CN107988276A - 一种微藻的脂肪酸诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微藻养殖技术领域，尤其涉及一种微藻的脂肪酸诱导方法。能够提高TCA循环的活性，进而能够提高脂肪酸的产量。本发明实施例提供一种微藻的脂肪酸诱导方法，包括：对可异养的微藻进行异养培养，并在异养培养的后期，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养；其中，所述第一光照强度为1‑50μmol/m2·S。本发明实施例用于微藻养殖产脂肪酸。

Description

一种微藻的脂肪酸诱导方法
技术领域
本发明涉及微藻养殖技术领域，尤其涉及一种微藻的脂肪酸诱导方法。
背景技术
生物柴油是一种优质清洁柴油，可从各种生物质提炼，因此可以说是取之不尽，用之不竭的能源，在资源日益枯竭的今天，有望取代石油成为替代燃料。其中，脂肪酸是生物柴油的重要组成部分，通过在微藻培养过程中对脂肪酸进行诱导和累积，能够获得脂肪酸。
现在的微藻培养技术多采用自养培养，即将微藻置于光照条件下，通过微藻的光合作用固定二氧化碳实现微藻的养殖，近年来，逐渐兴起了利用异养化技术进行微藻的高细胞密度培养，并且通过研究发现：相对于自养培养而言，异养培养的微藻生长快、油脂产率高，因而越来越受到关注。
异养培养脂肪酸诱导是微藻利用有机物作为碳源和能源，在需氧条件下进行代谢合成的复杂过程，在此过程中，脂肪酸合成的重要底物乙酰辅酶a直接从有机碳源代谢产生的丙酮酸氧化脱羧获得，与自养培养脂肪酸诱导过程中首先需要利用光和二氧化碳合成葡萄糖，再通过对培养后的藻细胞进行调控，以使得所合成的葡萄糖通过呼吸代谢产生乙酰辅酶a用于脂肪酸合成相比，能量运输线较短，效率较高。
然而，虽然目前已记载的可异养的微藻已达数百种，但是，真正能够高效异养进行脂肪酸诱导的微藻仅限于少量的藻种，因此，如何对可异养的微藻进行高效脂肪酸诱导成为人们关注的焦点。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种微藻的脂肪酸诱导方法，能够提高TCA循环的活性，进而能够提高脂肪酸的产量。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种微藻的脂肪酸诱导方法，包括：
对可异养的微藻进行异养培养，并在异养培养的后期，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养；
其中，所述第一光照强度为1-50μmol/m2·S。
可选的，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液的碳氮摩尔比为大于等于20:1。
可选的，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度根据所述第一光照强度的大小来确定；
具体的，当所述第一光照强度为1-10μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为10-20g/L；
当所述第一光照强度为11-20μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为21-30g/L；
当所述第一光照强度为21-30μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为31-40g/L；
当所述第一光照强度为31-50μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为41-50g/L。
可选的，所述第一光照强度的大小根据所述微藻的种类来确定。
可选的，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养时，所述方法还包括：
在整个培养周期内，控制培养液中的溶氧至少在半个周期内保持在1ppm以下。
可选的，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养时，所述方法还包括：
在整个培养周期内，至少在半个周期内对所述微藻进行高温胁迫或低温胁迫。
可选的，所述高温胁迫的温度为28-30℃，低温胁迫的温度为10-15℃。
可选的，在第二光照强度下对所述可异养的微藻进行异养培养，其中，所述第二光照强度小于所述第一光照强度。
可选的，所述第一光照强度为30-50μmol/m2·S。
本发明实施例提供一种微藻的脂肪酸诱导方法，通过在第一光照强度下对所述可异养培养的微藻进行脂肪酸诱导培养，并控制所述第一光照强度为1-50μmol/m2·S，微藻生长的碳源和能量均来源于异养培养所采用的有机物，光仅作为信号因子，在代谢和基因水平上调控微藻细胞的代谢和细胞分裂，与在黑暗中异养培养相比，藻细胞的生长速度和产量以及诱导期脂肪酸累积速度和脂肪酸的最终产量均有明显提高，这是因为：光作为信号因子，能够对异养培养产生调控作用，加快异养代谢速率，并且，有利于TCA循环中的三种关键酶中柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶表达水平的上调，为TCA循环提供更多的中间代谢物，而剩余的一种酶—苹果酸脱氢酶下调后迫使更多的苹果酸流向脂肪酸合成，从而能够提高TCA循环的活性，进而能够提高脂肪酸的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的实施例2中对照组和实验组在培养6天、培养8天和培养10天时的脂肪酸含量的对照图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种微藻的脂肪酸诱导方法，包括：
对可异养的微藻进行异养培养，并在异养培养的后期，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养；
其中，所述第一光照强度为1-50μmol/m2·S。
其中，在异养培养过程中，需氧生物体内普遍存在的代谢途径，也称为TCA循环，分布在线粒体，又称为柠檬酸循环或者三羧酸循环，三羧酸循环是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。
三羧酸循环的过程主要包括三个阶段：
第一阶段，丙酮酸的生成(胞浆)
葡萄糖+2NAD+2ADP+2Pi→2(丙酮酸+ATP+NADH+H)
第二阶段，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶a
多酶复合体是催化功能上有联系的几种酶通过非共价键连接彼此嵌合形成的复合体。其中每一个酶都有其特定的催化功能，都有其催化活性必需的辅酶。
第三阶段，乙酰辅酶a进入三羧酸循环彻底氧化
(1)乙酰CoA与草酰乙酸在柠檬酸合酶的作用下缩合形成柠檬酸
乙酰CoA+草酰乙酸→柠檬酸+CoA-SH
(2)柠檬酸在柠檬酸异构酶的作用下异构化生成异柠檬酸
(3)异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶(线粒体中以NAD为辅酶)作用下氧化脱羧生成α-酮戊二酸
异柠檬酸+NAD→α-酮戊二酸+CO2+NADH+H
(4)α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱羧酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A
α-酮戊二酸+CoA-SH+NAD→琥珀酰CoA+CO2+NADH+H
(5)琥珀酰CoA转变为琥珀酸
GDP是指二磷酸鸟苷。
(6)琥珀酸氧化脱氢生成延胡索酸
FAD是黄素腺嘌呤二核苷酸，FADH2是还原型黄素二核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)递氢体、蛋白结合性载体(还原型电子载体)和还原型辅酶的一种。
(7)延胡索酸水化生成苹果酸
延胡索酸+H2O→苹果酸
(8)苹果酸在苹果酸脱氢酶的作用下脱氢生成草酰乙酸
本发明实施例提供一种微藻的脂肪酸诱导方法，通过在第一光照强度下对所述可异养培养的微藻进行脂肪酸诱导培养，并控制所述第一光照强度为1-50μmol/m2·S，其生长的碳源和能量均来源于异养培养所采用的有机物，光仅作为信号因子，在代谢和基因水平上调控微藻细胞的代谢和细胞分裂，与在黑暗中异养培养相比，藻细胞的生长速度和产量以及诱导期脂肪酸累积速度和脂肪酸的最终产量均有明显提高，这是因为：光作为信号因子，能够对异养培养产生调控作用，加快异养代谢速率，并且，有利于TCA循环中的三种关键酶中柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶表达水平的上调，为TCA循环提供更多的中间代谢物，而剩余的一种酶—苹果酸脱氢酶下调后迫使TCA过程产生的苹果酸更多的流向脂肪酸合成，从而能够提高TCA循环的活性，进而提高脂肪酸的产量。
示例性的，所述可异养的微藻可以为小球藻(Chorella)、栅藻(Scenedesmus)、雨生红球藻(Haematococcus)、三角褐指藻
(Phaeodactylum)、杜氏藻(Dunaliella)、金藻(Chrysophyta)和微拟球藻(Nannochloropsis)等。
这里，所述可异养的微藻是指能够在异养条件下进行脂肪酸生产的微藻。尤其是指在异养条件下脂肪酸产量低，和/或脂肪酸生产速率慢的微藻。
本发明的一实施例中，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液的碳氮摩尔比为大于等于20:1。在该碳氮摩尔比下，有利于促使TCA循环中的三种关键酶中柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶的分泌，使得柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶表达水平上调，为TCA循环提供更多的中间代谢物，并使得苹果酸脱氢酶下调，迫使更多的苹果酸流向脂肪酸合成，能够提高TCA循环的活性，从而能够提高脂肪酸的产量。
本发明的一优选实施例中，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度根据所述第一光照强度的大小来确定；
具体的，当所述第一光照强度为1-10μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为10-20g/L；
当所述第一光照强度为11-20μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为21-30g/L；
当所述第一光照强度为21-30μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为31-40g/L；
当所述第一光照强度为31-50μmol/m2·S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为41-50g/L。
在本发明实施例中，通过根据所述第一光照强度的大小确定所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度，在光照强度增加时碳源浓度相应增加，能够为微藻加快脂肪酸累积速度提供相应的能量供应，有利于微藻的脂肪酸产出。
其中，需要说明的是，当所述第一光照强度为1-30μmol/m2·S时，在微藻的脂肪酸最终含量确定的情况下，能够提高脂肪酸累积速度，缩短脂肪酸累积周期，而当所述第一光照强度为31-50μmol/m2·S时，则更有利于提高脂肪酸的最终含量。
而不同的微藻所对应的脂肪酸累积能力在相同的光照强度下并不相同，因此，优选的，所述第一光照强度的大小可以根据所述微藻的种类来确定。以最大程度上提高微藻的脂肪酸累积速度以及脂肪酸的最终含量。
本发明的又一实施例中，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养时，所述方法还包括：
在整个培养周期内，控制培养液中的溶氧至少在半个周期内保持在1ppm以下。
通过弱光和溶氧降低相结合对所述微藻的代谢进行调控，能够进一步增加TCA循环中柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶表达水平，降低苹果酸脱氢酶，能够提高TCA循环活性，从而能够进一步提高脂肪酸的产量。
本发明的又一实施例中，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养时，所述方法还包括：
在整个培养周期内，至少在半个周期内对所述微藻进行高温胁迫或低温胁迫。
通过弱光和温度相结合的方式对所述微藻的代谢进行调控，同样能够进一步提高脂肪酸的产量。
当然，也可以将弱光、温度和溶氧降低等相结合进行脂肪酸诱导，能够对所述微藻的代谢进行协同调控，从而能够最大程度上提高脂肪酸的产量。
本发明的一实施例中，所述高温胁迫的温度为28-30℃，低温胁迫的温度为10-15℃。
本发明的又一实施例中，在第二光照强度下对所述可异养的微藻进行异养培养，其中，所述第二光照强度小于所述第一光照强度。
在本发明实施例中，通过在异养培养的前期即对所述可异养的微藻补加微弱的光照，能够使微藻细胞快速适应有机碳环境，加快异养代谢速率。
为了便于对所述第二光照强度进行调节，优选的，所述第一光照强度为30-50μmol/m2·S。
以下，将通过实施例对本发明进行说明。这些实施例仅是为了具体说明本发明而提出的示例，本领域技术人员可以知道的是本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1
所述实施例1以小球藻为例对微藻进行脂肪酸诱导。
1、培养藻种
配制50ml异养培养基(如BG11培养基补加20g/L的葡萄糖)，装入250ml三角瓶灭菌后，将小球藻接种于所述三角瓶中，在黑暗条件下放入摇床，以150转/分的速度进行振荡，培养三天后获得一级藻种；
将所获得的一级藻种接种于2份装有500ml灭菌的异养培养基的三角瓶中，放入摇床继续在黑暗条件下振荡培养7天，离心去除培养液，获得二级藻种。
2、脂肪酸诱导培养
将所获得的二级藻种重悬于不含有氮源的BG11培养基中，并分为5份各200ml后装入500ml三角瓶中，分别标记为对照组1、实验组1、实验组2、实验组3和实验组4，按照表1所示分别补加相应浓度的葡萄糖和相应强度的光照，并在对照组1、实验组1-实验组4中补加硝酸钠作为氮源，放入摇床以150转/分的速度进行振荡，进行脂肪酸诱导，具体诱导条件见如下表1所示。
表1
3、培养4天后结束脂肪酸诱导，将各组培养液进行离心浓缩，分别获得藻液，将各组所获得的藻液进行冷冻干燥获得藻粉，并采用有机溶剂提取各组藻粉中有机相进行浓缩称重后，计算各组脂肪酸产量和脂肪酸含量，其中，脂肪酸产量＝生物质浓度×脂肪酸含量÷培养天数。结果如下表2所示。
表2
组名 脂肪酸产量 脂肪酸含量
对照组1 0.09g/L/d 30％
实验组1 0.13g/L/d 35％
实验组2 0.14g/L/d 38％
实验组3 0.18g/L/d 43％
实验组4 0.22g/L/d 50％
由以上表2可知：实验组1-4通过在补加弱光的条件下进行脂肪酸诱导，与对照组1相比，脂肪酸含量和脂肪酸产量均有所提高，且脂肪酸含量和脂肪酸产量均随补加光照强度的增大而增大，并且，由实验组1-4比较可以得知：实验组4的脂肪酸含量和产量最高，而从能量利用角度方面，实验组1的葡萄糖浓度和光照强度最小，能量利用率最高。
实施例2
所述实施例2以裂殖壶菌藻为例对微藻进行脂肪酸诱导。
1、培养藻种
在灭菌后的异养培养基50ml中接种裂殖壶菌藻，放入摇床黑暗条件下培养3天获得一级藻种；
将所获得的一级藻种接入500ml灭菌异养培养基中装入1L三角瓶中，放入摇床黑暗培养7天，获得二级藻种。
将所获得的二级藻种接种至5cm直径玻璃管式反应器中，补加无菌异养培养基，装液量800ml，通入空气混合培养，取样监测细胞浓度变化，生物量增加缓慢时第一阶段培养结束，获得一定浓度的裂殖壶菌藻液，将所获得的裂殖壶菌藻液离心获得裂殖壶菌藻。
2、脂肪酸诱导培养
将所获得的裂殖壶菌藻一分为二，分别重悬于异养培养基中，碳氮比均为50:1，一份接入3cm直径玻璃管式反应器中黑暗诱导，作为对照组，温度25℃，另一份接入3cm直径玻璃管式反应器，采用人工灯管照射50μmol/m2/s的弱光，并在28-30℃下进行高温胁迫，作为实验组。
3、脂肪酸诱导培养6天后，分别取样检测对照组和实验组中脂肪酸含量，并每隔2天对对照组合实验组中的脂肪酸含量进行检测，获得如图1所示的对照组和实验组在培养6天、培养8天和培养10天时的脂肪酸含量的对照图。
由图1可知：随着培养时间的延长，对照组和实验组中的脂肪酸含量均呈不断增长的趋势，且实验组的脂肪酸含量高于同期培养的对照组的脂肪酸含量。
实施例3
所述实施例3以裂殖壶菌为例对微藻进行脂肪酸诱导。
1、培养藻种
该具体步骤与实施例2基本相同，再此不再赘述。
2、脂肪酸诱导培养
将所获得的裂殖壶菌藻一分为二，分别重悬于异养培养基中，碳氮比均为40:1，一份接入3cm直径玻璃管式反应器中黑暗诱导，作为对照组，温度25℃，通入空气混合进行脂肪酸诱导，另一份接入3cm直径玻璃管式反应器，采用人工灯管照射25μmol/m2/s的弱光，通入氮气以排除培养液中的氧气，同时在整个培养周期中对培养液中的氧气含量进行监控，当氧气含量大于1ppm时，加大氮气的通入量，使得氧气含量始终保持在1ppm以下，作为实验组；
3、脂肪酸诱导培养6天后，采用实施例1所示的检测方法分别对对照组和实验组中脂肪酸产量进行计算，获得实验组中脂肪酸产量为0.11g/L/d，脂肪酸含量为45％，对照组中脂肪酸产量为0.06g/L/d，脂肪酸含量为36％。
结论：通过弱光和溶氧降低结合对裂殖壶菌藻进行脂肪酸诱导培养，与黑暗条件下进行脂肪酸诱导培养相比，能够提高脂肪酸含量和脂肪酸产量。
实施例4
所述实施例4以小球藻为例对微藻进行脂肪酸诱导。
1、培养藻种
该具体步骤与实施例1基本相同，再此不再赘述。
2、脂肪酸诱导培养
将所获得的二级藻种重悬于不含有氮源的BG11培养基中，并分为8份各150ml后装入500ml三角瓶中，分别标记为对照组1、对照组2、对照组3、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4和实验组5，按照表3所示分别补加相应浓度的葡萄糖和相应强度的光照，放入摇床并分别在所对应的温度下以150转/分的速度进行振荡，进行脂肪酸诱导，具体诱导条件如下表3所示。
表3
组名 诱导条件
对照组1 黑暗，葡萄糖30g/L，25℃，不密封
对照组2 黑暗，葡萄糖30g/L，10℃，不密封
对照组3 黑暗，葡萄糖30g/L，30℃，密封
实验组1 光照1μmol/m2/s，葡萄糖10g/L，30℃，密封
实验组2 光照10μmol/m2/s，葡萄糖20g/L，10℃，密封
实验组3 光照20μmol/m2/s，葡萄糖30g/L，10℃，密封
实验组4 光照30μmol/m2/s，葡萄糖40g/L，10℃，密封
实验组5 光照50μmol/m2/s，葡萄糖50g/L，10℃，密封
其中，表3中的不密封表示是在有氧条件下进行的，密封则表示是在缺氧条件下进行的，25℃是指常温培养条件，而10℃则是指低温诱导条件，30℃则是指高温诱导条件。
3、培养4天后结束脂肪酸诱导，将各组培养液进行离心浓缩，分别获得藻液，将各组所获得的藻液进行冷冻干燥获得藻粉，并采用有机溶剂提取各组藻粉中有机相进行浓缩称重后，计算各组脂肪酸产量和脂肪酸含量，其中，脂肪酸产量＝生物质浓度×脂肪酸含量÷培养天数。结果如下表4所示。
表4
组名 脂肪酸产量 脂肪酸含量
对照组1 0.09g/L/d 32％
对照组2 0.12g/L/d 35％
对照组3 0.10g/L/d 37％
实验组1 0.10g/L/d 36％
实验组2 0.15g/L/d 39％
实验组3 0.18g/L/d 41％
实验组4 0.21g/L/d 45％
实验组5 0.25g/L/d 52％
参见表4，由对照组1、对照组2和对照组3可知：通过进行高温诱导和缺氧条件相结合或者低温诱导均能够提高脂肪酸产量和含量，由实验组1-5和对照组1-3比较可知：在弱光、高/低温诱导和缺氧条件相结合的条件下，能够提高脂肪酸含量和产量，且随着弱光强度和葡萄糖浓度的增大，脂肪酸含量和产量呈递增趋势。
综上所述，通过在弱光、温度胁迫和缺氧这3种诱导条件下均可提高脂肪酸产量和脂肪酸含量，并且脂肪酸产量随着光照强度的增大而增大，通过将任意两种或两种以上的诱导条件结合，均能够进一步提高脂肪酸产量和脂肪酸含量。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种微藻的脂肪酸诱导方法，其特征在于，包括：
对可异养的微藻进行异养培养，并在异养培养的后期，在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养；
其中，所述第一光照强度为1-50μmol/m2〃S。
2.根据权利要求1所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液的碳氮摩尔比为大于等于20:1。
3.根据权利要求1所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度根据所述第一光照强度的大小来确定；
具体的，当所述第一光照强度为1-10μmol/m2〃S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为10-20g/L；
当所述第一光照强度为11-20μmol/m2〃S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为21-30g/L；
当所述第一光照强度为21-30μmol/m2〃S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为31-40g/L；
当所述第一光照强度为31-50μmol/m2〃S时，所述脂肪酸诱导培养所采用的培养液中的碳源浓度为41-50g/L。
4.根据权利要求1所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
所述第一光照强度的大小根据所述微藻的种类来确定。
5.根据权利要求1所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养时，所述方法还包括：
在整个培养周期内，控制培养液中的溶氧至少在半个周期内保持在1ppm以下。
6.根据权利要求1所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
在第一光照强度下对所述微藻进行脂肪酸诱导培养时，所述方法还包括：
在整个培养周期内，至少在半个周期内对所述微藻进行高温胁迫或低温胁迫。
7.根据权利要求6所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
所述高温胁迫的温度为28-30℃，低温胁迫的温度为10-15℃。
8.根据权利要求1所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
在第二光照强度下对所述可异养的微藻进行异养培养，其中，所述第二光照强度小于所述第一光照强度。
9.根据权利要求8所述的脂肪酸诱导方法，其特征在于，
所述第一光照强度为30-50μmol/m2〃S。
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