CN107365708A - 栅藻(desmodesmus sp.)及其在合成油脂及生质燃料上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新颖的经分离栅藻(Desmodesmus sp.)及其在油脂与生质燃料合成及二氧化碳固定中的应用。

Description

栅藻(DESMODESMUS SP.)及其在合成油脂及生质燃料上的 应用

技术领域

本发明涉及新颖的栅藻(Desmodesmus sp.)分离株，所述分离株可产生高量的三酸甘油酯及C16～C18脂肪酸，且具有高效的固碳作用，故所述分离株可作为生产健康油脂及生质柴油的原料，还可应用于二氧化碳的减量。

背景技术

微藻(microalgae)属于一种单细胞藻类，其分布范围非常广泛，在淡水、海洋或潮湿的土壤中都可发现其踪迹，其生长形式包括单独生长、链状或是团状生长(瑟曼H.V.及伯顿E.A.,海洋学导论,普伦蒂斯·霍尔,新泽西,1997(Thurman H.V.&Burton E.A.,Introductory Oceanography,Prentice Hall,New Jersey,1997))。根据不同的微藻物种，其尺寸范围可从几微米(μm)到几百微米。微藻能够行光合作用，吸收二氧化碳，产生大气中一半的氧气量，对地球上的生命至关重要。微藻的生物多样性非常复杂，无论是以基础研究或是开发的角度而言，微藻为一个几乎未积极开发的资源。据估计，地球上大约有20-80万种微藻，其中已发现并有记录的仅有5万种(博罗维茨卡M.A.,微藻类的商业化生产：池塘、槽、管及发酵罐,生物技术杂志,1999,70:313-321(Borowitzka M.A.,Commercialproduction of microalgae:ponds,tanks,tubes and fermenters.,Journal ofbiotechnology,1999,70:313-321))。大多数微藻所产生的化合物包括类胡萝卜素、抗氧化剂、脂肪酸、酶、聚合物、胜肽、藻毒素及固醇类等，目前已有超过1.5万个新化合物是从微藻藻体萃取后经化学分析确认(汤普森P.A.,哈里森P.J.及怀特J.N.,照射对浮游植物1的脂肪酸组成的影响,藻类学杂志,1990,26:278-288(Thompson P.A.,Harrison P.J.&WhyteJ.N.,Influence of irradiance on the fatty acid composition ofphytoplankton1.,Journal of Phycology,1990,26:278-288))。

脂质是微藻的次级代谢产物，具有保持细胞膜通透性的功能，以及因应环境变化作为细胞讯息传递途径的功能。微藻细胞所能生产的油脂量与组成会因周遭环境而产生变化(汤普森P.A.,哈里森P.J.及怀特J.N.,照射对浮游植物1的脂肪酸组成的影响,藻类学杂志,1990,26:278-288(Thompson P.A.,Harrison P.J.&Whyte J.N.,Influence ofirradiance on the fatty acid composition of phytoplankton1.,Journal ofPhycology,1990,26:278-288)；及博罗维茨卡M.A.,微藻类的商业化生产：池塘、槽、管及发酵罐,生物技术杂志,1999,70:313-321)。当环境条件不利于微藻细胞生长时，微藻藻体所吸收的碳将转变成油脂的能量形式储存起来，而其油脂含量、组成及所含各种脂肪酸比例也会根据培养环境条件，包括光强度、生长阶段、光周期、温度、盐度、二氧化碳浓度、氮及磷浓度等，而有所不同(邓斯坦G.等人,在大量培养中生长的三种微藻类的多不饱和脂肪酸含量的脂质组成及最大化的变化,应用藻类学杂志,1993,5:71-83(Dunstan G.et al.,Changes in the lipid composition and maximisation of the polyunsaturatedfatty acid content of three microalgae grown in mass culture.,Journal ofApplied Phycology,1993,5:71-83)；及吴H.,等人,使用单细胞拉曼光谱学的活体内脂质组学,美国国家科学院院刊,2011,108:3809-3814(Wu H.,et al.,In vivo lipidomicsusing single-cell Raman spectroscopy.,Proceedings of the National Academy ofSciences,2011,108:3809-3814))。一般而言，微藻富含三酸甘油酯(triacylglycerol，TG)、双酸甘油酯、磷脂、醣脂、碳氢化合物及其它脂类，依照微藻种类及培养条件不同，其微藻含油总量可占藻体干重的1到90％(w/w)(斯波劳雷P.,等人,微藻类的商业应用,.生物科学及生物工程杂志,2006,101:87-96(Spolaore P.,et al.,Commercial applications ofmicroalgae,.Journal of bioscience and bioengineering,2006,101:87-96)；及契斯堤Y.,来自微藻类的生质柴油,生物技术进展,2007,25:294-306(Chisti Y.,Biodiesel frommicroalgae.,Biotechnology advances,2007,25:294-306))。有研究报告指出微藻产生的油脂量及油脂组成因随其藻种的不同，而可作为鉴别藻种的参考依据(伯格伦德O.,等人,湖泊营养对浮游生物食物网中的脂质含量及PCB浓度的影响,生态学,2001,82:1078-1088(Berglund O.,et al.,The effect of lake trophy on lipid content and PCBconcentrations in planktonic food webs.,Ecology,2001,82:1078-1088))。

微藻由于其不凡的潜力，已经引起世界关注。作为一个可持续发展的绿色能源之一，微藻能够解决世界上最紧迫的问题。微藻具备生长速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培养及受病菌污染机率较小等优点，并可在短时间内蓄积大量的生物质，可作为生产生质柴油、生物乙醇及生物氢等生质燃料的原料。加上其细胞结构简单且缺乏细胞分化，相较于棕梠、油菜、大豆及甘蔗等产油作物，其操作性更为简易。此外，微藻可使用非农耕地、苦咸水及废水等进行培养，大大减少了土地与淡水的利用，从而减少与粮食及经济作物的资源竞争。因此，各国政府及私营机构已纷纷投入微藻及其衍生物包括生质燃料、化学品及高价商品等研究与开发。

微藻可用来生成一系列的可再生燃料，包括生质柴油(胡Q,等人,作为用于生物燃料 产生的原料的微藻类三酸甘油酯：前景及发展,植物杂志,2008,54:621-639(Hu Q,etal.,Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production:perspectives and advances.,The Plant Journal,2008,54:621-639)；德兰D.T.,陈C.L.及常J.S.,溶剂及油脂含量对用于使用固定脂肪酶作为生物催化剂的生质柴油合成的小球藻ESP-31的有含水原油的微藻类生物质的直接转酯化的影响,生物资源技术,2013,135:213-221(Tran D.T.,Chen C.L.&Chang J.S.,Effect of solvents and oil content ondirect transesterification of wet oil-bearing microalgal biomass of Chlorellavulgaris ESP-31for biodiesel synthesis using immobilized lipase as thebiocatalyst.,Bioresource technology,2013,135:213-221)；及成H.H.,等人,由丙酮丁醇梭菌自基于微藻类的生质柴油残余物产生生物丁醇,生物资源技术,2015,184:379-385(Cheng H.H.,et al.,Biological butanol production from microalgae-basedbiodiesel residues by Clostridium acetobutylicum.,Bioresource technology,2015,184:379-385))、生物乙醇(哈伦R.及达琼M.K.,酸预处理对用于生物乙醇产生的微藻类生物质的影响,加工生物化学,2011,46:304-309(Harun R.&Danquah M.K.,Influenceof acid pre-treatment on microalgal biomass for bioethanol production.,Process Biochemistry,2011,46:304-309)；霍S.H.,等人,使用斜生栅藻CNW-N的基于微藻类的CO₂固定及生物乙醇产生上的生物工艺发展,生物资源技术,2013,145:142-149(HoS.H.,et al.,Bioprocess development on microalgae-based CO₂fixation andbioethanol production using Scenedesmus obliquus CNW-N.,Bioresourcetechnology,2013,145:142-149)；及霍S.H.,等人,使用富含碳水化合物的微藻类生物质作为原料产生生物乙醇.生物资源技术,2013,135:191-198(Ho S.H.,et al.,Bioethanolproduction using carbohydrate-rich microalgae biomass asfeedstock.Bioresource technology,2013,135:191-198))、生物氢(桑布斯蒂C.,等人,作为用于根据生物炼制方法的生物氢产生的有前景的原料的藻类：全面综述,可再生及可持续能源综述,2015,44:20-36(Sambusiti C.,et al.,Algae as promising feedstocksfor fermentative biohydrogen production according to a biorefinery approach:Acomprehensive review.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2015,44:20-36)；奥尼塞尔S.,等人,自模型微藻类莱茵衣藻产生生物氢：户外实验的环境条件的模拟,国际氢能杂志,2015,40:7502-7510(Oncel S.,et al.,Biohydrogen production frommodel microalgae Chlamydomonas reinhardtii:A simulation of environmentalconditions for outdoor experiments.,International Journal of Hydrogen Energy,2015,40:7502-7510)；及巴蒂斯塔A.P.,等人,组合城市污水处理与生物氢产生–一种整合的基于微藻类的方法,生物资源技术,2015,184:230-235(Batista A.P.,et al.,Combining urban wastewater treatment with biohydrogen production–Anintegrated microalgae-based approach.,Bioresource technology,2015,184:230-235))、甲烷(卡波格诺M.,等人,在城市污水中培养微藻类：用于生质柴油及甲烷的养分去除及生物质产生,藻类研究,2015,10:232-239(Caporgno M.,et al.,Microalgaecultivation in urban wastewater:Nutrient removal and biomass production forbiodiesel and methane.,Algal Research,2015,10:232-239)；阿吉A.,等人,通过城市污泥以及微藻类及废纸的厌氧共消化生物添加甲烷的综述,可再生及可持续能源综述,2015,50:270-276(Ajeej A.,et al.,An overview of bio augmentation of methane byanaerobic co-digestion of municipal sludge along with microalgae and wastepaper.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2015,50:270-276)；及金姆J.及康C.M.,通过污泥与微藻类生物质及食物残渣浸出物的共消化增加甲烷的厌氧产生,生物资源技术,2015,189:409-412(Kim J.&Kang C.M.,Increased anaerobic production ofmethane by co-digestion of sludge with microalgal biomass and food wasteleachate.,Bioresource technology,2015,189:409-412))及合成气(拉希姆A.,等人,使用中心复合设计使用于合成气产生的微藻类小球藻最优选地化,RSC进展,2015,5:71805-71815(Raheem A.,et al.,Optimization of the microalgae Chlorella vulgaris forsyngas production using central composite design.,RSC Advances,2015,5:71805-71815)；拉希姆A.,等人,用于合成气产生的小球藻的热重量研究,藻类研究,2015,12:52-59(Raheem A.,et al.,Thermogravimetric study of Chlorella vulgaris for syngasproduction.,Algal Research,2015,12:52-59)；及胡Z.,马X.及李L.,油页岩及微藻类的共热解对于产生合成气的协同效果,能源学会杂志,2015(Hu Z.,Ma X.&Li L.,Thesynergistic effect of co-pyrolysis of oil shale and microalgae to producesyngas.,Journal of the Energy Institute,2015))。这些能源形式，如果以便利性而言，微藻生质柴油因其油品性质与石化柴油相近，适合用于柴油车辆上，且仅需将化油器等装置进行些微修改；又因为生质柴油属于高能量密度，且较为清洁的燃料，因此适合作为运输燃料。然而，目前将微藻生质燃料商品化的技术尚未成熟，其量产成本还较为高昂，故仍需具有环境耐受度高、生长快速、光合效率佳、固碳效率佳、生物质产率高、藻体易于回收等特点的优良藻种。

预计到2050年时，全世界人口将达到90亿，这将导致全球粮食的供应面临挑战(福利J.A.,等人,耕作星球的解决方法,自然,2011,478:337-342(Foley J.A.,et al.,Solutions for a cultivated planet.,Nature,2011,478:337-342)；及蒂尔曼D.,等人,全球食物需求及农业的可持续强化,美国国家科学院院刊,2011,108:20260-20264(TilmanD.,et al.,Global food demand and the sustainable intensification ofagriculture.,Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108:20260-20264))。微藻近年来已成为生产粮食、饲料、燃料及化学品的明星原料，相较于传统粮食作物，微藻的产量是高等植物的6～7 倍，且可生长在非农耕地或咸水中，所需要的养殖土地面积少，可以减少对淡水资源及农耕地的需求，为蛋白质、碳水化合物及脂质的来源(贝克尔E.,作为蛋白质来源的微藻类,生物技术进展,2007,25:207-210(Becker E.,Micro-algae as a source of protein.,Biotechnology advances,2007,25:207-210))。

许多藻种生产脂质是以蓄积三酸甘油酯的形式为主，具有类似于植物油的脂肪酸的组成(甘斯顿F.,食品技术中的植物油：组成、特性及使用,约翰威利父子公司,2011(Gunstone F.,Vegetable oils in food technology:composition,properties anduses,John Wiley&Sons,2011)；及德拉埃斯马R.B.,等人,来自微藻类的食物商品,生物技术新见,2013,24:169-177(Draaisma R.B.,et al.,Food commodities frommicroalgae.,Current opinion in biotechnology,2013,24:169-177))，此外还能生产一些高价脂肪酸，例如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)(加席纳I.A.及哈伍德J.L.,藻类脂质及环境对其生物化学的影响,水生生态系统中的脂质,施普林格,纽约,2009,1-24(Guschina I.A.&HarwoodJ.L.,Algal lipids and effect of the environment on their biochemistry.,Lipidsin aquatic ecosystems,Springer,New York,2009,1-24)；及穆赫耳罗斯A.,等人,脂质代谢在海藻类中的路径，用于增强EPA及DHA在假菌界物种中的产生的共表达网络、瓶颈及候选基因,海洋药物,2013,11:4662-4697(Mühlroth A.,et al.,Pathways of lipidmetabolism in marine algae,co-expression network,bottlenecks and candidategenes for enhanced production of EPA and DHA in species of Chromista.,Marinedrugs,2013,11:4662-4697))。在不利的生长条件下，例如氮剥夺时，微藻所大量蓄积的脂质约可占藻体干重20-60％(w/w)(格里菲思M.J.及哈里森S.T.,作为选择用于生质柴油产生的藻类物种的重要特征的脂质产率,应用藻类学杂志,2009,21:493-507(GriffithsM.J.&Harrison S.T.,Lipid productivity as a key characteristic for choosingalgal species for biodiesel production.,Journal of Applied Phycology,2009,21:493-507))。另，部分微藻能生成人体必需脂肪酸，包括n6系列的亚麻油酸(C18:2)及n3系列的次亚麻油酸(C18:3)(朗I.,等人,脂肪酸谱及其在微藻类中的分布型式：来自SAG培养物保藏中心的多于2000种品系的全面分析,BMC植物生物学,2011,11:124(Lang I.,et al.,Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae:acomprehensive analysis of more than 2000strains from the SAG culturecollection.,BMC plant biology,2011,11:124))。美国一家以藻类合成生质油的生物科技公司太阳酵素(Solazyme)于2013年通过美国FDA对于其藻油产品GRAS的认证(FDA U.RE:High Lipid Chlorella protothecoides S106Flour GRAS 2013.)，说明藻油能够运用于日常烹调与烘焙中，故微藻可说是生产天然食用油于日常烹饪及保健品的最优选地选择。惟，生产 植物油的成本相对较为低廉，市场价格约在0.50-1.00欧元/千克(即17.9～35.9元台币/千克)，而微藻油脂的生产成本，目前估计约为8.30欧元/千克(即298元台币/千克)(穆赫耳罗斯A.,等人,脂质代谢在海藻类中的路径，用于增强EPA及DHA在假菌界物种中的产生的共表达网络、瓶颈及候选基因,海洋药物,2013,11:4662-4697)。因此，在进入食品市场之前仍须大幅降低其生产成本，否则难与其它油品竞争，且势必更难与价格更低的燃料用油竞争(契斯堤Y.,藻类燃料商业化的限制,生物技术杂志,2013；167:201-214(ChistiY.,Constraints to commercialization of algal fuels.,Journal of biotechnology,2013；167:201-214))。故而使得以微藻生产食用油成为以微藻生产燃料油的一个过渡目标，亦即可从微藻生产食用油的过程中，以较能获利的副产品，例如色素、蛋白质和长链ω-3多不饱和脂肪酸(维费尔斯R.H.,巴尔沃萨M.J.及艾平克M.H.,用于产生大量化学物质及生物燃料的微藻类,生物燃料、生物产品及生物炼制,2010,4:287-295(Wijffels R.H.,Barbosa M.J.&Eppink M.H.,Microalgae for the production of bulk chemicals andbiofuels.,Biofuels,Bioproducts and Biorefining,2010,4:287-295))，来逐步降低其制造成本，以实现未来微藻燃油的商品化。

人类文明发展活动，例如燃烧化石燃料、毁林及能源生产，进而造成大量的温室气体排放。美国环保局(USEPA)指出，能源生产及消费主要来自交通运输，从1990年开始到2010年，因交通运输所产生的温室气体占全球温室气体排放量已增加了35％，其中光是2010年一整年交通运输所产生的温室气体排放量就占全年温室气体排放量的71％(沃尔班克斯T.J.,等人,气候变化及基础设施，城市系统及缺陷.支持国家气候评估的美国能源部的技术报告.,岛屿出版社,2014(Wilbanks T.J.,et al.,Climate Change andInfrastructure,Urban Systems,and Vulnerabilities.Technical Report for the USDepartment of Energy in Support of the National Climate Assessment.,IslandPress,2014))。自18世纪工业革命到2013年以来，二氧化碳在大气中的浓度已从280ppm上升到390ppm(拉赫曼M.S.A.,等人,通过膜整合的微藻类培养方法的二氧化碳捕获和利用的综述,可再生及可持续能源综述,2011,15:4002-4012(Rahaman M.S.A.,et al.,A reviewof carbon dioxide capture and utilization by membrane integrated microalgalcultivation processes.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2011,15:4002-4012)；及辛格U.B.及阿卢瓦利亚A.,微藻类：用于碳封存的有前景的工具,全球变化的缓和及适应策略,2013,18:73-95(Singh U.B.&Ahluwalia A.,Microalgae:a promising toolfor carbon sequestration.,Mitigation and Adaptation Strategies for GlobalChange,2013,18:73-95))。虽然地球上植物进行光合作用时需要二氧化碳，但二氧化碳可于大气中留存50-200年，而 不断增加的二氧化碳为造成温室效应的主要气体之一，目前已知造成全球暖化现象有52％归咎于大气中二氧化碳浓度升高所致(凡登亨得S.,佛法伦H.及布恩N.,烟气化合物及微藻类：产生生物技术机会的(生物)化学相互作用,生物技术进展,2012,30:1405-1424(Van Den Hende S.,Vervaeren H.&Boon N.,Flue gas compoundsand microalgae:(Bio-)chemical interactions leading to biotechnologicalopportunities.,Biotechnology advances,2012,30:1405-1424)；及沃尔班克斯T.J.,等人,气候变化及基础设施，城市系统及缺陷.支持国家气候评估的美国能源部的技术报告.,岛屿出版社,2014)。温室效应所造成的全球暖化已引起全球关注，因而提出以微藻为基础的二氧化碳封存，旨在降低大气中二氧化碳浓度以减少温室效应。

陆生植物估计只能削减约3-6％全球二氧化碳排放量(胡S.H.,等人,微藻类CO₂-减排系统的前景—综述,生物技术进展,2011,29:189-198(Ho S.H.,et al.,Perspectiveson microalgal CO₂-emission mitigation systems—a review.,Biotechnologyadvances,2011,29:189-198)；及高C.Y.,等人,利用工业烟气中的二氧化碳培养微藻类小球藻属,生物资源技术,2014,166:485-493(Kao C.Y.,et al.,Utilization of carbondioxide in industrial flue gases for the cultivation of microalga Chlorellasp.,Bioresource technology,2014,166:485-493))，而微藻固定二氧化碳的效率是陆生植物的10-50倍(拉姆M.K.,李K.T.及穆罕默德A.R.,关于基于微藻类的碳捕获的目前状况和挑战,国际温室气体控制杂志,2012,10:456-469(Lam M.K.,Lee K.T.&Mohamed A.R.,Current status and challenges on microalgae-based carbon capture.,International Journal of Greenhouse Gas Control,2012,10:456-469)；及成J.,等人,通过在连续生物反应器中使小球藻PY-ZU1培养条件最优选地化来改进CO₂固定效率,生物资源技术,2013,144:321-327(Cheng J.,et al.,Improving CO₂fixation efficiency byoptimizing Chlorella PY-ZU1culture conditions in sequential bioreactors.,Bioresource technology,2013,144:321-327))。微藻每产生1千克微藻生物质约可固定1.83千克的二氧化碳(江Y.,等人,将模拟烟气用于培养二形栅藻,生物资源技术,2013,128:359-364(Jiang Y.,et al.,Utilization of simulated flue gas for cultivationof Scenedesmus dimorphus.,Bioresource technology,2013,128:359-364))。由于微藻进行光合作用时转化二氧化碳的效率高，故除了可捕捉大气中的二氧化碳，还可直接引用含有二氧化碳的工业废气进行培养，进而减少工业二氧化碳排放量(马埃达K.,等人,通过微藻类从燃煤火电厂的烟气固定CO₂,能量转换与管理,1995,36:717-720(Maeda K.,etal.,CO₂fixation from the flue gas on coal-fired thermal power plant bymicroalgae.,Energy Conversion and Management,1995,36:717-720)；及陶哈J.,斯特拉卡F.及利万斯基K.,在户外开放薄层光生物反应器中将烟气用于培养微藻类(小球藻属),应用藻类学杂志, 2005,17:403-412(Doucha J.,Straka F.&K.,Utilization offlue gas for cultivation of microalgae(Chlorella sp.)in an outdoor open thin-layer photobioreactor.,Journal of Applied Phycology,2005,17:403-412))。此外，微藻进行光合作用所产生的脂质等生物质产率高，可作为生产生质燃料如生质柴油、生物乙醇及生物氢等的原料，还可生产可再生能源及有价值的非燃料副产品(谢Y.P.,等人,使用重复分批补料培养策略用耐热Desmodesmus sp.F51同时增强CO₂固定及叶黄素产生,生物化学工程杂志,2014,86:33-40(Xie Y.P.,et al.,Simultaneous enhancement ofCO₂fixation and lutein production with thermo-tolerant Desmodesmussp.F51using a repeated fed-batch cultivation strategy.,BiochemicalEngineering Journal,2014,86:33-40))。因此，利用生长快速的微藻来固定二氧化碳，同时将其所产生的生物质转化为生质能源与燃料，已被视为最有前景的能源替代方案。

发明内容

本发明是于花莲富里采集到含栅藻的样品后，以C培养基进行栅藻的培养与分离，选取出可产生藻油，且经鉴定为Desmodesmus sp.的C71藻株，经藻油含量、脂肪酸图谱、油脂组成以及二氧化碳固定等分析，发现所述C71藻株可作为再生能源产业与二氧化碳减量应用的潜力藻种。

本发明的一个目的是在于提供一种栅藻分离株，所述栅藻分离株的培养物可用作生产健康油脂及生质柴油的原料，并可固定二氧化碳作为减碳的工具。

本发明的另一目的是在于提供一种培养所述栅藻分离株以获得栅藻培养产物的方法。

本发明的另一目的是在于提供一种由上述方法所获得的栅藻培养产物。

本发明的另一目的是在于提供一种由上述栅藻培养产物获得三酸甘油酯及/或脂肪酸的方法。

本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的及优点可易见于本发明的实施方式及权利要求书中。

附图说明

图1为C71藻株的显微镜检图。图1A为明视野观察，细胞为圆球状，直径约为4～7μm，显微倍率1,000X；图1B为以尼罗红(Nile Red)染色，以荧光显微镜观察，藻体内部有橘黄色的油滴分布，显微倍率1,000X。

图2为C71藻株的18S rDNA及ITS全长序列的亲源树形图。

图3为以C培养基为基础，C71藻株在不同培养温度(20℃、30℃及40℃)下的生长结果。

图4为C71藻株在含有不同盐度(0％(w/w)、1.5％(w/w)及3％(w/w))的C培养基中的生长结果。

图5为C71藻株在含有不同pH值(pH4、pH7及pH9)的C培养基中的生长结果。

图6为C71藻株在不同二氧化碳浓度(0.04％(v/v)及5％(v/v))下的生长曲线。

图7为C71藻株在不同二氧化碳浓度(0.04％(v/v)及5％(v/v))下的生物质产率。

具体实施方式

本发明可通过下述实施方式中所公开的各个发明方面、实施例及表列的相关叙述所了解。除非在本文中另作定义，否则与本发明关联使用的术语(包含技术及科学术语)应具有本发明所属技术领域的技术人员所了解的含义。且当可了解，除非本文中提供的定义另作说明，在任何潜在歧义的情况下，术语的定义应与所述普遍使用的术语(如词典中所定义)一致。可进一步了解，本案所使用的术语仅用作描述特定实施方面的目的，而非用于限定。

必须注意的是，除非有清楚的相反指示，于说明书或权利要求书使用的单数格式“一种”及“所述”还包含复数表示。因此，除非上下文另有需要，单数术语应包含复数，而复数术语还包含单数。

本发明的范围以“自一“约”特定数值及/或到另一“约”特定数值”表示。当范围由上述方式表示时，其包含自一特定数值及/或到另一特定数值的范围。同样地，当数值可通过术语“约”以表示近似值，将可了解其为一特定值的另一个方面。可进一步了解，当提及有关其它端点及其它端点本身而言，每一范围的两端点都为有意义的。根据本发明，“约”可表示±20％，优选地为±10％，更优选地为±5％。

于本发明中，术语“经分离”或“分离”意谓使物质自其原始环境(如果天然存在那么为天然环境)中移出。术语“经分离”或“分离”并不一定指物质经纯化者。

本发明的目的一在于提供一种栅藻分离株，其包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少95％相似度的ITS区域序列，且与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有至少95％相似度的18S rDNA区域序列。换句话说，所述栅藻分离株中的ITS区域序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似度，且18S rDNA序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％ 或100％的相似度。

两个核酸序列间的差异可出现于参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处，或个别散布于参考序列中的核苷酸当中，或散布于参考序列内的一或多个邻近基团中的那些末端位置之间的任何地方。任何特定核酸分子是否与参考核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相似是指使用所属领域中所熟知的标准算法在两个分子之间所进行的比较，且可常规使用公开可用的计算机程序(如BLASTN算法)来判定。

于本发明的一个优选实施方面中，所述栅藻分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016153的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016153的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

上述“变异株”意谓涵盖全体细胞遗传组成已通过如化学突变诱发、自发突变、遗传工程、转化或转染而改变，以致影响其物理或生物化学特性的任何栅藻株。然而，所述变异株应具有保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016153的藻株的所有识别特征。

本发明的另一目的在于提供一种制备栅藻培养产物的方法，其包含将本发明的栅藻分离株接种于pH为约pH6到约pH10的液态培养基中，在温度约15℃到约40℃、照光、通气及以通气导入含有二氧化碳浓度为约0.04％(v/v)到约20％(v/v)的空气下进行培养以获得所述培养产物。本发明还提供由上述方法所获得的培养产物。

本发明中所述用于培养栅藻分离株的“培养基”可为任何容许栅藻分离株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸的培养基，例如C培养基[每100mL中包含15mg Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg-20mg KNO₃、5mgβ-甘油磷酸二钠·5H₂O、4mg MgSO₄·7H₂O、0.01μg维生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺HCl、0.3mL PIV微量元素溶液(每100mL中包含100mgNa₂EDTA·2H₂O、19.6mg FeCl₃·6H₂O、3.6mg MnCl₂·4H₂O、1.04mg ZnCl₂、0.4μg CoCl₂·6H₂O、0.25μg Na₂MoO₄·2H₂O及水)、50mg三羟甲基氨基甲烷(Tris)及水]、BG-11培养基[每100mL包含1,500mg NaNO₃、40mg K₂HPO₄、75mg MgSO₄·7H₂O、27.18mg CaCl₂、6mg柠檬酸、6mg柠檬酸铁铵、1mg Na₂·Mg·EDTA·2H₂O、20mg Na₂CO₃、2.86mg HBO₃、1.181mg MnCl₂·4H₂O、0.222mg ZnSO₄·7H₂O、0.39mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.0718mg CuSO₄·5H₂O、0.049mg Co(NO₃)₂·6H₂O及水]，以及MA培养基[每100mL中包含10mg Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg KNO₃、5mg NaNO₃、4mgNa₂SO₄、5mg MgCl₂·6H₂O、10mgβ-甘油磷酸二钠·5H₂O、0.5mg Na₂EDTA·2H₂O、0.05mgFeCl₃·6H₂O、0.5mg MnCl₂·4H₂O、0.05mg ZnCl₂、0.5mg CoCl₂·6H₂O、0.08mg Na₂MoO₄·2H₂O、2mg H₃BO₃及50mg N-二甘氨酸(Bicine)]。

本发明中用于培养栅藻分离株的条件意指如培养基的pH值、培养温度、照光、二氧化碳浓度及培养时间等条件，其可容许所述栅藻分离株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸。本技术领域的人士可根据既有知识针对培养基的成分及培养条件作调整。

于本发明的实施方面中，其栅藻培养基的pH值可为约pH6、约pH6.5、约pH7、约pH7.5、约pH8、约pH8.5、约pH9、约pH9.5或约pH10，优选地为约pH7到约pH9。

于本发明的实施方面中，其栅藻培养温度可为约15℃到约40℃，优选地为约20℃到约30℃；且照光量可为约100lux到约4,000lux，优选地为约2,000lux。

本文中所谓“通气”意旨于液体培养基中持续地通入含有二氧化碳的空气，而通气量可为约0.05vvm到约1vvm，优选地为约0.1vvm到约0.5vvm，最优选地为约0.1vvm。所述空气中的二氧化碳的浓度可为约0.04％(v/v)到约20％(v/v)，优选地为约0.1％(v/v)到约15％(v/v)，更优选地为约5％(v/v)到约10％(v/v)。于本发明的实施方面中，通气中的二氧化碳浓度可为约0.04％(v/v)、约0.1％(v/v)、约0.5％(v/v)、约1％(v/v)、约2％(v/v)、约3％(v/v)、约4％(v/v)、约5％(v/v)、约6％(v/v)、约7％(v/v)、约8％(v/v)、约9％(v/v)、约10％(v/v)、约11％(v/v)、约12％(v/v)、约13％(v/v)、约14％(v/v)、约15％(v/v)、约16％(v/v)、约17％(v/v)、约18％(v/v)、约19％(v/v)或约20％(v/v)。

在本发明的另一实施方面中，可视需要调整栅藻培养基的盐度。本文中所谓“盐度”意旨溶解于培养基中的盐类含量。本发明中栅藻培养基的盐度可为0％(w/w)、0％(w/w)到约0.5％(w/w)、约0.5％(w/w)到约1％(w/w)或约0.5％(w/w)到约1.5％(w/w)。

本发明制备栅藻培养产物的方法中，可视需要包含分离所述培养产物的步骤，而所述分离步骤可为如离心及/或过滤等常规的方法步骤。

由于本发明的栅藻培养产物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，故可用作获得三酸甘油酯及/或脂肪酸的原料，进而分别用于制作健康油脂及/或生质燃料。

本文中的“三酸甘油酯”意旨具有1个甘油分子及3个脂肪酸分子的酯类化合物，其中所述3个脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相异的碳数及不饱和键。

本文中的“脂肪酸”意旨具有8到30个碳原子及0到6个不饱和键的羧酸化合物，其优选地为具有12到20个碳原子及0到5个不饱和键的羧酸化合物，更优选地为具有16到18个碳原子及0到3个不饱和键的羧酸化合物。

三酸甘油酯及脂肪酸的获得可使用本技术领域所熟知的任何萃取及分离方法，例如福尔奇(Folch)等人(生物化学杂志(The Journal of biological Chemistry),1956,23:497-509)、巴拉苏布拉马连(Balasubramanian)等人(生物资源技术,2011,102:3396-3403)及萨迦拉塔(Sajilata)等人(食品工程杂志(Journal of Food Engineering),2008,84:321– 326)的方法。简而言之，所述方法可包含将栅藻细胞以如研磨法或超音波法等方式击碎，通过适当的溶剂萃取栅藻细胞中的三酸甘油酯及/或脂肪酸，再通过如HPLC及/或离子交换树脂的技术获得三酸甘油酯及/或脂肪酸。

本文所述的所有公开案、专利及专利文献均以全文引用的方式并入本文中。

提供以下实例以辅助所属领域的技术人员实施本发明。即使如此，不应将所述实例视为本发明的限制，因为本发明所属技术领域的技术人员在不背离本发明的精神或范围的情况下对本文所讨论的实施例进行的修改及变化，而仍属于本发明的范围。

实施例

材料与方法

1.C培养基

依序加入Ca(NO₃)₂·4H₂O 15mg、KNO₃ 10mg、β-甘油磷酸二钠·5H₂O 5mg、MgSO₄·7H₂O 4mg、维生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺HCl 1μg、PIV金属0.3mL与Tris50mg，随后将其体积补水到100mL，调整pH到7.5后进行高压灭菌。如果为1.5％(w/v)洋菜固体培养基那么需加入15g的洋菜胶一同灭菌。

PIV金属的配制为依序加入Na₂EDTA·2H₂O 100mg、FeCl₃·6H₂O 19.6mg、MnCl₂·4H₂O 3.6mg、ZnCl₂ 1.04mg、CoCl₂·6H₂O 0.4μg与Na₂MoO₄·2H₂O 0.25μg，随后将其体积补水到100mL后进行高压灭菌。

2藻样采集、分离与培养

将台湾花莲富里的有机稻田的水样品与土壤样品均匀混合后，取约10mL置于50mL的离心管中，加入约30mL C培养基，于25℃照光培养。培养期间以显微镜观察是否有藻体生长，之后取出适量含藻体的培养液，将其转到平板培养基，于25℃照光培养。待藻体生长后取单一藻种将其于平板培养基中涂开，以上步骤需重复到筛到单一藻体为止。平板培养则取单一藻落涂到C培养基平板上，于25℃照光培养。

3.油脂染色分析

将培养好的藻体取20μL与1μL尼罗红(于二甲基亚砜中0.1mg/mL)混合以进行油滴染色，染色后于室温静置5分钟，再利用荧光显微镜进行观察。(陈,W.等人,用于定量测量微藻类中的中性脂质的高产量尼罗红方法,微生物学方法杂志,2009,77:41–47(Chen,W.etal.,A high throughput Nile Red method for quantitative measurement of neutrallipids in microalgae.,Journal of Microbiological Methods,2009,77:41–47)及黄,G.H.,等人,基于尼罗红荧光在藻类中产生脂质的快速筛选方法,生物质与生物能源,2009,33:1386-1392(Huang,G.H.,et al.,Rapid screening method for lipid production inalga based on Nile Red fluorescence.,Biomass and bioenergy,2009,33:1386-1392))。

4.藻种的分子鉴定

4.1藻体基因体(genomic)DNA的抽取

自平板刮取下新鲜培养的藻体，将其收集在2mL微量离心管中，依照ZYMORESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM试剂盒说明书操作取得基因体DNA，并以NanoDrop(ND-1000分光亮度计)检测DNA的浓度。

4.2PCR增幅

将藻体基因体DNA作为PCR模板，以18S rRNA与ITS区域(包含18S核糖体RNA的后端、内转录间隔区1、5.8S核糖体RNA、内转录间隔区2与28S核糖体RNA的前端等序列)的相关引物组(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)来增幅其基因片段。PCR反应溶液如下：适量的基因体DNA溶液作为PCR模板、10mM dNTP 8μL、10X PCR缓冲液10μL、5′端引物与3′端引物各10pmole及Taq酵素5U。PCR反应条件为95℃，3分钟；(95℃，30秒、50℃，30秒、72℃，2分钟30秒)共30次循环；72℃，10分钟；最后保持在4℃。取5μL产物进行电泳跑胶分析。

4.3定序分析

将PCR产物纯化后以适当引物(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)进行定序，将序列结果以Vector NTI Suite 10软件(VNTI)与NCBI/Blastn进行序列重组与序列相似性比对分析。另，分别将定序所得的结果经NCBI/Blastn后所得相近的藻株还有藻属，以及数个藻种中心较接近的藻珠及藻属列为比较范围，以MEGA 6.0做比对，接着利用最大似然估计(Maximum Likelyhood)以GTR+G+I的方式绘制演化树，Bootstrap则为100次。

5.藻体分析

5.1藻体含油量分析

C71藻株以800mL C培养基培养于1L血清瓶中，并通入无菌空气，于30℃照光培养一个月。收集藻体后将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法参考修饰福尔奇等人的方法(福尔奇,J.等人,从动物组织分离及纯化总脂质的简单方法,生物化学杂志,1957,23:497-509(Folch,J.et al.,A simple method for the isolationand purification of total lipids from animal tissue.,The Journal ofbiological Chemistry,1957,23:497-509))来进行，其过程为取30mg冷冻干燥的藻粉(A值)到2mL微量离心管，加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)与适量大颗玻璃珠，以撞击式细胞破碎仪(MM400)振荡约5分钟，重复两次。以10,000rpm离心5分钟后，取上清液到抛弃式15 mL离心管中，随即于2mL微量离心管内加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)，再以超音波振荡与离心，取上清液到抛弃式15mL离心管中，直到萃取液无色为止。于装有萃取液的15mL离心管中加入等体积的145mM NaCl溶液后，以摩天轮混和均匀后，经4,500rpm离心10分钟，以玻璃吸管取下层液体到已秤重的玻璃瓶(B值)中。将此玻璃瓶内液体隔夜风干再秤重(C值)，计算藻干含油量的百分比(D值)。藻干含油量计算公式:(C-B)/A×100＝D％。

5.2油脂组成分析

将抽取的藻油样品以HPLC分析其油脂组成，HPLC分析条件：分离管柱为德国默克(Merck)公司制造的硅胶(Silica gel)(4.6mm id×250mm,颗粒大小5μm)；冲提溶剂A为己烷；冲提溶剂B为己烷/乙酸乙酯/异丙醇(80：10：10(v/v))，在0分钟溶剂A/B为98：2(v/v)，在8分钟线性增加到溶剂A/B为50：50(v/v)，在8.5分钟线性增加到溶剂A/B为2：98(v/v)，15分钟维持相同梯度，20分钟线性减少至溶剂A/B为98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector；ELSD)条件：气体流量2.6L/min；蒸发器温度为40℃(詹国靖等人，以甘油与植物油利用脂解酶的转酯化反应生产1,3-双酰甘油。台湾农业化学与食品科学，2010，45:19-25)。

5.3脂肪酸图谱分析

刮取适量干燥藻体置于玻璃试管中，加入1mL溶液I(NaOH 45g、甲醇150mL及ddH₂O150mL)，震散藻体。于100℃加热5分钟，再将所有藻体震散，继续加热25分钟。加入2mL溶液II(6N HCl 325mL及甲醇200mL)，于80℃加热10分钟，完成后迅速冷却。加入1.25mL溶液III(己烷200mL、三级丁基甲基醚200mL)，缓慢混合10分钟，以玻璃吸管尖吸取下层液体并丢弃。将上层液体加入3mL溶液IV(NaOH 10.8g及ddH₂O 900mL)，混合5分钟后，吸取上层液体以GC/MS(HP 5973GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法参考2007年巴伦西亚(Valencia),I.等人的方法(巴伦西亚,I.等人,用油从微藻类裂殖壶菌属产生富含二十二碳六烯酸的干燥发酵香肠：对营养特性、感觉质量及氧化稳定性的影响,食物化学,2007,104:1087-1096(Valencia,I.et al.,Development of dry fermented sausages rich indocosahexaenoic acid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.:Influence on nutritional properties,sensorial quality and oxidationstability.,Food Chemistry,2007,104:1087-1096))，GC/Mass分析条件为：毛细管管柱:SP-2560，75m×0.18mm I.D.，0.14μm；注入口温度:Inj,250℃；离子源温度:FID,250℃；管柱烘箱温度:起始温度140℃，保持5分钟后以4℃/min的升温速率升温到240℃，保持2分钟；载送气体：He；管柱流量:40cm/sec，在175℃下；注射:1μL； 分裂比:1/100；脂肪酸标准品:37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))。设定好条件后，先分析标准品确认图谱正确后再进行样品分析。分析完成的结果整理在表格中以方便比对。

6.藻种培养特性分析

6.1培养温度

藻体均匀涂布于C培养基平板上，放入含10％(v/v)二氧化碳的密封袋中，以20℃、30℃与40℃进行照光培养，之后于培养第1天与第14天观察藻体生长情形。

6.2培养盐度

以C培养基作为基础，分别制作含有0％(w/w)、1.5％(w/w)及3％(w/w)的盐度的培养基。作法为添加海水素并充分溶解后，以盐度计量测盐度，培养基再以高温高压灭菌后制成平板。将藻种均匀涂布于各盐度平板培养基上，以30℃进行照光培养，于培养第1天及第14天观察藻体生长情形。

6.3培养pH值

以C培养基作为基础，分别制作pH4、pH7及pH9的培养基。作法为以HCl调整到pH4，以NaOH调整到pH9，培养基以高温高压灭菌后制作平板。将藻种均匀涂布于不同pH值的平板培养基上，以30℃进行照光培养，于培养第1天及第14天观察藻体生长情形。

6.4固碳效率测定

C71藻株于二氧化碳固碳筛选平台上，以体积为1L的C培养基(KNO₃的总添加量为20mg，使其含氮量为原培养基的2倍)，在30℃全日照光条件下进行监测。固碳筛选平台以通气量为0.1vvm持续通入5％(v/v)二氧化碳到潜力藻株藻液中，再利用二氧化碳自动监测系统持续监测进流及出流的二氧化碳浓度(浓度单位为％，1％＝10,000ppm)，经由气体浓度转换公式的计算将二氧化碳浓度单位转换为毫克/立方米，计算每日固定二氧化碳毫克数(亚-军H.,关于氮氧化物(NO_X)的浓度单位ppm与mg/m³之间的转换的简要论述,四川环境,2010,29(1):24-46(Ya-jun H.,Brief Discussion on Conversion Coefficient betweenthe Concentration Units ppm and mg/m³of Nitrogen Oxides(NO_X).,SichuanEnvironment,2010,29(1):24-46))。

二氧化碳气体浓度转换的计算公式：

浓度(mg/m³)＝浓度(ppm)×(分子量/22.4)×[273/(273+t)]

分子量(二氧化碳)：44.01

t：测定温度(30℃)

固碳效率计算公式：

R＝(C_in–C_out)×V×Q×T

R：每日固定毫克数(mg)

V：栅藻培养体积(m³)

Q：气体通气量(vvm，volume per volume per minute)

T：每日通气时间(min)

C_in：二氧化碳进流浓度(mg/m³)

C_out：二氧化碳出流浓度(mg/m³)

6.5二氧化碳浓度

将C71藻株的藻液添加到1L含C培养基的培养瓶中，再以0.1vvm的条件，分别通入空气(0.04％(v/v)二氧化碳)及5％(v/v)二氧化碳气体，在30℃下照光培养，比较在不同二氧化碳浓度下，藻体干重变化及藻株生长的差异。藻体干重的量测：取定量的藻液，以干燥后已秤重的0.45μm的硝酸纤维滤纸进行抽气过滤后，以10mL的去离子水洗去藻体残留的盐类，再以80℃烘干藻体及滤纸5小时，置于干燥箱中回温，待回复至室温后秤重，扣除滤纸重量后记录藻体干重(DW)，记录后可计算生物质产率及藻体产量。

生物质产率(毫克/升/天)＝[藻体干重DW_F(mg)–藻体干重DW_I(mg)]×养殖体积(mL)/过滤藻液体积(mL)/养殖时间(天)

DW_F：培养后藻体干重

DW_I：培养前藻体干重

实例一、藻株鉴定

于台湾花莲富里的有机稻田土壤与水样样品中，分离纯化得到藻株C71。以1,000X显微镜观察，此藻株以非群聚的单一藻体存在，细胞为圆球状，直径约为4～7μm(图1A)，经尼罗红染色后，以荧光显微镜观察到藻体内部有大量明显且呈现橘黄色的油滴分布，显示其藻体内可以蓄积油滴(图1B)。

将C71藻株的ITS序列(SEQ ID NO:1)和NCBI的nr数据库比对后，发现与3株藻株Desmodesmus sp.AKS-13(保藏编号KF537774)、Desmodesmus sp.GM4j(保藏编号AB917137)及Desmodesmus sp.GM4c(保藏编号AB917130)具有高达99％以上的覆盖率(coverage)及相似度，显示C71藻株属于Desmodesmus属。进一步分析C71藻株的18S rDNA序列(SEQ ID NO:2)，并与Desmodesmus sp.GM4j或Desmodesmus sp.GM4c进行比对，发现仅具有84％的覆盖率，其中仅1,043bp与前述两种藻株具有99％的相似度，其余相似度最高为91％。由于Desmodesmus sp.GM4j或Desmodesmus sp.GM4c的18S rDNA序列分别各含有2个内含子(intron)，其序列与相对应的C71藻株18S rDNA序列不同，故上述比对结果显示C71藻株与Desmodesmus sp.GM4j及Desmodesmus sp.GM4c为不同的藻种。

进一步以18S rDNA及ITS全长序列分析C71藻株与其它藻种的亲源关系，结果显示C71藻株的18S rDNA及ITS全长序列与Desmodesmus sp.GM4j及Desmodesmus sp.GM4c等藻种最为接近(图2)。由于C71藻株的形态与Desmodesmus sp.GM4j相似(保科R.,微生物绿藻的私有收集的DNA分析有助于更好地理解微生物多样性,BMC研究纪要,2014,7:592(Hoshina R.,DNA analyses of a private collection of microbial green algaecontribute to a better understanding of microbial diversity.,BMC researchnotes,2014,7:592))，因此综合其形态与分子鉴定的结果，C71藻株应属于Desmodesmussp.，且极可能为一新种，故命名为Desmodesmus sp.C71。

Desmodesmus sp.C71已于2016年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2016153。

实例二、C71藻株的油脂组成分析

将C71藻株以800mL C培养基培养于1L血清瓶中，并通入无菌空气，于30℃照光培养一个月。收集藻体后将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉萃取其油脂，发现其油脂含量占藻体干重的45％(w/w)，分析其油脂成分及含量，结果如下表一及表二所示。

表一

注:TG:三酸甘油酯(triacylglycerol)、FA:脂肪酸(fatty acid)、1,3-DAG:1,3-双酰基甘油酯(1,3-diacylglycerol)、1,2-DAG:1,2-双酰基甘油酯(1,2-diacylglycerol)、MAG:单酰基甘油酯(monoacylglycerol)

表二

注：DU：不饱和程度(Degree of Unsaturation)＝(单不饱和,w％+2(多不饱和,w％)(拉莫斯,M.J.,等人,原料的脂肪酸组成对生质柴油特性的影响.生物资源技术,2009,100:261-268(Ramos,M.J.,et al.,Influence of fatty acid composition of rawmaterials on biodiesel properties.Bioresour.Technol.,2009,100:261-268))

表一的结果显示，C71藻体中所含的油脂组成包含三酸甘油酯(TG)87.19％(w/w)、脂肪酸(FA)9.96％(w/w)、1,2-双酰基甘油酯(1,2-DAG)1.37％(w/w)及单酰基甘油酯(MAG)1.23％(w/w)，其中并未检测到含有1,3-双酰基甘油酯(1,3-DAG)。表二的结果显示，C71藻体中所含脂肪酸的组成，其中C16:0占16.8％(w/w)、C17:0占5.4％(w/w)、C18:1占2.6％(w/w)、C18:2占40.9％(w/w)及C18:3占27.9％(w/w)；饱和脂肪酸比例为22.2％(w/w)；单元不饱和脂肪酸比例为2.6％(w/w)；多元不饱和脂肪酸比例为68.8％(w/w)。又其C18:2为ω-6形式，C18:3为ω-3形式，都是属于食用油脂中对人体较好的多元不饱和脂肪酸。此外，经计算后，其不饱和程度(Dgree of Unsaturation)值为140.2，接近欧盟的生质柴油标准值。上述结果显示，C71藻株所含的油脂适合作为生质柴油的原料，且所含有的丰富多元不饱和脂肪酸，还可作为食用油的原料。

实例三、C71藻株培养特性分析

(1)培养温度测试

将藻体均匀涂布于C培养基平板上，将平板放入含10％(v/v)二氧化碳的密封袋中，分别以不同温度(20℃、30℃及40℃)进行照光培养，并于培养第1天与第14天观察藻体生长情形。结果显示C71藻株于20℃～40℃的培养温度下，藻体可持续生长，然而，于40℃的培养条件下，藻体生长情形较差(图3)。

(2)培养基盐度测试

将藻体分别均匀涂布于含有不同盐度(0％(w/w)、1.5％(w/w)及3％(w/w))的C培养基平板上，并于培养第1天与第14天观察C71藻株于不同盐度培养基中的生长状况。结果显示C71藻株在盐度0％(w/w)的C培养基中，其生长速率较在盐度1.5％(w/w)的培养基中快，而在盐度3％(w/w)的培养基中并未观察到有藻体生长的情形(图4)。根据上述结果显示，C71藻株适合生长在盐度为0％(w/w)的环境中，虽耐受于盐度1.5％(w/w)的培养环境，但其藻体生长速度较为缓慢。

(3)培养基pH值测试

将藻体分别均匀涂布于含有不同pH值(pH4、pH7及pH9)的C培养基平板上，并于培养第1天与第14天观察C71藻株于不同pH值培养基中的生长状况。结果显示C71藻株在pH7及pH9的培养基中生长情况良好，但在pH4的培养基中则未观察到有藻体生长的情形(图5)。根据上述结果，C71藻株适合生长在约pH7到pH9的环境中。

(4)固碳效率测试

在30℃全日照光条件下，将C71藻株培养于1L C培养基(KNO₃总添加量为20mg，使其含氮量为原培养基的2倍：)中，并持续通入通气量为0.1vvm的5％(v/v)二氧化碳气体，定时收取藻液及监测进流及出流的二氧化碳浓度(浓度单位为％，1％＝10,000ppm)。藻体经测定得其重量后，带入公式计算得到C71藻株的固碳效率为283.1±48.8mg/L/d。

(5)不同二氧化碳浓度对藻体生长的影响

将C71藻株的藻液添加到1L含C培养基的培养瓶中，再以0.1vvm的条件，分别通入空气(0.04％(v/v)二氧化碳)及5％(v/v)二氧化碳气体，在30℃下照光培养，并测量在不同二氧化碳浓度下的藻体干重及生长情况。结果显示培养于5％(v/v)二氧化碳中的C71藻株其藻体干重在第7天达到1,313mg/L，为培养于空气中的C71藻株第12天所达最高藻体干重(411mg/L)的3.2倍(图6)。此外，培养于5％(v/v)二氧化碳中的C71藻株在第7天的生物质产率可达176.19毫克/升/天，而培养于空气中的C71藻株则于第9天达到最高生物质产率63.80毫克/升/天(图7)。故相较于以空气培养，C71的藻液以5％(v/v)二氧化碳通气培养可显著增加其生物质产率达2.8倍，且还可缩短其培养时间。

结论

本发明首先发现经初步鉴定为Desmodesmus sp.的新颖栅藻分离株C71。此藻株可生长在温度约20℃到40℃、盐度0％(w/w)到1.5％(w/w)及pH值约7到约9的环境中，惟，在盐度1.5％(w/w)或温度40℃的环境下生长速度较为缓慢。其次，在空气培养条件下，其C71藻体含油量占藻体干重的45％(w/w)；油脂的脂肪酸组成以C16～C18脂肪酸为主，占总组成的88.2％(w/w)，其中C18:2(ω-6)及C18:3(ω-3)分别占40.9％(w/w)及27.9％(w/w)；脂肪酸DU值为140.2；固碳效率为283.1±48.8mg/L/d。进一步发现，相较于以空气培养，C71藻株在5％(v/v)二氧化碳的培养条件下，生长速度较快，且可产生较高的生物质产率。以上结果显示，C71藻株(Desmodesmus sp.)可作为生产生质柴油与食用油的原料，还可作为固碳的用，以减少二氧化碳的排放浓度。

Claims (16)

1.一种栅藻分离株，其包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少95％相似度的ITS区域序列，且与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有至少95％相似度的18S rDNA序列。

2.根据权利要求1所述的栅藻分离株，其中所述ITS区域序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，且所述18S rDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的栅藻分离株，所述栅藻分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016153的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016153的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

4.一种制备栅藻培养产物的方法，其包含将根据权利要求1到3中任一权利要求所述的栅藻分离株接种于pH值为约6到约10的液态培养基中，且在温度为约15℃到约40℃、照光及以通气导入含有二氧化碳浓度为约0.04％(v/v)到约20％(v/v)的空气下进行培养以获得所述培养产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述pH值为约7到约9。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述温度为约20℃到约30℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述二氧化碳浓度为约5％(v/v)到约10％(v/v)。

8.根据权利要求4所述的方法，其进一步包含分离所述培养产物的步骤。

9.根据权利要求4到7中任一权利要求所述的方法，其可用于固定二氧化碳。

10.一种栅藻培养产物，其可由权利要求4到8中任一权利要求所述的方法来获得。

11.根据权利要求10所述的栅藻培养产物，其可用于制备生质柴油。

12.根据权利要求10所述的栅藻培养产物，其可用于制备食用油。

13.一种制备三酸甘油酯及/或脂肪酸的方法，其包含自根据权利要求10所述的栅藻培养产物中分离出三酸甘油酯及/或脂肪酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述三酸甘油酯所含有的3个脂肪酸具有完全相同、部份相同或完全相异的碳数及不饱和键。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述脂肪酸具有8到30个碳原子及0到6个不饱和键。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述脂肪酸具有16到18个碳原子及0到3个不饱和键。