CN105132351A

CN105132351A - 一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法

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Publication number: CN105132351A
Application number: CN201510657796.2A
Authority: CN
Inventors: 裴海燕; 韩飞; 胡文容; 聂昌亮; 成娟; 张立杰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2015-10-12
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明属于微藻生物能源研究领域，涉及一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法，在反应器中培养微藻，直至所述微藻的生长进入对数生长期末期，将上述微藻在高温环境中胁迫培养1-2天，离心，即得高油脂含量微藻。本发明操作简单、耗时短、效率高、易于实现；不影响四尾栅藻生物质浓度，有利于提高油脂产率；能促使四尾栅藻快速积累油脂，所述方法生产的高油脂微藻可用于提炼汽油、柴油、航空燃油，以及作为塑料制品和药物的原料。

Description

一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法

技术领域

本发明属于微藻生物能源研究领域，涉及一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法。

背景技术

随着化石能源的不断消耗，二氧化碳持续排放，温室效应加剧，寻找新的可持续的再生能源可以有效减少大气中二氧化碳的总排放量。许多可再生的生物质已经用来生产生物柴油，包括油菜籽、麻风树、棕榈树、餐厨垃圾及微藻等生物质原料，其中微藻是一种生长迅速且环境适应性极强的生物，有很大的营养学、药学及生物学价值，可以作为某些生物及医药行业的原料，用来生产高附加值营养品、生物柴油和鱼类饵料。相对于其他生物质，微藻是一种极具开发前景的生物质，利用微藻生产生物柴油，可以大大减少占地面积、提高生产效率、节省时间。本发明可以用于微藻生物质和油脂积累的开发和研究。

微藻生长过程中，并不能同时实现高生物质和高油脂含量的同时积累，因此两阶段培养方案被认为是一种比较合理的方法。具体方案包括：首先微藻在最适条件下生长至对数期末期，使生物质浓度达到最大，然后利用外部环境胁迫促使其进行油脂的合成积累。氮磷饥饿培养是目前最普遍的促使微藻积累油脂的方法，但这种营养元素饥饿会导致微藻生物质浓度的下降，而且胁迫方式所需时间较长，因此会降低油脂生产的效率。此外，将微藻从氮磷丰富的培养液中转移到缺乏氮磷营养盐的培养液时，离心脱水过程将消耗大量电能，造成培养基的浪费，不利于微藻生产生物柴油经济效益的提高。温度作为微藻生长必不可少的重要因素，能够影响细胞内化学组分合成。有研究设定不同温度梯度来优化微藻生长和产油性能，通过周期培养确定最佳温度条件，得到最大油脂含量和生物质浓度；也有研究利用25-35℃温度，在微藻生长后期促进油脂合成积累，结果表明高温有利于生产油脂，但上述研究消耗时间长，且对生物质浓度造成了不利影响，导致生物量下降。研究表明，部分微藻在较高的温度下生长时，会促进油脂的合成，提高其油脂含量。之前有研究表明，螺旋藻在40℃的条件下进行培养，其油脂含量得到了提高，但由于其整个培养周期均在此温度条件下进行，导致其生物质浓度偏低。

发明内容

本发明的目的是克服微藻生物质生长和油脂积累之间的矛盾，利用分步培养方案，提供一种操作简单、耗时短、效率高、易于实现的促进微藻油脂快速积累的方法。利用高温在短时间内实现一种快速且简易的环境胁迫方案，促使对数期末期的微藻在短时间内实现油脂的高效积累，同时不影响微藻生物质浓度，由于胁迫时间较短，更有利于提高油脂产率，具有非常重要的现实意义和应用前景。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法，微藻前期培养，直至所述微藻的生长进入对数生长期末期，将上述微藻在能够胁迫微藻积累油脂的温度下培养1-2天，离心，即得高油脂含量微藻。

温度是影响代谢酶活性的一个主要因子，也会影响到油脂的合成和脂肪酸的组成，在短时间的高温条件下，微藻会对不利条件产生应激反应，积累油脂作为储备物来抵抗不利环境。

优选的是，所述微藻前期培养的具体步骤为：以BG11为培养基，在温度20-25℃，曝气量500-600mL/min，光照强度5000-6000lux条件下培养微藻10-15天。

优选的是，所述BG11培养基成分(g/L)为：NaNO₃，1.5；K₂HPO₄，0.04；MgSO₄·7H₂O，0.075；CaCl₂·2H₂O，0.036；柠檬酸，0.006；柠檬酸铁铵，0.006；EDTA·2Na，0.001；Na₂CO₃，0.02；以及1mL/L的A5。

优选的是，所述A5成分(g/L)为：H₃BO₃，2.86；MnCl₂·4H₂O，1.86；ZnSO₄·7H₂O，0.22；Na₂MoO₄·2H₂O，0.39；CuSO₄·5H₂O，0.08；Co(NO₃)₂·6H₂O，0.05。

优选的是，所述微藻为四尾栅藻，购自山东省环境科学工程技术研究中心，藻种已保藏于中国科学院淡水藻种库，保藏号为FACHB-1768,保藏日期：2013年12月。优选的微藻种类为四尾栅藻，但对其种类并无特殊限定。

优选的是，所述微藻的生长进入对数生长期末期后，微藻的生物质浓度为1.07～1.11g/L，油脂含量为23.4％～25.6％。判断微藻的生长状况和油脂含量，为后续处理条件的选择提供依据。

优选的是，所述能够胁迫微藻积累油脂的温度为30-40℃，胁迫培养时间为1-2天。本发明中待微藻生长进入对数期末期才对微藻进行高温处理，不仅有利于提高油脂产率，同时不影响微藻生物质浓度，在短时间内实现油脂的高效积累。胁迫温度小于30℃，无法有效刺激微藻产生应激反应，油脂积累效果差，温度大于40℃时，与油脂合成相关的酶活力下降，甚至部分失活，生物量和油脂积累效率随着温度的继续升高呈下降趋势。

优选的是，所述离心条件为：于4-6℃、4000-4500r/min下离心5-10min。低温离心保证微藻的生物质成分不被破坏，并通过离心转速的控制，使富含油脂的微藻快速沉积。

优选的是，所述高油脂含量微藻，其油脂含量为32.6％～34.5％。油脂含量显著提高，同时不影响微藻的生物质浓度，可作为生物柴油燃料。

在本发明的一些实施方式中，所述微藻可以在一定的培养装置和合适的外部环境控制下，进行快速的生长繁殖。所用术语“一定的培养装置”可以是密闭式光生物反应器(例如玻璃气泡柱反应器)、开放式跑道培养池或生物膜培养装置(如半干固态贴壁培养装置(CN201210051158.2))，其中上述装置可按照次序串联使用或单独使用。所用术语“合适外部环境”是指适宜微藻生长的温度、光照、营养盐和二氧化碳等因素的综合。

本发明所述的高油脂含量微藻可用于提炼汽油、柴油、航空燃油，以及作为塑料制品和药物的原料。

上述的方法可用于生产生物柴油或开发其他生物质能源。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1.本发明操作简单、耗时短、效率高、易于实现。

2.本发明不影响四尾栅藻生物质浓度，可在1天时间内快速提高四尾栅藻油脂含量。

3.本发明能促使四尾栅藻快速积累油脂，可用来生产生物柴油或作为其他生物质能源开发的原料。

附图说明

图1为对数期末期的四尾栅藻在40℃高温胁迫中，生物质浓度随继续培养时间的变化。

图2为对数期末期的四尾栅藻在40℃高温胁迫中，油脂含量随继续培养时间的变化。

具体实施例如下：

实施例1

本发明涉及一种高温胁迫微藻快速积累油脂、提高微藻产油效率的微藻培养方法。首先利用BG11培养基在温度25℃，曝气量600mL/min，光照强度6000lux的连续光照条件下，对微藻进行培养。所培养的微藻为四尾栅藻，来自山东省环境科学工程技术研究中心，已保藏于中国科学院淡水藻种库，保藏号为FACHB-1768。培养15天以后微藻达到对数生长期末期，此时微藻的生物质浓度达到最高为1.07～1.11g/L，油脂含量为23.4％～25.6％。然后将对数期末期的四尾栅藻放置于高温40℃的环境中进行胁迫培养，保持光照强度为6000lux连续培养6天。在6天的胁迫培养过程中，每天将微藻在4000r/min，4℃条件下进行离心收获，并检测其生物质浓度和油脂含量的变化。生物质浓度和油脂含量变化分别如图1和2所示。

在培养1天后获得油脂含量(占干重的百分数)最高的微藻，为32.6％～34.5％，提高了约40％。随着高温胁迫时间的延长，四尾栅藻的油脂含量不断下降，到第6天时得到的油脂含量为20.5％～21.9％，说明过长时间的高温胁迫不利于微藻积累油脂。而空白对照组，即没有经过高温胁迫的微藻培养6天后油脂含量为22.8％～26.2％，相比对数期末期没有明显升高，说明通过微藻自身在稳定期生长进行油脂积累效率较低。如图1所示，在1天的胁迫培养过程中，四尾栅藻的生物质浓度没有受到影响，但随着胁迫培养时间延长至6天，微藻生物质浓度开始缓慢下降，显示出长时间处于高温环境中会导致微藻细胞死亡。

上述实施例中测定微藻油脂含量的方法如下：

利用离心机将藻液于4000r/min，4℃下离心收获，获得的藻泥在冰箱内冷冻成块，然后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，将干燥后的微藻在研钵中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存待用。

1.称取约0.1g干藻粉(m₁)于50ml离心管中，加入10ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，用超声波细胞破碎仪破碎(处理)10min(频率为20％)；

2.将混合物在4000r/min下离心10min，离心结束后混合物分两相，将上清液转移到60mL的分液漏斗中，再往离心管中加入10ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，并利用超声和离心按步骤1、2重复整个提取过程；

3.根据油脂提取液体积，投加0.9％的氯化钠溶液(加入氯化钠溶液体积为油脂提取液体积的1/5，约3～4mL氯化钠溶液)，充分摇匀1min，并静置15min待液体分层；

4.测量低相溶液体积V，并取5mL低相溶液于10mL玻璃试管(m₀)中，用氮气吹干，将玻璃管放置于60℃烘箱中烘至恒重(m₂，约30分钟)。

油脂含量：LW(％)＝(m₂-m₁)×V×100/(5×m₁)；

式中：LW—基于干重下的油脂含量％，g/g；

m₁—藻粉干重，g；

m₂—带有油脂的10mL玻璃管干重，g；

m₀—10mL玻璃管干重，g；

V—低相油脂的体积，mL。

最终实验数据表明，本发明所提供的利用高温胁迫促进对数期末期的四尾栅藻积累油脂的方法，可实现油脂在1天内快速积累，使油脂含量显著提高，同时可保证不影响微藻的生物质浓度，达到最大的油脂产率，可以作为生产生物柴油或其他生物能源生产的原料，生产的生物柴油不含硫，燃烧时不排放有毒害气体，排入环境中也可被微生物降解，不污染环境。

实施例2

本发明涉及一种高温胁迫微藻快速积累油脂、提高微藻产油效率的微藻培养方法。首先利用BG11培养基在温度20℃，曝气量500mL/min，光照强度5000lux的连续光照条件下，对微藻进行培养。所培养的微藻为四尾栅藻，来自山东省环境科学工程技术研究中心，已保藏于中国科学院淡水藻种库，保藏号为FACHB-1768。培养15天以后微藻达到对数生长期末期，此时微藻的生物质浓度达到最高为1.07～1.11g/L，油脂含量为23.4％～25.6％。然后将对数期末期的四尾栅藻放置于高温30℃的环境中进行胁迫培养，保持光照强度为5000lux连续培养6天。在6天的胁迫培养过程中，每天将微藻在3500r/min，6℃条件下进行离心收获，并检测其生物质浓度和油脂含量的变化。在培养1天后获得油脂含量(占干重的百分数)最高的微藻，提高了约40％。上述实施例中测定微藻油脂含量的方法如下：

利用离心机将藻液于3500r/min，6℃下离心收获，获得的藻泥在冰箱内冷冻成块，然后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，将干燥后的微藻在研钵中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存待用。

本发明所述的高油脂含量微藻由于具有较高的油脂含量和不饱和脂肪酸比例，因此，可用于提炼汽油、柴油、航空燃油，以及作为塑料制品和药物的原料。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动，即可做出的各种修改或变形，仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法，其特征在于，培养微藻直至所述微藻的生长进入对数生长期末期，将上述微藻进行在高温环境中胁迫培养1-2天，离心，即得高油脂含量微藻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养微藻的具体步骤为：以BG11为培养基，在温度20-25℃，曝气量500-600mL/min，光照强度5000-6000lux条件下培养微藻10-15天。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻为四尾栅藻，来自山东省环境科学工程技术研究中心，藻种已保藏于中国科学院淡水藻种库，保藏号为FACHB-1768。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻的生长进入对数生长期末期后，微藻的生物质浓度为1.07～1.11g/L，油脂含量为23.4％～25.6％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高温条件为30-40℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心条件为：于4-6℃、3500-4000r/min下离心5-10min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高油脂含量微藻，其油脂含量为32.6％～34.5％。