱中生长的100g小球藻，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用蒸馏水冲洗5次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：1，水相经离心（10000转/分钟，15分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到藻渣，藻渣与质量分数为5%的稀硫酸以1比1的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度100℃，时间10分钟，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24小时，反应结束后得到藻渣水解液；检测其中糖和氨基酸含量。
将藻渣水解液配成微拟球藻生长的培养液：蒸馏水与藻渣水解液之比为1:1，并加入800mg/L的硝酸钠，25000mg/L的氯化钠和50mg/L的磷酸二氢钠。将微拟球藻藻种接种于含藻渣水解液的培养液中置于敞开式平板反应器生长，培养温度25℃、pH 7.0、通气量0.3vvm、太阳光光照强度5000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养，培养前期为培养起始5天，使用的CO2浓度为1%；培养后期为5天，期间CO2浓度调至20%，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得藻体，用水冲洗3次，经微波炉预处理（120℃，2500MHz，10分钟）后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1：1：2，其中有机相经旋转蒸发（温度35℃，转速30转/分钟）去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。结果见表1。
对比例1。
将小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：氯化钠 24000，Na2EDTA 10，FeSO4·7H2O 50，NaH2PO4 20，MgCl2 20 和NaNO3 100 置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx,培养10天。分析生物量及油脂产率，结果见表1。
对比例2。
将微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：NaCl 30000，Na2EDTA 20，FeSO4·7H2O 30，NaH2PO4 30，MgCl2 20 和NaNO3 200置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx, 通气量0.5vvm，CO2浓度为2%，培养10天。分析生物量及油脂产率，结果见表1。
对比例3。
将原核小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（mg/L）：NaCl 25，CaCl2·2H2O 25，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4·7H2O 75 和NaNO3 250置于光照培养箱中培养，培养温度30℃，光照强度2000lx，培养15天。分析生物量及油脂产率，结果见表1。
表1 实施例及对比结果
Claims (2)
1.一种利用提油后藻渣生产微藻油脂的方法，其特征是按如下步骤：
（1）将藻渣与质量分数为0.1~5%的稀硫酸以1:1~5的质量比混合均匀，置于反应釜中，反应温度80~200℃，时间2~10min，然后再加入浓盐酸进一步水解，水解条件：6mol/L盐酸，110℃，水解24h，反应结束后得到藻渣水解液；
（2）将藻渣水解液配成微藻生长的培养液：水与藻渣水解液之比为9~4:1，并加入100~800mg/L的硝酸钠或氯化铵、10~35000mg/L的氯化钠和10~150mg/L的磷酸二氢钠；
（3）将微藻藻种接种于步骤（2）的培养液中，置于敞开式或密闭式反应器生长，培养过程中温度25~30℃、pH 6.0~9.0、通气量0.1~1.0vvm、自然光或人工光光照强度500~5000 lx，光暗周期12/12，采用基于CO2浓度的两步法培养：培养前期5~7天，CO2浓度为1~3%；培养后期5~8天，CO2浓度调至10%~40%；
（4）收集步骤（3）中的微藻，用水冲洗，经80~150℃、1500~3000MHz、3~15分钟微波炉预处理后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的藻浆体积比为1:1:1~3，其中有机相温度30~50℃、转速20~80转/分钟旋转蒸发，去除有机溶剂后，去杂，干燥，得到油脂。
2.根据权利要求书1所述的生产微藻油脂的方法，其特征是步骤（4）所述的微波炉预处理条件为：120℃、2500MHz、10分钟。
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