CN104611231A - 耐盐微藻的选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐盐微藻的选育方法，包括步骤：1)将微藻藻株接种至初始培养基中，进行培养；2)将培养后的微藻藻株接种至添加了氯化钠的进化培养基中进行培养；3)以步骤2)为一个循环，将该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中继续培养1～80个循环；4)当该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中生物量达到0.8-1.2g/L时，提高培养基中的氯化钠浓度，继续培养1～80个循环，使其生物量达到0.8-1.2g/L。本发明简单易行，无需生物学研究基础，同时避免了诱变育种中使用诱变剂对人体可能带来的伤害，并可快速直接获得目的性状提升的进化藻株。

Description

耐盐微藻的选育方法
技术领域
本发明涉及一种微藻的选育方法，特别是涉及一种耐盐微藻的选育方法。
背景技术
微藻是指那些在显微镜下才能分辨其形态的微小藻类类群，种类众多且数量庞大，是生态系统中主要的初级生产者。由于微藻具有丰富的遗传多样性，其多种代谢产物，包括多糖、脂类、蛋白质等在食品、医药、可再生能源等领域都具有良好的应用前景。但是，一般藻种难以适应人工环境，导致生长缓慢，可提取的高价值成分含量低且提纯困难等问题，极大地阻碍了微藻的开发利用。因此，选育生长快速、抗逆境胁迫和高附加值活性物质含量高等性状优良的藻种已经成为微藻相关产品研发的重要途径。
目前常规的藻种选育方法主要为自然筛选、诱变育种和基因工程育种。诱变育种(中国专利公开CN102776171A、CN103468575A、CN102888393A、CN103160494A)以物理或化学诱变剂诱发基因突变，通过筛选从众多变异株中筛选出目标性状优良的突变株。诱变育种特点是藻株突变率高，育种进程快。但由于诱变的随机性，难以有效地控制变异的方向和性质，产生目的突变株频率低，难以得到具有多种优良性状的突变株。基因工程育种(中国专利公开CN102827856A、CN104031934A)通过重组DNA等技术，引入外源目的基因或突变从而形成新品种，其特点是育种目的明确，性状改良效果明显，但其应用需要大量的基因功能研究基础，且技术难度较高。
适应性实验室进化技术(Adaptive laboratory evolution)是近年来出现的提高微生物在环境胁迫条件下耐受性的一种育种技术，在适应性实验室进化过程中，微生物一直保持良好的生长状态，并随着培养条件的逐渐变化，稳定地增强所需要的各种性状。因此，该技术具有较好的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐盐微藻的选育方法。本发明通过适应性实验室进化技术提高微藻对高浓度盐胁迫耐受性，取得了非常理想的效果，对选育高耐受性藻株及其应用有着极其重要的意义。
为解决上述技术问题，本发明的耐盐微藻的选育方法，包括步骤：
1)将微藻藻株接种至初始培养基中，进行培养；
2)将培养后的微藻藻株接种至添加了氯化钠的进化培养基中进行培养；
3)以步骤2)为一个循环，将该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中继续培养1～80个循环；
4)当该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中生物量达到0.8-1.2g/L时，提高培养基中的氯化钠浓度，继续培养1～80个循环，使其生物量达到0.8-1.2g/L。
所述步骤1)中，微藻藻株包括：念珠藻目(Nostocales)藻类；该念珠藻目藻类，包括：念珠藻或鱼腥藻等；接种的浓度为0.01～0.5g/L；
初始培养基的组分包括：磷酸氢二钾0.032-0.048g/L、七水合硫酸镁0.06-0.09g/L、二水合氯化钙0.029-0.043g/L、碳酸钠0.018-0.022g/L、柠檬酸0.005-0.007g/L、柠檬酸铁铵0.005-0.007g/L、EDTA(乙二胺四乙酸)0.0009-0.0011g/L、微量元素溶液A51mL/L；其中，所述微量元素液A5中的组分为：硼酸2.29-3.43g/L、二水合氯化锰1.45-2.17g/L、七水合硫酸锌0.178-0.266g/L、钼酸钠0.312-0.468g/L、五水合硫酸铜0.063-0.095g/L、六水合硝酸钴0.039-0.059g/L。
步骤1)中，培养的条件优选如下：培养温度为22-28℃，光照强度为50-200μmol/(m2·s)，光照时间每天8-16h；培养的程度优选为培养至对数生长期。
所述步骤2)中，接种的浓度为0.01～0.5g/L；添加了氯化钠的进化培养基中，氯化钠的浓度优选为0.59～5.85g/L；
进化培养基的组分包括：磷酸氢二钾0.032-0.048g/L、七水合硫酸镁0.06-0.09g/L、二水合氯化钙0.029-0.043g/L、碳酸钠0.018-0.022g/L、柠檬酸0.005-0.007g/L、柠檬酸铁铵0.005-0.007g/L、EDTA0.0009-0.0011g/L、微量元素溶液A51mL/L；其中，所述微量元素液A5中的组分为：硼酸2.29-3.43g/L、二水合氯化锰1.45-2.17g/L、七水合硫酸锌0.178-0.266g/L、钼酸钠0.312-0.468g/L、五水合硫酸铜0.063-0.095g/L、六水合硝酸钴0.039-0.059g/L。
所述步骤2)中，培养的条件优选如下：培养温度为22-28℃，光照强度为50-200μmol/(m2·s)，光照时间为每天8-16h，培养的时间优选为2～10天；
所述步骤4)的提高培养基中的氯化钠浓度中，将氯化钠浓度提高至3.52～11.70g/L。
所述方法，还包括步骤：5)在上述步骤的基础上，以每次0.59～5.85g/L的幅度不断提高培养基中氯化钠的浓度，每次提高氯化钠浓度后培养1～80个循环，直至培养基中氯化钠最终浓度达到5.85-17.55g/L，同时使获得的进化藻株能够在此条件下快速生长并生物量明显提高。
另外，本发明还提供一种通过上述方法所获得的微藻。其中，所述微藻是一种耐受高浓度盐的微藻，其能够在高盐浓度条件下快速生长并明显提高生物量，如该微藻在高盐浓度(即NaCl的浓度为5.85～17.55g/L)条件下培养，生物量达到1.30～2.64g/L。
本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的耐受高浓度盐胁迫的微藻在高盐浓度(100-300mM NaCl)胁迫条件下，比出发藻株具有更好生长性能和生物产量。
2、本发明提供的选育方法简单易行，无需生物学研究基础，同时避免了诱变育种中使用诱变剂对人体可能带来的伤害。
3、本发明提供的选育方法，利用特定胁迫条件，限定了藻株的进化方向，渐进性提高进化藻株耐受能力，可快速直接获得目的性状提升的进化藻株。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是本发明的选育路线示意图。
具体实施方式
本发明的耐盐微藻的选育方法，可按照图1所示的流程进行操作，下面以具体的藻株进行详细说明。
实施例1念珠藻(Nostoc sp.CM7)的选育方法
1、出发藻株
出发藻株为念珠藻(Nostoc sp.PCC7120)。
2、选育方法
1)以念珠藻(Nostoc sp.PCC7120)为出发藻株，以接种浓度为0.03g/L，将其在初始培养基中在25℃下，光照强度为50μmol/(m2·s)，光照时间为每天12h，培养至对数生长期；
其中，初始培养基的配方为：磷酸氢二钾0.04g/L、七水合硫酸镁0.075g/L、二水合氯化钙0.036g/L、碳酸钠0.02g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA 0.001g/L、微量元素溶液A51mL/L；
所述微量元素液A5的制备方法为：取硼酸2.86g、二水合氯化锰1.81g、七水合硫酸锌0.222g、钼酸钠0.39g、五水合硫酸铜0.079g、六水合硝酸钴0.049g用去离子水溶解后，再用去离子水定容至1L。
2)以接种浓度0.03g/L接种于含5.85g/L氯化钠的进化培养基中，在25℃、光照强度为50μmol/(mW·s)、光照时间为每天12h，培养7天；
3)以上述步骤2)为一个循环周期，将该藻株在含5.85g/L氯化钠的进化培养基中继续培养10个循环；
4)当该藻株在含5.85g/L氯化钠的进化培养基中，生物量能够达到1g/L时，提高进化培养基的氯化钠浓度至8.78g/L，继续进行培养10个循环。
5)在上述步骤的基础上，以每次2.93g/L的幅度不断提高培养基中氯化钠浓度，每次提高氯化钠浓度后培养10个循环，直至培养基中氯化钠浓度达到17.55g/L，使进化藻株能够在此条件下快速生长并生物量明显提高。
上述方法中，所述进化培养基为：磷酸氢二钾0.04g/L、七水合硫酸镁0.075g/L、二水合氯化钙0.036g/L、碳酸钠0.02g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001g/L、上述微量元素溶液A51mL/L，氯化钠根据需要浓度添加。
当培养体系中氯化钠浓度达到300mM时，取样经适当稀释后涂布于氯化钠浓度为300mM的琼脂糖平板上。挑选单藻落进行扩大培养，根据生物量选择一株生物量最高的进化突变株(命名为Nostoc sp.CM7)。
3.进化藻株
根据上述选育方法，得到进化藻株(Nostoc sp.CM7)，其可耐受高浓度盐胁迫，在培养基中含有100-300mM氯化钠的条件下，其生物量可以达到1.30-2.64g/L。
实施例2
1)将满江红鱼腥藻(Anabaena azollae)为出发藻株，以0.25g/L的接种浓度，接种至初始培养基中，在培养温度为27℃、光照强度为100μmol/(mW·s)、光照时间每天10h，培养至对数生长期。
其中，初始培养基的配方为：磷酸氢二钾0.035g/L、七水合硫酸镁0.08g/L、二水合氯化钙0.040g/L、碳酸钠0.019g/L、柠檬酸0.0055g/L、柠檬酸铁铵0.0055g/L、EDTA 0.00095g/L、微量元素溶液A51mL/L；
所述微量元素液A5的制备方法为：取硼酸3.00g、二水合氯化锰2.00g、七水合硫酸锌0.200g、钼酸钠0.400g、五水合硫酸铜0.090g、六水合硝酸钴0.055g，用去离子水溶解后，再用去离子水定容至1L。
2)以0.25g/L的接种浓度，将培养后的微藻藻株接种至添加了氯化钠的进化培养基中，在培养温度为27℃、光照强度为100μmol/(m2·s)、光照时间每天10h，培养4天；
其中，氯化钠的浓度为2.5g/L；
进化培养基为：磷酸氢二钾0.035g、七水合硫酸镁0.065g/L、二水合氯化钙0.030g/L、碳酸钠0.019g/L、柠檬酸0.0055g/L、柠檬酸铁铵0.0055g/L、EDTA 0.00095g/L、上述微量元素溶液A51mL/L，氯化钠根据需要浓度添加(即上述的氯化钠的浓度为2.5g/L)。
3)以步骤2)为一个循环，将该藻株在上述添加了氯化钠的进化培养基中继续培养50个循环；
4)当该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中生物量达到0.85g/L时，提高培养基中的氯化钠浓度至5.65g/L，继续培养50个循环。
5)在上述步骤的基础上，以每次5.00g/L的幅度不断提高培养基中氯化钠的浓度，每次提高氯化钠浓度后培养50个循环，直至培养基中氯化钠最终浓度达到10.00g/L，得到耐盐的进化微藻，而且该进化藻株能够在此条件下快速生长并生物量明显提高。

Claims (9)

1.一种耐盐微藻的选育方法，其特征在于，包括步骤：
1)将微藻藻株接种至初始培养基中，进行培养；
2)将培养后的微藻藻株接种至添加了氯化钠的进化培养基中进行培养；
3)以步骤2)为一个循环，将该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中继续培养1～80个循环；
4)当该藻株在添加了氯化钠的进化培养基中生物量达到0.8-1.2g/L时，提高培养基中的氯化钠浓度，继续培养1～80个循环，使其生物量达到0.8-1.2g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，微藻藻株包括：念珠藻目藻类；
步骤1)中，接种的浓度为0.01～0.5g/L；
步骤1)中，培养的条件：培养温度为22-28℃，光照强度为50-200μmol/(m2·s)，光照时间每天8-16h；培养的程度为培养至对数生长期。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述念珠藻目藻类包括：念珠藻或鱼腥藻。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述初始培养基的组分包括：磷酸氢二钾0.032-0.048g/L、七水合硫酸镁0.06-0.09g/L、二水合氯化钙0.029-0.043g/L、碳酸钠0.018-0.022g/L、柠檬酸0.005-0.007g/L、柠檬酸铁铵0.005-0.007g/L、EDTA 0.0009-0.0011g/L、微量元素溶液A51mL/L；
其中，所述微量元素液A5中的组分为：硼酸2.29-3.43g/L、二水合氯化锰1.45-2.17g/L、七水合硫酸锌0.178-0.266g/L、钼酸钠0.312-0.468g/L、五水合硫酸铜0.063-0.095g/L、六水合硝酸钴0.039-0.059g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，接种的浓度为0.01～0.5g/L；
步骤2)中，培养的条件：培养温度为22-28℃，光照强度为50-200μmol/(m2·s)，光照时间为每天8-16h，培养的时间为2～10天。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，添加了氯化钠的进化培养基中，氯化钠的浓度为0.59～5.85g/L；
步骤2)中，进化培养基的组分包括：磷酸氢二钾0.032-0.048g/L、七水合硫酸镁0.06-0.09g/L、二水合氯化钙0.029-0.043g/L、碳酸钠0.018-0.022g/L、柠檬酸0.005-0.007g/L、柠檬酸铁铵0.005-0.007g/L、EDTA 0.0009-0.0011g/L、微量元素溶液A51mL/L；
其中，所述微量元素液A5中的组分为：硼酸2.29-3.43g/L、二水合氯化锰1.45-2.17g/L、七水合硫酸锌0.178-0.266g/L、钼酸钠0.312-0.468g/L、五水合硫酸铜0.063-0.095g/L、六水合硝酸钴0.039-0.059g/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)的提高培养基中的氯化钠浓度中，将氯化钠浓度提高至3.52～11.70g/L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法，还包括步骤：5)在上述步骤的基础上，以每次0.59～5.85g/L的幅度不断提高培养基中氯化钠的浓度，每次提高氯化钠浓度后培养1～80个循环，直至培养基中氯化钠最终浓度达到5.85-17.55g/L。
9.一种根据如权利要求1～8任一项所述的方法所获得的微藻。
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