CN104560720B - 一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法 - Google Patents

一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法，从黄海海水中分离得到的，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikos marinus，于 2014年10月 22日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No. 9814。所述拟双孢藻的采集方法为浮游植物脱网；分离方法采用微吸管吸取、逐级稀释分离及平板涂布法。本发明的有益效果：与其他作为生物柴油原料的藻种相比，本发明的海洋拟双孢藻具有很高的油脂含量及生长速率，可以有效降低生物柴油的生产成本。

Description

一株海洋拟双孢藻及其应用和培养方法
技术领域
发明属于生物能源领域，涉及一种海洋拟双孢藻及其应用，更具体地，本发明涉及一株新的海洋拟双孢藻藻株，其油脂含量高，可用于制备生物柴油、饲料或食用油。
背景技术
由于地球上的化石能源储量正日益减少，石油资源很有可能会在短时间内便迅速枯竭。化石能源的蕴藏量并不是无穷无尽的，易于开采和利用的化石能源储量已经所剩无几，剩余储量因为开发难度越来越大，从而失去继续开采的价值。在世界能源消费以石油为主导的情况下，如果能源消费结构仍不变化，那么就会发生新一代的能源危机。煤炭资源虽比石油资源储存量要大，但也不是取之不尽用之不竭的。目前除了煤炭之外，能够大规模利用开发的能源还是很少。虽然太阳能的资源是取之不竭源源不断的，但因其开发利用所耗成本高昂，所以在短时间内仍不可能迅速发展得到广泛应用。
因此人类必须及时找到一种可以代替非再生矿物能源的新能源，从而将注意力转移到新的能源结构上，尽早探索、研究开发利用新能源资源，这样才能让人类的生活在安定和谐的情况下持续发展下去，而生物柴油正好可以将此问题解决。像生物柴油这种可再生的碳中性能源，有利于环境和经济的可持续发展。目前的研究也表明了微藻是能够完全替代化石柴油的唯一生物柴油。生物柴油和化石燃料本质上都来源于光合作用产物。绿色植物进行光合作用，将水、二氧化碳和其他无机物依靠光能合成各种有机物并释放出氧气，动物和微生物才能生长繁殖。各种生物的油脂都是从植物合成的有机物转化来的。任何形式的来自动物、植物和微生物的脂肪酸都能用作生物柴油的原料。因此，油脂含量高的藻种才是制备生物柴油的最重要原料。
利用微藻加工制备生物柴油的关键，一是提高原始藻种的油脂含量，二是通过优化培养尽可能提高微藻细胞的油脂含量。在单细胞微藻的培养过程中，培养基成分、温度、光照强度、pH、培养方式、通气量、盐度等均会影响微藻的生长以及其脂肪酸的含量与组成。温度、光强能影响微藻的光合作用和呼吸作用，从而对其生长及体内生化成分产生影响。微藻具有生长速率快、收获时期短、光合利用率高等特点，利用微藻作为生物柴油原材料有很高的应用前景。高油脂含量、高生长速率的藻株是该环节的关键步骤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：第一是提供一种海洋拟双孢藻新种；第二是提供海洋拟双孢藻在生物柴油生产中的应用；第三是在于该新种存在种内的内含子存在/缺失多样性，可以作为研究内含子进化的模式生物；第四在于提供上述拟双孢藻的培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种海洋拟双孢藻，从黄海海水中分离得到的，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikos marinus，于 2014年10月22日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No. 9814。所述拟双孢藻的采集方法为浮游植物脱网；分离方法采用微吸管吸取、逐级稀释分离及平板涂布法。
培养方法，其具体操作步骤如下：在海水F/2培养基中富集培养微藻，初始接种密度为1×105 个·mL-1，置于光暗比为 14h∶10h， 光照强度为 1100lux， 温度为 25℃， 相对湿度为 70％~80%的人工气候箱中培养1-3周，离心海洋拟双孢藻藻液。收获拟双孢藻。
优选的，在相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养2周。
上述的F/2培养基中每1L海水中含有以下物质：NaNO3：75毫克；NaH2PO4·H2O：5毫克；Na2SiO3·9H2O：20毫克；Na2EDTA：4.36毫克；FeCl3·6H2O：3.16毫克；CuSO4·5H2O：0.01毫克；ZnSO4·7H2O：0.023毫克；CoCL2·6H2O：0.012毫克；MnCL·4H2O：0.18毫克；Na2MOO4·2H2O：0.07毫克；维生素B1：0.1微克；维生素B12：0.5微克；生物素：0.5微克。
所述的海洋拟双孢藻在作为研究内含子进化的模式生物上的应用。
本发明的有益效果：
与其他作为生物柴油原料的藻种相比，本发明的海洋拟双孢藻具有很高的油脂含量及生长速率，可以有效降低生物柴油的生产成本。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1是本发明的海洋拟双孢藻电镜照片及Bodipy 染色照片。
图2是本发明的海洋拟双孢藻的进化树。
具体实施方式
实施例1
一种海洋拟双孢藻，从黄海海水中分离得到的，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikos marinus，于 2014年10月22日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No. 9814。所述拟双孢藻的采集方法为浮游植物脱网；分离方法采用微吸管吸取、逐级稀释分离及平板涂布法。
培养方法，其具体操作步骤如下：在海水F/2培养基中富集培养微藻，初始接种密度为1×105 个·mL-1，置于光暗比为 14h∶10h， 光照强度为 1100lux， 温度为 25℃， 相对湿度为 70％~80%的人工气候箱中培养2周，离心海洋拟双孢藻藻液。收获拟双孢藻。
上述的F/2培养基中每1L海水中含有以下物质：NaNO3：75毫克；NaH2PO4·H2O：5毫克；Na2SiO3·9H2O：20毫克；Na2EDTA：4.36毫克；FeCl3·6H2O：3.16毫克；CuSO4·5H2O：0.01毫克；ZnSO4·7H2O：0.023毫克；CoCL2·6H2O：0.012毫克；MnCL·4H2O：0.18毫克；Na2MOO4·2H2O：0.07毫克；维生素B1：0.1微克；维生素B12：0.5微克；生物素：0.5微克。
总脂测定方法：将离心收集的藻泥置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，直至彻底干燥成藻粉。用电子天平称取约40毫克干燥好的藻粉，小心加入到干净的彻底烘干的密封性好的螺口玻璃试管(10mL)中，并记录下藻粉的质量m1。向螺口管中小心加入2mL氯仿、1mL甲醇。剧烈震荡10min，避免液体从螺口管中溅出。离心4000g，10min。吸取上清至新的干净玻璃管中。重复②，③。并将上清合并到同一个玻璃管中。向装有上清的玻璃管中加入1/5体积的NaCl溶液(0.9%),剧烈震荡10min，室温静置30min以促进分层。用1mL注射器彻底地吸取最下面的氯仿层于新的空玻璃管中(提前称重，记为m2)。将玻璃管置于50℃水浴锅中烘干，待氯仿挥发之后再放入电热恒温鼓风干燥箱中干燥。最后称取玻璃管的重量，记为m3。计算总脂重量。总脂含量(%)=(m3- m2)/ m1。
恒温光照箱中进行静置培养后（未通二氧化碳），该藻的生物量可达到0.8g/L。通过重量法对进入平台期的微藻油脂含量按照上述方法进行测定，结果表明该藻的油脂含量占到干重的50%以上。在未添加任何促油脂合成物质及未进行胁迫处理的条件下，生物量、油脂含量达到如此水平是异常罕见的。
对本实施例中的海洋拟双孢藻进行电镜和Bodipy 染色，结果见图1。图1可以看出，胞内多含有1-2个油脂滴，且体积异常庞大，甚至能占到整个细胞的80%以上；充分说明该藻种细胞内油脂含量丰富。
选取卵囊藻科物种序列，使用Mega4.0软件，采用邻接法构建进化树。具体结果见图2。DH32是海洋拟双孢藻的编号，从进化树上可以看出该藻与amphikrikos sp. 聚为一支，表明该藻属于拟双孢藻属。

Claims (5)

1.一株海洋拟双孢藻，分类命名为海洋拟双孢藻Amphikrikos marinus，于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCNo.9814。
2.权利要求1所述的海洋拟双孢藻在制备生物柴油上的应用。
3.一种权利要求1所述的海洋拟双孢藻的培养方法，其特征在于，操作步骤如下：在海水F/2培养基中富集培养微藻，初始接种密度为1×105个·mL-1，置于光暗比为14h∶10h，光照强度为1100lux，温度为25℃，相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养1-3周，离心海洋拟双孢藻藻液，收获海洋拟双孢藻。
4.根据权利要求3所述的海洋拟双孢藻的培养方法，其特征在于，在相对湿度为70％~80%的人工气候箱中培养2周。
5.根据权利要求3所述的海洋拟双孢藻的培养方法，其特征在于，F/2培养基中每1L海水中含有以下物质：NaNO3：75毫克；NaH2PO4·H2O：5毫克；Na2SiO3·9H2O：20毫克；Na2EDTA：4.36毫克；FeCl3·6H2O：3.16毫克；CuSO4·5H2O：0.01毫克；ZnSO4·7H2O：0.023毫克；CoCL2·6H2O：0.012毫克；MnCL2·4H2O：0.18毫克；Na2MOO4·2H2O：0.07毫克；维生素B1：0.1微克；维生素B12：0.5微克；生物素：0.5微克。
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