CN104004658A - 一株利用高浓度co2表现出异养生长特性的淡水小球藻 - Google Patents

一株利用高浓度co2表现出异养生长特性的淡水小球藻 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株利用高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻，其分类命名为小球藻(Chlorella sorokiniana)，菌株号CS-1，菌种保藏登记号为CGMCC No.9215，保藏日期为2014年5月5日。本发明还公开了上述小球藻在生产油脂中的应用。本发明可以高效固定废气环境中高浓度CO2从而降低微藻油脂的生产成本，为生物柴油制备提供了一株优良生产藻种。小球藻细胞在以高浓度CO2为底物时光能转化率增加并接近于化能转化率，使细胞呈现出部分异养生长特性，表现为通入高浓度CO2时小球藻比生长速率、油脂合成速率及能量利用效率显著增加，与小球藻在异养培养条件下时接近。

Description

一株利用高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种微藻，具体涉及一株利用高浓度CO2表现出部分异养生长特性的淡水小球藻。
背景技术
地球表面的光辐射密度约为985.7W/m2，而高等植物通过光合作用吸收的光能仅占太阳辐射能的0.2-2％，高等植物较低的光合效率致使大量太阳能的浪费。近年来，微藻因其具有光合效率高，细胞生长快，能够积累大量油脂并可转化为生物能源等优势而备受关注。尽管微藻的光合效率远远高于高等植物，然而其吸收的光能也仅占总太阳辐射能的6％，表明相对于巨大的太阳辐射能来说，光自养生物的光合效率仍然非常低，还有很大的上升空间。光合作用由光反应和暗反应组成，其中暗反应阶段可能是限制其光合效率的主要因素，因为空气中较低的CO2浓度导致有限的碳源供应使得暗反应缺乏足够的底物从而造成光合效率偏低。因此高浓度CO2的供应可能能够消除暗反应阶段底物限制进而提高光合效率。
异养生物能利用有机碳源直接将储存在有机物中的化学能转化为生物量和其它产物，因此其化学能的转化效率远远大于光合作用的光能转化率，表现为异养细胞生长速度快、生物产量大等特点。部分微藻也能够利用有机碳源进行异养生长，异养生长时它们也能够直接转化化学能，因此细胞密度和产物产量远远大于自养生长时，例如原始小球藻在以玉米粉水解液为碳源时，生物量和油脂含量能提高3～4倍。但是异养培养条件下有机物质的成本远远高于自养培养时，从而也限制了异养培养微藻生产生物柴油的发展。与此不同的是，微藻利用高浓度CO2的成本则较低，并且微藻可以利用烟道废气中高浓度的CO2快速生长并能积累更多的油脂，从而达到既可以降低工业废气中的CO2浓度又可以生产生物柴油的目的，特别值得一提的是微藻在生产生物燃料的同时还能够产生一些短链醇以及其它高价值的副产物，例如多不饱和脂肪酸、虾青素、β-胡萝卜素等，因此综合来说开发微藻产品具有非常深远的意义。
众所周知，近几年来由于化石燃料的过度燃烧产生了大量CO2，以及由此带来的温室效应已经对世界各国许多地区的自然生态系统产生了负面影响，甚至带来了不可修复的破坏，所以控制CO2的排放量已经成为全世界的责任。因而研究微藻高效固碳的能力不仅可以利用工业废气生产高附加值产品还可以缓解碳减排的压力。
微藻是到目前为止唯一一个可以利用高达20％甚至更高浓度CO2的物种，当通入高浓度CO2时，自养生长条件下，微藻的光合效率和油脂合成速率显著增加也暗示CO2到油脂的转化过程中，微藻的能量转化效率显著提高，即高浓度CO2显著增加微藻的能量利用率，可能与异养生长条件时相接近，但是目前还缺乏相关的证据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株淡水小球藻，该小球藻能够利用高浓度的CO2积累大量的生物量和油脂，并且最大比生长速率、平均日固碳率、光能转化率、碳油转化率显著提高与异养培养时接近，通入高浓度CO2时该藻株表现出部分异养生长特性，以解决当前微藻油脂生产成本过高和温室效应等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株利用高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻，其分类命名为小球藻(Chlorella sorokiniana)，菌株号CS-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。菌种保藏登记号为CGMCC No.9215，菌种保藏日期为2014年5月5日。
上述小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1是2010年7月从美国明尼苏达淡水样中分离筛选得到的一株淡水小球藻CS-1，该菌株为球形，直径在2-4μm之间，经形态学鉴定和18S rDNA扩增序列分析，确定该藻株为小球藻(Chlorella sorokiniana)。
本发明定义的高浓度CO2是指体积百分含量为0.5％～40％的CO2。
上述小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1能够固定0.5％～40％体积百分含量的CO2。
优选的，上述小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1能够固定1％～10％体积百分含量的CO2。
更优选的，上述小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1能够固定5％～10％体积百分含量的CO2。
上述小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1能够利用高浓度的CO2快速生长并表现出部分异养生长特性，即各项自养条件下的指标如生物量、油脂含量、最大比生长速率、倍增时间、日平均固碳率、能量-生物量转化率、能量产率、碳油转化率等参数指标接近异养条件下的指标，表现出异养特性。具体来说，Chlorella sorokiniana CS-1能以高浓度CO2(0.5％～40％)为碳源自养生长，也能以葡萄糖为碳源进行异养生长。当进行异养培养时，最优碳源和氮源浓度分别为葡萄糖16g·L-1、蛋白胨浓度6g·L-1，此时C.sorokiniana CS-1生物量和油脂含量最大为6.15g·L-1和33％。在自养培养条件下，C.sorokiniana CS-1能在高达40v/v％的CO2条件下生长，当通入5v/v％CO2时C.sorokinianaCS-1可获得最高的生物量和油脂含量，分别为3.3g·L-1和32％。
当通入5v/v％CO2时C.sorokiniana CS-1表现出部分异养生长特性，最大比生长速率和倍增时间分别为0.14h-1和4.9h接近以葡萄糖为碳源时的最大比生长速率和倍增时间。C.sorokiniana CS-1的日平均固碳率也从通入空气时的10.62mM·L-1·day-1增加至19.02mM·L-1·day-1，也与以葡萄糖为碳源时接近(35.29mM·L-1·day-1)；除此之外，5v/v％CO2使C.sorokiniana CS-1的能量-生物量转化率从通入空气时的0.0037g/kJ增加至0.0055g/kJ，能量产率从通入空气时的7.6％增加至12.2％，显著增加光能的转化效率；同时5v/v％CO2使C.sorokiniana CS-1的碳油转化率增加至40.8％，接近以葡萄糖为碳源时的碳油转化率(53.7％)，暗示当通入高浓度CO2与异养生长时都显著的改变了碳流的流动，使固定的碳更多地流向油脂合成途径，由此5v/v％CO2的自养培养使C.sorokiniana CS-1的能量转化效率与碳油转化率显著增加，表现出部分异养生长特性。
所述的小球藻最大比生长速率μmax和倍增时间td计算为：μmax为对数生长期的比生长速率，其中μ＝lnXt-lnX0/t-t0，此处Xt和X0分别为t和t0时的生物量(g·L-1)，td＝ln2/μmax。
所述的小球藻日平均固碳率FA＝(Xt-X0)mcbm V×(mCO2/mC)-1/t-t0，其中mcbm为小球藻中碳元素的含量，利用元素测定仪测定，V为工作液体积，mCO2和mC分别为CO2和C的分子量。
所述的小球藻能量-生物量转化率YX/Es定义为每供应1kJ的能量所生成的生物量，Es＝0.2176×Is×A，其中Is为入射光强度，A为光照面积。
所述的小球藻碳-油转化率定义为每摩尔固定的碳用于合成脂肪酸的量，计算公式为ηClipid/Ctotal＝(Σ(lipid yield×F/M)×N)/(X×C/Mc)，其中F为每种脂肪酸所占的比例，M为脂肪酸的分子量，N为脂肪酸中的碳原子个数，X为生物量，C为生物量中碳元素，Mc为碳元素的分子量。
利用上述高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻在生产油脂中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体的应用方式为：培养温度为25～30℃，光照强度2000～4000lux；向小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1通入体积百分含量为0.5％～40％的CO2，培养8～10天收获。
其中，所述的CO2的体积百分含量优选为1％～10％，更优选5％～10％，最优选5％。
具体的应用方式优选为：包括如下步骤：
(1)将培养至指数期的新鲜藻种CS-1以体积分数2％的接种量接种在相应的微藻培养液中，微藻培养液采用适宜的培养基成分，微藻细胞接种于三角烧瓶中，在适宜的光照强度和温度下培养，培养过程中连续不断地充入无菌CO2，至微藻细胞增殖到最大密度的稳定期，一般需要8～10天采收藻细胞，藻液离心浓缩，用去离子水洗涤、离心，去除微藻细胞培养液，制备成无培养液的湿藻，作为萃取油脂之用。
(2)采用常规的酸热萃取法测定步骤(1)中所得藻细胞的油脂含量，即在所得的湿藻中加入浓盐酸(质量浓度36％-38％)，在70℃水浴中放置20min，再加入无水乙醇，冷却，加入乙醚a，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入乙醚b，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油；所述浓盐酸、无水乙醇、乙醚a、乙醚b的体积用量分别为5mL、5mL、10mL、5mL。基于藻样品干重，微藻细胞油脂含量表达为mg·g-1dw，即微藻油脂含量(％)＝油脂重量/微藻干品重量*100。
藻油的甲酯化：将所得到的藻油用CHCl3溶解，转入1.5mL Agilent(安捷伦)玻璃瓶中，加入1mL 1M的硫酸甲醇溶液，充N2密封，于100℃反应1h，自然冷却，加入200μL去离子水，混匀，用200μL正己烷萃取3次，合并有机相，用200μL去离子水反萃取洗涤3次，取有机相，转入1.5mL Agilent玻璃瓶中，N2吹干，称重。
气相色谱定量分析：采用Agilent公司生产的7890型气相色谱仪(GC)对甲酯化后微藻油脂中的脂肪酸甲酯进行定量分析。
GC分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.50μm)。柱升温程序：从50℃升至200℃，保持5min；然后以10℃/min升至250℃，保持3min。载气：氮气；流量：3mL/min。检测器：氢火焰检测器，氢气：30mL/min；空气：300mL/min。进样口温度：280℃；检测器温度300℃。
进一步，步骤(1)所述适宜培养基为去除碳源的BG-11培养基，BG-11培养基的配方(每升)如下：1500mg NaNO3、40mg K2HPO4·3H2O、75mg MgSO4·7H2O、36mgCaCl2·7H2O、1mL微量元素溶液A5。微量元素溶液A5配方(每升)如下：2860mg H3BO4、1810mg MnCl2·4H2O、222mg ZnSO4、391mg Na2MoO4、79mg CuSO4·5H2O、49.47mgCo(NO3)2·6H2O，pH值为7-8。
进一步，步骤(1)所述充入的无菌CO2体积含量为0.5％-40.0％。
进一步，步骤(1)所述的培养温度优选为25～30℃。
进一步，步骤(1)所述的培养光照强度优选为2000～4000lux。
进一步，培养体积为150mL，培养瓶体积为250mL。
进一步，步骤(2)所述微藻干品重量是指用于提油的微藻藻粉质量，通过血球计数板在显微镜(40×10)下测量藻细胞个数，每组测量3次，取平均值，可以判断微藻的生长状况，待微藻生长至稳定期，将藻细胞摇匀，取10mL藻液8000rpm离心3min，去除培养液，将所获得的藻泥在70℃下干燥12h，获得微藻干品，得到每mL藻液中微藻干品质量，表达为mg/mL，即用于提油的微藻干品质量(mg)＝每mL藻液中微藻干品质量*用于提油的微藻藻液体积。
本发明所述乙醚a和乙醚b均为乙醚，为便于区分不同步骤加入乙醚量不同而命名，字母本身无含义。
上述高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1在生产α-亚麻酸中的应用也在本发明的保护范围内。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)应用潜力好：小球藻细胞在以高浓度CO2为底物时光能转化率增加并接近于化能转化率，使细胞呈现出部分异养生长特性，表现为通入高浓度CO2时小球藻比生长速率、油脂合成速率及能量利用效率显著增加，与小球藻在异养培养条件下时接近，能够直接运用于工厂污水处理以及生物柴油生产。
(2)产率高：本发明所提供的小球藻，能够利用高浓度的CO2快速生长积累油脂，培养周期为8～10天，在适宜的CO2浓度下所得的生物量和油脂含量分别达到3300mg以及32％。微藻油脂得率和培养周期都远优于目前报道的其它小球藻。
(3)副产品经济价值高：小球藻在利用高浓度CO2快速生长积累油脂，表现出异养特性的同时，能够积累高浓度的α-亚麻酸，在提取油脂的同时加以利用，可以提高经济效益。
附图说明
图1为基于18SrDNA部分序列构建的系统发育树。
图2表示通入不同浓度CO2进行培养，C.sorokiniana CS-1的生物量随时间的变化。
其中，横坐标为培养时间，纵坐标为小球藻的生物量，用藻细胞的干重来表示，表示不充入CO2，表示充入1v/v％的CO2，表示充入2v/v％的CO2，表示充入5v/v％的CO2，加入葡萄糖进行完全异养培养。数据为3次平行取样的平均值。
图3表示通入不同浓度CO2进行培养，C.sorokiniana CS-1的生长速率随时间的变化。
其中，横坐标为培养时间，纵坐标为小球藻的生长速率，表示不充入CO2，表示充入1v/v％的CO2，表示充入2v/v％的CO2，表示充入5v/v％的CO2，加入葡萄糖进行完全异养培养。数据为3次平行取样的平均值。
图4表示通入不同浓度CO2进行培养，C.sorokiniana CS-1的油脂含量随时间的变化。
其中，横坐标为培养时间，纵坐标为小球藻的油脂含量，表示不充入CO2，表示充入1v/v％的CO2，表示充入2v/v％的CO2，表示充入5v/v％的CO2，加入葡萄糖进行完全异养培养。数据为3次平行取样的平均值。
图5表示通入不同高浓度CO2进行培养，C.sorokiniana CS-1的平均固碳速率和最大固碳速率。
其中，横坐标为不同的培养条件，纵坐标为固碳速率，表示平均固碳速率，表示最大固碳速率。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
以下实施例中的定量实验，均设置三次重复试验，结果取自平均值。
实施例1：
一、样品采集
2010年7月从淡水湖中采集含有绿藻的水样。
二、高效利用高浓度CO2藻株的分离和筛选
分离步骤：采用稀释涂布平板法进行藻种分离。将采集的水样转接在经高压灭菌(121℃，高压蒸汽灭菌20min)的TAP液体培养基上，置于光照培养箱中富集培养，随后稀释涂布在固体TAP培养基中，经过一段时间之后，挑出平板上的单菌落，即可以得到纯藻种。
筛选步骤：将所得到的的纯藻株接种于24孔板上，放置于密闭的玻璃盒子中，向玻璃盒子中充入无菌10％CO2，以680nm检测生长情况，挑选出生长比较快的藻株，测定其在高浓度CO2下的油脂含量。
微藻培养的参数为：温度25℃，光照3000lux，光暗比12h:12h，培养时间10天，培养采用去除碳源的BG-11培养基。
TAP固体培养基的配置，TAP固体培养基浓度组成(每升)如下：400.00mg NH4Cl，50.00mg CaCl2·2H2O，100.00mg MgSO4·7H2O，98.80mg Na2HPO4，61.73mg KH2PO4，50.00mg Na2EDTA·2H2O，22.00mg ZnSO4·7H2O，11.40mg H3BO3，5.10mg MnCl2·4H2O，5.00mg FeSO4·7H2O，1.60mg CoCl2·6H2O，1.16mg CuSO4·5H2O，1.10mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，2420.00mg Tris base，1mL冰醋酸，15000mg琼脂粉，溶剂为去离子水，pH值为7-8。
BG-11培养基的配方(每升)如下：500mg NaNO3、40mg K2HPO4·3H2O、75mgMgSO4·7H2O、36mg CaCl2·7H2O、1mL微量元素溶液A5。微量元素溶液A5配方(每升)如下：2860mg H3BO4、1810mg MnCl2·4H2O、222mg ZnSO4·7H2O、391mg Na2MoO4、79mg CuSO4·5H2O、49.47mg Co(NO3)2·6H2O，pH值为7-8。
得到一株在高浓度CO2中生长较快、富含油脂的纯藻株，命名为CS-1。
三、藻株CS-1的鉴定
1、藻株CS-1的形态鉴定
细胞形态为圆形或者椭球形的单细胞藻，淡绿色，直径在2-4μm之间。
2、藻株CS-1的分子鉴定
收集指数生长期的细胞，用植物基因组DNA提取试剂盒(OMEGA,USA)提取基因组DNA，以其为模板扩增18S rDNA基因片段。PCR扩增体系为25μL，其中含有10×Ex TaqBuffer(Mg2+plus)2.5μL(TaKaRa)，dNTP mixture(2.5mM)2μL，正反向引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、Ex Taq酶0.25μL，双蒸灭菌水17.25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。
用于扩增18S rDNA的引物为通用引物，序列如下：
正向引物(18SF)：5′-GGATCGAATTCTATCTGGTTGATCCTGCCAG-3′；
反向引物(18SR)：5′-CTCAGTAAGCTTGATCCTTCCGCAGGTTCACC-3′。
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒回收(OMEGA,USA)，交由英骏生物技术公司测序。PCR扩增产物为18s rDNA部分序列，共1723bp，测序结果如SEQ ID No：1所示。
测序结果经NCBI网站Blastn比对分析，CS-1与Chlorella sorokiniana(AB731602.1)的Query coverage值达到100％，Max ident为99％。用MEGA4.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树(见图1)，可以看出CS-1自成一个分支。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，将CS-1鉴定为小球藻(Chlorella sorokiniana)。将小球藻C.sorokiniana CS-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9215。
实施例2：
为了考察高浓度CO2条件下，C.sorokiniana CS-1的能量转化效率，采用的培养基1为去除碳源的BG-11培养基，BG-11培养基的配方(每升)如下：1500mg NaNO3、40mg K2HPO4·3H2O、75mg MgSO4·7H2O、36mg CaCl2·7H2O、1mL微量元素溶液A5。微量元素溶液A5配方(每升)如下：2860mg H3BO4、1810mg MnCl2·4H2O、222mg ZnSO4·7H2O、391mg Na2MoO4、79mg CuSO4·5H2O、49.47mg Co(NO3)2·6H2O；培养基2为在去除碳源的BG-11培养基中加入16g·L-1的葡萄糖和6g·L-1的大豆蛋白胨，进行异养培养，pH值为7-8，培养基分装在250mL的通气培养瓶中，培养体积为150mL，121℃灭菌20min。
在上述各组培养液中分别以体积分数1v/v％的接种量接种新鲜的C.sorokinianaCS-1，控制CO2体积分数分别为0.03％(此时充入无菌空气)，1v/v％，2v/v％，5v/v％。在25℃，3000lux的恒温光照培养箱中培养至稳定期后，获得藻液。异养培养在恒温摇床中进行，转速150r·min-1，培养温度25℃，培养过程中，每隔24h取藻液，烘干测干重，得到小球藻的生长曲线。
将上述所得藻液摇匀，取10mL藻液8000rpm离心3min，去除培养液，将所获得的藻泥在70℃下干燥12h，获得微藻干品，得到每mL藻液中微藻干品质量，表达为mg/mL，即用于提油的微藻干品质量(mg)＝每mL藻液中微藻干品质量*用于提油的微藻藻液体积。
取已知体积的上述藻液离心浓缩，用去离子水洗涤、离心，去除微藻细胞培养盐，制备成无培养盐的湿藻，作为萃取油脂之用。
采用常规的酸热萃取法测定所得藻细胞的油脂含量，即在所得的湿藻中加入浓盐酸(质量浓度36％-38％)，在70℃水浴中放置20min，再加入无水乙醇，冷却，加入乙醚a，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入乙醚b，振荡1min，4000rpm离心2min，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油；所述浓盐酸、无水乙醇、乙醚a、乙醚b的体积用量分别为5mL、5mL、10mL、5mL。基于藻样品干重，微藻细胞油脂含量表达为mg·g-1dw，即微藻油脂含量(％)＝油脂重量/微藻干品重量*100。
结果如图2、图3、图4和图5所示，从图中可以看出异养培养条件下C.sorokinianaCS-1生物量和油脂含量远高于自养培养条件下，暗示小球藻在以葡萄糖为有机碳源和能源时其能量转化效率远高于自养培养条件时。在自养培养条件下，当通入高浓度CO2(<5％)时，随着CO2浓度的增加，C.sorokiniana CS-1的最大生物量、最大比生长速率和油脂含量成比例增加，因此高浓度CO2提高了小球藻在自养培养条件下的光能转化率。当CO2浓度最高为5％时，C.sorokiniana CS-1的最大比生长速率和油脂含量分别为0.14h-1和32％，接近于异养培养状态下相应的数值(0.19h-1，33％)。另外C.sorokinianaCS-1的日平均固碳率从10.62mM·L-1·day-1增加至19.02mM·L-1·day-1，也与以葡萄糖为碳源时接近(35.29mM·L-1·day-1)。除此之外，5％CO2可使C.sorokiniana CS-1的能量-生物量转化率和能量产率增至0.0055g/kJ和12.2％，显著增加太阳能的转化效率。同时5％CO2使C.sorokiniana CS-1的碳油转化率增加至40.8％，也接近以葡萄糖为碳源时的碳油转化率(53.7％)。当通入5％CO2时，C.sorokiniana CS-1的生物量、油脂含量、能量转化效率及碳油转化率显著增加，展现出部分异养生长特性。
实施例3：
为了考察CO2对C.sorokiniana CS-1多不饱和脂肪酸浓度的影响，我们对实施例2所得的藻油进行了分析。所得结果如表1所示。从表中可以看出C.sorokiniana CS-1能够在利用高浓度CO2积累生物量和油脂含量的同时积累多不饱和脂肪酸α-亚麻酸，而完全异养时C.sorokinianaCS-1中α-亚麻酸的含量会有大幅度下降，也就是说高浓度的CO2能够在诱导C.sorokinianaCS-1表现出异养特性的同时还能够保持小球藻高价值副产物α-亚麻酸的含量，是一种更优的培养方式。
藻油的甲酯化：将实施例2得到的藻油用CHCl3溶解，转入1.5mL Agilent玻璃瓶中，加入1mL 1M的硫酸甲醇溶液，充N2密封，于100℃反应1h，自然冷却，加入200μL去离子水，混匀，用200μL正己烷萃取3次，合并有机相，用200μL去离子水反萃取洗涤3次，取有机相，转入1.5mL Agilent玻璃瓶中，N2吹干，称重。
气相色谱定量分析：采用Agilent公司生产的7890型气相色谱仪(GC)对甲酯化后微藻油脂中的脂肪酸甲酯进行定量分析。
GC分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.50μm)。柱升温程序：从50℃升至200℃，保持5min；然后以10℃/min升至250℃，保持3min。载气：氮气；流量：3mL/min。检测器：氢火焰检测器，氢气：30mL/min；空气：300mL/min。进样口温度：280℃；检测器温度300℃。
表1 CO2对C.sorokiniana CS-1脂肪酸组成的影响
实施例4：
用BG-11培养基1L于自制光反应器中，初始pH7.0，温度25℃，光强3000lux，通入10v/v％CO2,接种使初始细胞密度为5×105个·mL-1，培养8天后，生物量达到3.35g·L-1，油脂含量为27％。
实施例5：
用BG-11培养基1L于自制光反应器中，初始pH7.0，温度25℃，光强3000lux，通入20v/v％CO2,接种使初始细胞密度为5×105个·mL-1，培养8天后，生物量达到3.02g·L-1，油脂含量为21％。
实施例6：
用BG-11培养基1L于自制光反应器中，初始pH7.0，温度25℃，光强3000lux，通入30v/v％CO2,接种使初始细胞密度为5×105个·mL-1，培养8天后，生物量达到2.23g·L-1，油脂含量为18％。
实施例7：
用BG-11培养基1L于自制光反应器中，初始pH7.0，温度25℃，光强3000lux，通入40v/v％CO2,接种使初始细胞密度为5×105个·mL-1，培养8天后，生物量达到2.1g·L-1，油脂含量为17％。
实施例8：
用BG-11培养基1L于自制光反应器中，初始pH7.0，温度25℃，光强3000lux，通入50v/v％CO2,接种使初始细胞密度为5×105个·mL-1，培养8天后，生物量达到1.9g·L-1，油脂含量为17％。

Claims (10)

1.一株利用高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻，其特征在于，其分类命名为小球藻(Chlorella sorokiniana)，菌株号CS-1，菌种保藏登记号为CGMCC No.9215，菌种保藏日期为2014年5月5日。
2.根据权利要求1所述的小球藻，其特征在于，其能够固定0.5％～40％体积百分含量的CO2。
3.根据权利要求2所述的小球藻，其特征在于，其能够固定1％～10％体积百分含量的CO2。
4.根据权利要求3所述的小球藻，其特征在于，其能够固定5％～10％体积百分含量的CO2。
5.根据权利要求1或4所述的小球藻，其特征在于，在通入5v/v％的CO2时，小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1生物量达到3.3g·L-1，油脂含量为32％，最大比生长速率为0.14h-1，倍增时间为4.9h，日平均固碳率为19.02mM·L-1·day-1，能量-生物量转化率为0.0055g/kJ，能量产率为12.2％，碳油转化率增为40.8％，各项自养条件下的指标接近异养条件下的指标，表现出异养特性。
6.权利要求1所述的利用高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻在生产油脂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，培养温度为25～30℃，光照强度2000～4000lux；向小球藻(Chlorella sorokiniana)CS-1通入体积百分含量为0.5％～40％的CO2，培养8～10天收获。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的CO2的体积百分含量为1％～10％。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的CO2的体积百分含量为5％～10％。
10.权利要求1所述的利用高浓度CO2表现出异养生长特性的淡水小球藻在生产α-亚麻酸中的应用。
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