CN110093381A - 一种利用木糖促进微藻油脂积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用木糖促进微藻油脂积累的方法，在温度为24~26℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.35~0.5 g/L作为种子液，将木糖母液添加种子液中稀释木糖浓度为20~30 mmol/L，并置于温度为24~26℃、黑暗条件下缺氮培养2~8天，其中所需K2HPO4.3H2O浓度为20~300 mg/L；利用有机溶剂提取藻细胞内的油脂。本发明方法操作简单，能够显著提高油脂含量，降低培养成本，可解决微藻产业化过程中存在的油脂含量低和生产成本高等问题。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种利用木糖促进微藻油脂积累的氮磷调控方法。
背景技术
日益恶化的生存环境和濒临枯竭的化石能源危机是当今世界面临的最为严重而紧迫的两大问题，迫切需要人类加速寻求经济、环保的处理污染物的方法和研发清洁、高效的可再生新能源。利用废物制备生物质能源是环境保护和能源开发领域的有益尝试。这样不仅可以净化环境，还将为微藻养殖提供廉价原料，所收获的藻产品可用作饲料、肥料，甚至还可用于生产有用的化学物质。
与其他生物柴油原料相比，微藻具备含油量高、易于培养、单位面积产量大、不与农业争地等优点而成为当前关注的热点。然而目前微藻制油的高额成本和低能源转化率，妨碍了其大规模工业化生产。因此，如何提高产油量、降低成本成为当前的研究热点。微藻为光合自养微生物，以空气中的二氧化碳为唯一碳源，但是自养条件下，由于光限制等因素生长量很小，难以进行高密度大规模的生产。而某些微藻能够异养或混养生长，即在外加有机碳源存在时，利用有机碳进行生长。异养培养能够克服或降低自养培养的不足，无需光照培养，可以大大提高微藻的产量，但是仅有限的微藻可以在异养条件下生存，过度的有机碳基质会造成微藻的生长抑制（Perez-Garcia O., Escalante F.M., de-Bashan L.E.,Bashan Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potentialproducts. Waterres. 2011, 45, 11-36）。因此，筛选合适的异养型高产油藻种是微藻生物柴油的规模化发展的前提和重点。此外，高成本的碳源也成为限制微藻异养培养的一大挑战，研究表明，仅有机碳基质的耗费约占整个培养基耗费的80%（Liang Y., Producingliquid transportation fuels from heterotrophic microalgae. Appl. Energy 2013,104, 860-868）。为解决高有机碳的费用，寻找造价低的有机碳源至关重要。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种利用木糖促进微藻油脂积累的氮磷调控方法，本发明将藻液浓度经过扩增后，随后稀释至适量的浓度进行添加木糖的异养培养，同时结合氮胁迫诱导藻细胞大量积累油脂，并利用有机溶剂提取藻细胞内油脂；本发明操作简单，能够缩短藻细胞油脂积累周期，提高油脂产率。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用木糖促进微藻油脂积累的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）藻种液的制备：在24~26℃下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.35~0.5 g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：配制木糖母液，将木糖母液添加到步骤（1）制备的种子液中稀释木糖浓度为20~30 mmol/L，并置于24~26℃、黑暗异养条件下缺氮诱导培养；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）培养的藻细胞内的油脂。
优选地，步骤（1）所述的四尾栅藻为四尾栅藻藻株Scenedesmus quadricauda（FACHB-1297），购买自中国科学院淡水藻种库。
优选地，步骤（2）所述的黑暗异养条件为：培养基中P的浓度保持在3 mg/L以上，所述培养基中其他条件同BG11培养基，黑暗诱导培养2~8天。
更优选地，步骤（2）中异养条件为BG11培养基中含有浓度为20~300 mg/LK2HPO4.3H2O。
优选地，步骤（3）中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，其中氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1。
优选地，步骤（2）所述的木糖母液的浓度为1.86mmol/L。
优选地，步骤（3）所述的氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：
（1）步骤（2）培养得到的培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；
（2）称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，超声破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，重复操作两次；其中氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；
（3）将有机相转移到分液漏斗中，加入0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂；其中有机相和0.9%的氯化钠溶液的体积比为5:1。
有益效果
（1）本发明的制备方法显著提高了微藻的油脂含量，当外源添加25 mol/L木糖联合缺氮下油脂含量可提高了22%；
（2）本发明的木糖，作为木质纤维素水解的产物，广泛存在于农产品废弃物如玉米的穗轴、秸秆的水解液中，添加木糖用于微藻异养生长的外加碳源，并促进微藻生长和产油，这将为微藻规模化培养中廉价碳源的选择提供一种新的途径。
具体实施方式
以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。
以下实施例中所用四尾栅藻藻株Scenedesmus quadricauda（FACHB-1297）购买自中国科学院淡水藻种库。
实施例1
（1）藻种液的制备：在温度为24℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.35g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为20mmol/L，并置于温度为24℃、0 mg/L NaNO3及20 mg/L K2HPO4 .3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，黑暗异养条件下诱导培养5天，培养过程中通过添加 3 g/L的磷储备液使培养基中磷含量始终高于3mg/L以上，以维持磷限制的环境；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂：其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第5天油脂含量为39.35%（见表1），生物量为0.41g/L。
实施例2 ：
（1）藻种液的制备：在温度为26℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.5g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将1.86mmol/L木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为30 mmol/L，并置于温度为26℃、0 mg/L NaNO3及300 mg/L K2HPO4.3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，培养过程始终保持培养基中磷含量高于3mg/L，黑暗异养条件下诱导培养5天；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第5天油脂含量达到41.01%（见表1），生物量为0.57g/L。
实施例3 ：
（1）藻种液的制备：在温度为25℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.4g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将1.86mmol/L木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为25 mmol/L，并置于温度为25℃、0 mg/L NaNO3及250 mg/L K2HPO4.3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，培养过程始终保持培养基中磷含量高于3mg/L，黑暗异养条件下诱导培养2天；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第2天油脂含量达到28.01%（见表1），生物量为0.46g/L。
实施例4：
（1）藻种液的制备：在温度为25℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.4g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将1.86mmol/L木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为25 mmol/L，并置于温度为25℃、0 mg/L NaNO3及250 mg/L K2HPO4.3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，培养过程始终保持培养基中磷含量高于3mg/L，黑暗异养条件下诱导培养8天；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第8天油脂含量达到35.72%（见表1），生物量为0.49g/L。
对比例1：
（1）藻种液的制备：在温度为26℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.5 g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将种子液置于温度为26℃、0 mg/L NaNO3及300 mg/L K2HPO4.3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，黑暗条件下诱导培养5天；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第5天油脂含量达到18.84%（见表1），低于实施例2。
对比例2：
（1）藻种液的制备：在温度为26℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.5 g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为30mmol/L，并置于温度为26℃、0 mg/L NaNO3及0 mg/L K2HPO4.3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，黑暗异养条件下诱导培养5天；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第5天油脂含量达到20.79%（见表1），生物量为0.56 g/L，低于实施例2。
对比例3 ：
（1）藻种液的制备：在温度为25℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.4 g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为25mmol/L，并置于温度为25℃、0 mg/L NaNO3 及250 mg/L K2HPO4.3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，光照混养条件下诱导培养2天；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第2天油脂含量达到20.01%（见表1），低于实施例3。
对比例4
（1）藻种液的制备：在温度为24℃条件下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.35 g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将木糖母液添加到步骤（1）的种子液中稀释木糖浓度为20mmol/L，并置于温度为24℃、0 mg/L NaNO3 及20 mg/L K2HPO4 .3H2O的培养基中，所述培养基中其他条件同BG11培养基，混养条件下诱导培养5天，培养过程中通过添加 3 g/L的磷储备液使培养基中磷含量始终高于3mg/L以上，以维持磷限制的环境；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次, 根据分离的有机相体积，投加0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂。诱导第5天油脂含量达到23.62%（见表1），低于实施例1。
表1 不同培养模式下四尾栅藻油脂含量的对比
括号中数字代表到达该油脂含量的天数。
Claims (7)
1.一种利用木糖促进微藻油脂积累的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）藻种液的制备：在24~26℃下，以BG11培养基培养四尾栅藻，待四尾栅藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮缺磷的BG11培养基稀释重悬藻细胞至0.35~0.5 g/L作为种子液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：配制木糖母液，将木糖母液添加到步骤（1）制备的种子液中稀释木糖浓度为20~30 mmol/L，并置于24~26℃、黑暗异养条件下缺氮诱导培养；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）培养的藻细胞内的油脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的四尾栅藻为四尾栅藻藻株Scenedesmus quadricauda（FACHB-1297）。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（2）所述的黑暗异养条件为：培养基中P的浓度保持在3 mg/L以上，所述培养基中其他条件同BG11培养基，黑暗诱导培养2~8天。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（2）中异养条件为BG11培养基中含有浓度为20~300 mg/L K2HPO4.3H2O。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，其中氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的木糖母液的浓度为1.86mmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的氯仿甲醇提取藻细胞内的油脂的方法为：
（1）步骤（2）培养得到的培养液经4000 r/min离心分离10min，用NaHCO3溶液反复洗涤3次后，冷冻干燥成干藻粉，称重备用；
（2）称取0.1g干藻粉于50 ml离心管中，加入10 ml氯仿/甲醇溶液，超声破碎10min，然后4000 r/min离心分离10min，保留有机相，重复操作两次；其中氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为2:1；
（3）将有机相转移到分液漏斗中，加入0.9%的氯化钠溶液（1:5），充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层有机相即为油脂提取溶液，经氮吹后获得油脂；其中有机相和0.9%的氯化钠溶液的体积比为5:1。
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