CN110656049A - 一种多段式盐胁迫微藻培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其包括如下步骤：(1)预培养微藻细胞培养液；(2)分多段、渐进式对预培养后的微藻细胞培养液进行盐胁迫处理。本发明通过使微藻细胞分多个阶段、渐进式接触不同浓度的盐胁迫培养液，为藻细胞适应高强度盐胁迫提供了时间，有利于藻细胞内损伤修复物质的大量生产和积累。并且能大大减少因直接强盐胁迫而导致藻细胞大量死亡。通过本发明的方法能够实现微藻细胞在渐进的三种盐胁迫条件下连续、高效生长，并能大量提高微藻细胞中超氧化物歧化酶、多不饱合脂肪酸含量，可广泛用于生产制造超氧化物歧化酶、多不饱和脂肪酸等损伤修复活性物质。

Description

一种多段式盐胁迫微藻培养方法
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，具体涉及一种多段式盐胁迫微藻培养方法。
背景技术
微藻作为地球上的先锋物种，是一种利用光能、二氧化碳和水在其细胞内合成各种有机物的自养生物，对环境的适应能力极强。这种极强的适应能力与微藻细胞在长期进化过程中形成的高效代谢路径和大量产生并积累的各类损伤修复活性物质息息相关。
已有大量的研究报道指出微藻细胞在胁迫培养条件下，所产生并积累的超氧化物歧化酶、多不饱和脂肪酸、色素等具有损伤修复活性的物质远高于正常培养的微藻细胞。盐胁迫是一种常见的环境胁迫方式，根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.5438亿公顷，其中我国为9913万公顷。盐碱生境对藻类生长产生较大影响，已有相当多的研究指出中低剂量、短时间的盐胁迫能够刺激微藻细胞产生胁迫适应机制，该机制能使微藻细胞大量产生并积累各类损伤修复活性物质。而这些损伤修复活性物质经提取纯化以后不但可用于医疗和营养保健品，而且已经越来越多的应用于化妆和护肤品行业，具有广阔的市场应用前景。
不同藻类在不同盐度强度中培养，其细胞包内损伤修复活性物质的产生和积累量具有显著性差异。目前并没有利用盐胁迫，对微藻进行分阶段渐进式胁迫，进而使其大量产生并积累损伤修复活性物质的方法公开。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种多段式盐胁迫微藻培养方法，通过此方法能够实现微藻细胞在渐进的多种盐胁迫条件下连续、高效生长，并能大量提高微藻细胞中超氧化物歧化酶、多不饱合脂肪酸含量，可广泛用于生产制造超氧化物歧化酶、多不饱和脂肪酸等损伤修复活性物质。
本发明的一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其包括如下步骤：
(1)预培养微藻细胞培养液；
(2)分多段、渐进式对预培养后的微藻细胞培养液进行盐胁迫处理。
优选所述步骤(2)为分三段对预培养后的微藻细胞培养液进行盐胁迫处理，其包括如下步骤：
S1.添加氯化钠至微藻细胞培养液中，使培养液中氯化钠的浓度为0.8mol/L，光照通气培养2d；
S2.再向步骤S1得到的微藻细胞培养液中添加氯化钠，至培养液中氯化钠浓度为1.7mol/L，光照通气培养4d；
S3.再向步骤S2得到的微藻细胞培养液中添加氯化钠，至培养液中氯化钠浓度为3.4mol/L，光照通气培养4d。
进一步，所述光照通气培养的光照强度均为100μmol/(m2·s)，通入的气体为无菌空气。
进一步，本发明的一种多段式盐胁迫微藻培养方法中，步骤(1)所述预培养的微藻细胞预培养液中微藻细胞的浓度为1.0x106个/L—1.2x106个/L。
优选所述微藻细胞培养液使用衣藻或小球藻作为藻种。
优选其步骤(1)所述的预培养微藻细胞培养液的方法是；配制TAP培养基，灭菌后向其中接入微藻细胞，将接种后的培养液置于25℃，日光灯光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中，培养7天，获得微藻细胞预培养液。
有益效果
1、本发明通过使微藻细胞分多个阶段、渐进式接触不同浓度的盐胁迫培养液，为藻细胞适应高强度盐胁迫提供了时间，有利于藻细胞内损伤修复物质的大量生产和积累。
2、本发明通过使微藻细胞分多个阶段，渐进式接触不同浓度的盐胁迫培养液，能大大减少因直接强盐胁迫而导致藻细胞大量死亡。
3、通过本发明的方法能够实现微藻细胞在渐进的三种盐胁迫条件下连续、高效生长，并能大量提高微藻细胞中超氧化物歧化酶、多不饱合脂肪酸含量，是一种生产制造超氧化物歧化酶、多不饱和脂肪酸等损伤修复活性物质的好方法。
附图说明
图1培养装置示意图
附图标记
1—无菌空气入口
具体实施方式
下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的原材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或已公开。
实施例1：
采用衣藻(sp.cw15，购于美国杜克大学藻种库)细胞作为藻种进行一种三段式盐胁迫微藻培养，具体步骤如下：
1.获得衣藻细胞预培养液。配制TAP培养基3L，具体配方如下表1所示。灭菌后向其中接入衣藻(sp.cw15)藻细胞，将接种后的培养液置于25℃，日光灯光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中，培养7天，获得衣藻细胞预培养液。
表1 TAP培养基配方
Figure BDA0002269823150000041
Figure BDA0002269823150000051
2.检测预培养液中衣藻细胞浓度。摇匀衣藻细胞预培养液后利用血球计数板在显微镜下进行计数，计算预培养液中衣藻细胞浓度为1.1x106个/L。
3.分组培养。将3L预培养的衣藻细胞培养液均分为3等份，然后分别加入到三套同样的培养装置中，培养装置如图1所示，装置主体为灭菌三角瓶，瓶口塞有插着两个玻璃弯管的密封塞。三套装置分别分为甲、乙、丙三组，其中甲组瓶不做其它处理。向乙组瓶中添加氯化钠至培养液中氯化钠浓度为3.4mol/L。对丙组瓶分三段逐渐添加氯化钠：培养第1-2d保持培养液中氯化钠浓度为0.8mol/L，培养第3-6d保持培养液中氯化钠浓度为1.7mol/L，培养第7-10d保持培养液中氯化钠浓度为3.4mol/L。在培养过程中，甲、乙、丙三瓶都通过无菌空气入口1通入无菌空气，都置于25℃，光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中培养。
4.损伤修复活性物质含量检测。十天后分别离心收集甲、乙、丙三组瓶中的衣藻细胞。采用Biovision公司超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒对衣藻细胞进行超氧化物歧化酶活性检测，检测方法和步骤参见试剂盒说明书。采用上海古朵生物科技有限公司过氧化氢酶(CAT)含量试剂盒测定衣藻细胞过氧化氢酶活性，测定方法和步骤参见试剂盒说明书。多不饱和脂肪酸含量测定采用在235nm紫外分光光度法测定，测定方法参见国标GB/T21495-2008/ISO7847:1987。
5.实验结果。衣藻细胞损伤修复活性物质含量检测结果见下表1。实验结果显示丙组衣藻细胞中超氧化物歧化酶、多不饱和脂肪酸、过氧化氢酶含量都显著高于甲、乙两组。
表2衣藻细胞损伤修复活性物质含量检测结果
检测项目 甲组 乙组 丙组
SOD酶活力/10<sup>5</sup>cell 1473.3 3211 6637.3
CAT酶活力/10<sup>5</sup>cell 2390 3580 9145.3
多不饱和脂肪酸含量/10<sup>5</sup>cell(ug) 1.3 7 19
实施例2：
采用小球藻(sp.dh8248，实验室保存，采集于武汉东湖)细胞作为藻种进行一种三段式盐胁迫微藻培养，具体步骤如下：
1.获得小球藻细胞预培养液。配制绿藻培养通用TAP培养基3L，TAP培养基配方如表1所示。灭菌后向其中接入小球藻细胞，将接种后的培养液置于25℃，日光灯光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中，培养7天，即可获得小球藻细胞预培养液。
2.检测预培养液中小球藻细胞浓度。摇匀小球藻细胞预培养液后，利用血球计数板在显微镜下进行计数，计算预培养液中小球藻细胞浓度为1.0x106个/L。
3.分组培养将3L预培养的小球藻细胞培养液均分为3等份，然后其它操作步骤与实施例1中的分组培养相同，将这3份分别加入到三套同样的培养装置中，培养装置如图1所示，其中甲组瓶不做其它处理。向乙组瓶中添加氯化钠至培养液中氯化钠浓度为3.4mol/L。对丙组瓶分三段逐渐添加氯化钠：培养第1-2d保持培养液中氯化钠浓度为0.8mol/L，培养第3-6d保持培养液中氯化钠浓度为1.7mol/L，培养第7-10d保持培养液中氯化钠浓度为3.4mol/L。在培养过程中，甲、乙、丙三瓶都通过无菌空气入口1通入无菌空气，都置于25℃，光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中培养。
4.损伤修复活性物质含量检测。检测项目和方法同实施例1。
5.实验结果。小球藻细胞损伤修复活性物质含量检测结果见下表2。实验结果显示丙组小球藻细胞中超氧化物歧化酶、多不饱和脂肪酸、过氧化氢酶含量都显著高于甲、乙两组。
表3小球藻细胞损伤修复活性物质含量检测结果
检测项目 甲组 乙组 丙组
SOD酶活力/10<sup>5</sup>cell 1111 3012 6320
CAT酶活力/10<sup>5</sup>cell 2021 3321 8520
多不饱和脂肪酸含量/10<sup>5</sup>cell(ug) 2.22 6 12

Claims (6)

1.一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其特征在于其包括如下步骤：
(1)预培养微藻细胞培养液；
(2)分多段、渐进式对预培养后的微藻细胞培养液进行盐胁迫处理。
2.如权利要求1所述的一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其特征在于所述步骤(2)为分三段对预培养后的微藻细胞培养液进行盐胁迫处理，其包括如下步骤：
S1.添加氯化钠至微藻细胞培养液中，使培养液中氯化钠的浓度为0.8mol/L，光照通气培养2d；
S2.再向步骤S1得到的微藻细胞培养液中添加氯化钠，至培养液中氯化钠浓度为1.7mol/L，光照通气培养4d；
S3.再向步骤S2得到的微藻细胞培养液中添加氯化钠，至培养液中氯化钠浓度为3.4mol/L，光照通气培养4d。
3.根据权利要求2所述的一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其特征在于所述光照通气培养的光照强度均为100μmol/(m2·s)，通入的气体为无菌空气。
4.如权利要求1所述的一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其特征在于其步骤(1)所述预培养的微藻细胞预培养液中微藻细胞的浓度为1.0x106个/L—1.2x106个/L。
5.根据权利要求1所述的一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其特征在于所述微藻细胞培养液使用衣藻或小球藻作为藻种。
6.如权利要求1所述的一种多段式盐胁迫微藻培养方法，其特征在于其步骤(1)所述的预培养微藻细胞培养液的方法是；配制TAP培养基，灭菌后向其中接入微藻细胞，将接种后的培养液置于25℃，日光灯光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中，培养7天，获得微藻细胞预培养液。
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