CN114106981A - 一种微藻循环兼养培养方法、培养装置及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种微藻循环兼养培养方法、培养装置及应用，方法具体为：S1将微藻通入第一反应装置内进行异养培养，得到第一培养液；S2将第一培养液经循环回路输送至第二反应装置内，兼养培养得到第二培养液；S3将第二培养液经循环回路输送回第一反应装置内进行异养培养；S4重复步骤S2、S3，并控制微藻在第二反应装置中光照时长。装置采用仿生学设计，参照“动脉、静脉”携带气体的特征，当培养装置中微藻的生物量随培养时长的增加而增长时，微藻所需的光照条件同样也会发生相应变化，参照血液循环的控制，此时由差速蠕动泵提供动力对两培养液的停留时长进行实时动态调整，以保证微藻始终处于高速生长状态。

Description

一种微藻循环兼养培养方法、培养装置及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种微藻循环兼养培养方法、培养装置及应用。
背景技术
微藻是一类能够进行光合作用的单细胞生物，生存环境广泛，对生态环境起着重要作用。微藻作为一种光合微生物，能够生产多种天然产物，也由于其自身的特点，广泛应用于食品、能源和农业生产等方面。微藻由于具有光合系统，能够自养生长，因此多种光合生物反应器可用于微藻的培养。同时，一部分微藻也可以利用有机碳源进行异养培养，但是在异养过程中，微藻在发酵罐中利用有机碳源进行生长，其生长速度快且细胞浓度高，但微藻基本不再进行光合作用，无法起到固定CO2的作用，仅作为一种天然发酵微生物进行生产，大大限制了微藻在固碳方面的作用以及自身作为光合微生物的功能。因此，为了提高微藻的生长速度和生物质的产量，并使微藻行使其固碳能力以及生产和光合作用相关的产品，对微藻进行兼养培养是必要的。
中国专利文献CN 113136341 A(申请号202010060653.4)公开了一种光合微生物异养-自养的培养方法及其系统和生产生物质和生物能源的方法，培养方法具体为在第一气源下，将光合微生物送至反应器A中进行异养培养，得到第一培养液，将部分或全部的第一培养液在未经稀释下送至反应器B中，在光照和第二气源下，进行自养培养，得到第二培养液。此专利实现了对微藻的兼养，并通过在自养过程中提供特定的光照条件强化了自养培养提高了光合微生物的生物质品质，但对光合微生物的培养过程中未对异养和自养中两者比例进行控制使光合微生物能实现良好的光合效率和放氧效率，且培养过程中每次对培养液的转移过程都需要进行补液，浪费人力物力。
中国专利文献CN 102268374 A(申请号201010543083.0)公开了一种培养微藻的方法及组合式光生物反应器，在微藻培养过程中，采用微纳米曝气机将发酵罐中流出的培养物(即接种后的培养基与藻种的混合物)与通入的二氧化碳成分混合，然后流入培养管道进行充分的光合作用后再返回发酵罐，使微藻培养物在发酵罐、微纳米曝气机和培养管道中实现循环流动，以达到高效固定二氧化碳和高效培养微藻的技术和方法。此专利虽实现了培养液和微藻的循环，但此专利是在自养基础上，通过调整二氧化碳的加入方式来提高微藻的培养效率，并未实现兼养。进一步的，此专利主要强调了利用微纳米曝气机混合通入二氧化碳对于二氧化碳利用效率的作用，但在实际应用中，管道中二氧化碳浓度变化剧烈，使细胞受到巨大的环境变化，影响微藻的生长。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种微藻循环兼养培养方法、培养装置及应用，将异养-兼养过程进行循环，并通过控制异养和兼养部分的体积比例以及兼养过程中二氧化碳的梯度注入，发挥微藻的光合固碳能力，进而有效提高了微藻的生物量及其产物的含量。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种微藻循环兼养培养的方法，方法在由循环回路连接的第一反应装置和第二反应装置中进行，方法具体如下：
S1.在搅拌、通空气条件下，将微藻通入第一反应装置内进行异养培养，得到第一培养液；
S2.在光照下，将第一培养液经循环回路输送至第二反应装置内，并按照进样顺序逐渐增大CO2的通入浓度，兼养培养得到第二培养液；
S3.将第二培养液经循环回路输送回第一反应装置内进行异养培养；
S4.重复步骤S2、S3，并在重复过程中控制第一培养液和第二培养液的体积比。
优选的，上述方法中，第一培养液和第二培养液的体积比例为10:1-1:1，通过控制第一培养液和第二培养液的体积比例以使微藻具有更好的光合效率；进一步优选的，第一培养液和第二培养液的体积比例为5:1-1.5:1。
优选的，上述方法中，步骤S1中加入的微藻浓度为OD750在0.5-2.5之间；进一步优选的，微藻的浓度为OD750在1-2之间。
优选的，上述方法中，微藻在第二反应装置内停留时间为0.5-5小时，停留时间为微藻自进入反应装置起到从该反应装置进入循环回路所用的理论时间，微藻在第一、第二反应装置内停留时间的比值与第一、第二培养液体积的比值相同；进一步优选的，停留时间为1-2小时。
所述步骤S4的重复过程中，通过调整第二培养液的流经装置延长微藻的光照时长。随着培养的进行，微藻的生物量和密度都增加，培养液的透光性受到影响，此时调整微藻流经的装置以增加光照时长，有利于进一步提高微藻的生长效率。优选的，第二培养液利用分流装置由大内径的柱式光生物反应器流入小内经的毛细管式光生物反应器中以延长微藻的光照时长。
优选的，上述方法中，第一反应装置中搅拌转速为200rpm-500rpm，空气的通气量为1L/min-5L/min；第二反应装置中，光照强度为1500lux-12000lux，CO2的通气量为10mL/min-50mL/min；进一步优选的，第一反应装置中搅拌转速为300rpm-400rpm，空气的通气量为2L/min-4L/min；第二反应装置中，光照强度为4000lux-10000lux，CO2的通气量为30mL/min-40mL/min。
本发明还提供了用于实施上述培养方法的培养装置，所述培养装置包括第一反应装置和第二反应装置，所述第一反应装置和第二反应装置由循环回路首尾连接，循环回路上设有用于循环培养液的泵送装置，第一反应装置为发酵罐，第二反应装置包括用于控制CO2浓度的加气单元和用于控制微藻光照时间的光合单元；第二反应装置还包括给光合单元施加光照的光源；优选的，第二反应装置内加气单元通过分流装置并联有光合单元，此光合单元用于增加微藻的光照时间。
使用本装置实施上述培养方法时，培养液的循环过程中，当微藻的生物量随着培养的进行而增大时利用三通阀将第二培养液导流至与加气单元并联的光合单元中，使流经光源的微藻相较流经加气单元在相同时间内获得更多光照，确保微藻始终保持较高的光合效率。在培养进行过程中，可根据微藻的生物量实时增加接入循环回路中的光合单元的数量，以满足微藻光合作用对光照的需求。
优选的，上述培养装置中，所述循环回路中的每个加气单元分别串联和并联有光合单元。
优选的，上述培养装置中，所述加气单元为柱式光生物反应器，利用柱式光生物反应器可以有效控制CO2的浓度涨幅，使加入的CO2与培养液充分混匀，提高微藻的光合效率。
优选的，上述培养装置中，所述光合单元为毛细管式光生物反应器，即透明硅胶管，进一步优选的，毛细管式光生物反应器的内径为3-10mm。通过控制毛细管式光生物反应器的长度可以控制微藻进行光合自养的时长，使微藻具备更优的固碳效率。
优选的，上述培养装置中，所述泵送装置为差速蠕动泵。
优选的，上述培养装置中，所述分流装置为三通阀。
优选的，当第一反应装置的体积及第一培养液的体积较大时(例如发酵内第一培养液的总体积大于1m3)，培养装置中设置多个第二反应装置并分别于第一反应装置组成循环回路，即培养装置中通过增加第二反应装置的数量增加循环回路的数量，以保证每个循环回路中第二反应装置内液体流动速率和滞留时间满足要求。
本装置采用仿生学设计，参照“动脉、静脉”携带气体的特征，第一反应装置中利用有机碳源进行异养消耗氧气产生CO2、在第二反应装置中进行兼养产生氧气，可将从第一反应装置流入第二反应装置的循环回路段称为静脉管段、从第二反应装置流回第一反应装置的循环回路段称为动脉管段。当培养装置中微藻的生物量随培养时长的增加而增长时，微藻所需的光照条件同样也会发生相应变化，参照血液循环的控制，此时由差速蠕动泵提供动力对两培养液的停留时长进行实时动态调整，以保证微藻始终处于高速生长状态；同时，通过在第二反应装置内利用分流装置在柱式光生物反应器处并联毛细管式光生物反应器，当微藻生物量随培养进行而增加时，将微藻自柱式光生物反应器导流至毛细管式光生物反应器内，通过减小流经装置的内径来增加微藻的光照时长，保证微藻不因密度过高而得光效果变差，使微藻维持高速生长、生产。
本发明还提供了一种上述培养方法或培养装置在生产生物质中的应用，具体为使用上述培养方法或培养装置培养的微藻获得藻泥、藻粉等形式的生物质。
本发明还提供了一种上述培养方法或培养装置在生产高附加值产品中的应用，具体为使用上述方法培养或培养装置的微藻中提取油脂、色素等高附加值产品。
本发明的有益效果：
1.本发明通过将微藻在第一、第二反应装置中按照一定体积比进行循环培养，使微藻始终保持高生长速率，有效提高微藻的生产效率，同时在兼养阶段控制CO2浓度梯度增长，有效防止因CO2浓度的突然变化影响微藻的生长，并使微藻保持良好的光合效率。
2.根据微藻在培养过程中生物量的动态增加，通过调整微藻在第二反应装置中流经的设备来增加微藻的光照时长，有效保障了微藻的光合固碳效果，进一步确保微藻在培养过程中高效生长、生产。
附图说明
图1是本方法使用的装置的示意图，其中A、B、C、D分别第二反应装置的四种不同设置方式；
图2A，第一反应装置与第二反应装置中微拟球藻不同体积比下的生物量差异；B，第一反应装置与第二反应装置中微拟球藻不同体积比下的EPA含量差异；
图3A，第二反应装置中微拟球藻藻液不同滞留时间下的生物量差异；B，第二反应装置中微拟球藻藻液不同滞留时间下的EPA含量差异；
图4A，第一反应装置与第二反应装置中M.afer不同体积比下的生物量差异；B，第一反应装置与第二反应装置中M.afer不同体积比下的神经酸含量差异；
图5A，第二反应装置中M.afer藻液不同滞留时间下的生物量差异；B，第二反应装置中M.afer藻液不同滞留时间下的神经酸含量差异；
图6A，第一反应装置与第二反应装置中三角褐指藻不同体积比下的生物量差异；B，第一反应装置与第二反应装置中三角褐指藻不同体积比下的岩藻黄质含量差异；
图7A，第二反应装置中三角褐指藻藻液不同滞留时间下的生物量差异；B，第二反应装置中三角褐指藻藻液不同滞留时间下的岩藻黄质含量差异；
图8，使用图1中三种第二反应装置培养M.afer藻所得结果；
图9，第二培养液停留时长每日增速不同对培养M.afer藻产生的影响结果；
图10，分别按照实验例2和对比例1培养后微拟球藻生物量差异；
图11，分别按照实验例5和对比例2培养后M.afer生物量差异；
图12，分别按照实验例11和对比例3培养后三角褐指藻生物量差异；
其中，1.第一反应装置；2.柱式光生物反应器；3.毛细管式光生物反应器；4.差速蠕动泵；5.光源；6.三通阀。
具体实施方式
下面结合附图和实验例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
如图1A所示，一种实施微藻循环兼养培养方法的培养装置，培养装置包括第一反应装置1和第二反应装置，第一反应装置1和第二反应装置由循环回路首尾连接，循环回路上设有用于循环培养液的差速蠕动泵4，第一反应装置1为发酵罐，第二反应装置包括用于控制第二培养液体积和CO2浓度的加气单元和用于控制微藻光照时间的光合单元，本实施例中，加气单元为一个柱式光生物反应器2，光合单元为毛细管式光生物反应器3即透明硅胶管、且透明硅胶管的内径为3-10mm。第二反应装置还包括给光合单元施加光照的光源5。
实施例2：
如图1B所示，一种实施微藻循环兼养培养方法的培养装置，本实施例提供的装置于实施例1提供的装置不同之处在于，加气单元包括三个串联的柱式光生物反应器2，其他均相同。
实施例3：
如图1C所示，一种实施微藻循环兼养培养方法的培养装置，本实施例提供的装置于实施例2提供的装置不同之处在于，循环回路中的每个加气单元即柱式光生物反应器2分别串联一个毛细管式光生物反应器3，培养液在柱式光生物反应器2中每提高一次CO2浓度，就进行一段兼养培养，进一步提高微藻在兼养过程中的光合效率。
实施例4：
如图1D所示，一种实施微藻循环兼养培养方法的培养装置，本实施例提供的装置于实施例3提供的装置不同之处在于，循环回路中的柱式光生物反应器2利用三通阀6分别串联和并联有毛细管式光生物反应器3，随着培养的进行，微藻的生物量增大，所需的光照也随之增加，利用三通阀使第二培养液不再流经柱式光生物反应器2而进入毛细管式光生物反应器3内，毛细管式光生物反应器3相较柱式光生物反应器2有更小的内径，能使微藻在流经时得到更多的光照，从而能进一步增强微藻的兼养效果、提高微藻的生长速度；同时与柱式光生物反应器2并联的毛细管式光生物反应器3同样设置有进气装置，以保证第二培养液内CO2浓度稳定。
实验例1：
使用本发明提供的装置和方法培养微拟球藻(Nannochloropsis sp.)，且第二反应装置中的柱式光生物反应器设置3个，具体培养方法如下：
S1.在转速300rpm搅拌及通空气3L/min条件下，将微拟球藻以初始OD750＝1通入第一反应装置内进行异养培养，第一反应装置内的培养体系为f/2培养基(NaNO3浓度为1g/L，海盐浓度为30g/L，用HCl或NaOH调节PH值至7.2～7.4，121℃高温灭菌30分钟。其他各元素浓度按照表1分别配置母液，避光保存于4℃)，添加20g/L葡萄糖作为有机碳源，异养培养5h后得到第一培养液。
表1 f/2培养基母液配方
Figure BDA0003396778740000071
Figure BDA0003396778740000081
*各母液使用时分别按1：1000的比例加入灭菌后的海盐水中。
S2.利用蠕动泵将培养6h后的微藻及第一培养液经循环回路导入第二反应装置中，同时提供10000lux光照，按照培养液的进样顺序，各个柱式光生物反应器中CO2浓度梯度增加，从1％至2％至5％的CO2浓度，在第二反应装置内利用蠕动泵经循环回路流动1h后得到第二培养液；
S3.将第二培养液输送回第一反应装置内进行异养培养；
S4.重复循环步骤S2、S3，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为6:1。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及EPA含量。
实验例2：
使用本发明提供的装置和方法培养微拟球藻，
本实验例与实验例1的不同之处在于，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为3:1、且每个循环中在第一反应装置中的异养培养时长为3h，其它条件与实验例1均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及EPA含量。
如图2A、B所示，按照实验例1和实验例2的方法分别培养5天后，微拟球藻的生物量分别为6g/L和8.8g/L，EPA含量分别为30g/kg和35.6g/kg。即使用本装置和方法培养微拟球藻时，第一培养液和第二培养液的体积比为3:1为最优值。
实验例3：
使用本发明提供的装置和方法培养微拟球藻，
本实验例与实验例2的不同之处在于，本实验例的每轮循环中微拟球藻在第二反应装置中的兼养培养时长为30min、在第一反应装置中的异养培养时长为1.5h，其它条件与实验例2均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及EPA含量。
实验例4：
使用本发明提供的装置和方法培养微拟球藻，
本实验例与实验例2的不同之处在于，本实验例的每轮循环中微拟球藻在第二反应装置中的兼养培养时长为120min、在第一反应装置中的异养培养时长为6h，其它条件与实验例2均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及EPA含量。
如图3A、B所示，按照实验例2、实验例3和实验例4的方法分别培养5天后，微拟球藻的生物量分别为8.8g/L、5.9g/L和7.9g/L，EPA含量分别为35.6/kg、22.7g/kg和31.8g/kg。即使用本装置和方法培养微拟球藻时，每轮循环里微拟球藻在第二反应装置中兼养培养60min为最优时长。
实验例5：
使用本发明提供的装置和方法培养M.afer藻，且第二反应装置中的柱式光生物反应器设置3个，具体培养方法如下：
S1.在转速300rpm搅拌及通空气3L/min条件下，将微拟球藻以初始OD750＝1通入第一反应装置内进行异养培养，第一反应装置内的培养体系为BG11培养基(1.5g/L NaNO3，0.03g/L K2HPO4，0.075g/L MgSO4·7H2O，0.036g/L CaCl2·2H2O，0.006g/L citric acid，0.006g/L ferric ammonium citrate，0.001g/L EDTA，0.02g/L Na2CO3.和1ml/L微量元素母液。微量元素母液组成为：2.86g/Lh3BO3，1.81g/L MnCl2·4H2O，0.222g/L ZnSO4·7H2O，0.39g/L NaMoO4·5H2O，0.079g/L CuSO4·5H2O，0.0494g/L Co(NO3)2·6H2O。培养基通过121℃灭菌20min后使用)，添加2g/L葡萄糖作为有机碳源，异养培养5h后得到第一培养液；
S2.利用蠕动泵将培养5h后的微藻及第一培养液经循环回路导入第二反应装置中，同时提供10000lux光照，按照培养液的进样顺序，各个柱式光生物反应器中CO2浓度梯度增加，从1％至2％至5％的CO2浓度，在第二反应装置内培养1h后得到第二培养液；
S3.将第二培养液利用蠕动泵经循环回路输送回第一反应装置内进行异养培养；
S4.重复循环步骤S2、S3，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为5:1。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及神经酸含量。
实验例6：
使用本发明提供的装置和方法培养M.afer藻，
本实验例与实验例5的不同之处在于，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为3：1，且微藻每轮循环中在第一反应装置内异养培养的时长为3h，其它条件与实验例5均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及神经酸含量。
实验例7：
使用本发明提供的装置和方法培养M.afer藻，
本实验例与实验例5的不同之处在于，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为10：1，且微藻每轮循环中在第一反应装置内异养培养的时长为10h，其它条件与实验例5均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及神经酸含量。
如图4A、B所示，按照实验例5、实验例6和实验例7的方法分别培养5天后，M.afer藻的生物量分别为7.0g/L、6.2g/L和5.7g/L，神经酸含量分别为5.9mg/g(DCW)、5.1mg/g(DCW)和4.9mg/g(DCW)。即使用本装置和方法培养M.afer藻时，第一培养液和第二培养液的体积比为5:1为最优值。
实验例8：
使用本发明提供的装置和方法培养M.afer藻，
本实验例与实验例5的不同之处在于，本实验例的每轮循环中M.afer藻在第二反应装置中的兼养培养时长为30min、在第一反应装置中的异养培养时长为2.5h，其它条件与实验例5均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及神经酸含量。
实验例9：
使用本发明提供的装置和方法培养M.afer藻，
本实验例与实验例5的不同之处在，本实验例的每轮循环中M.afer藻在第二反应装置中的兼养培养时长为120min、在第一反应装置中的异养培养时长为10h，其它条件与实验例5均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及神经酸含量。
如图5A、B所示，按照实验例5、实验例8和实验例9的方法分别培养5天后，M.afer藻的生物量分别为7.0g/L、5.1g/L和7.1g/L，神经酸含量分别为5.9mg/g(DCW)、5.1mg/g(DCW)和5.9mg/g(DCW)。即使用本装置和方法培养微拟球藻时，每轮循环里微拟球藻在第二反应装置中兼养培养120min为最优时长。
实验例10：
使用本发明提供的装置和方法培养三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，且第二反应装置中的柱式光生物反应器设置3个，具体培养方法如下：
S1.在转速300rpm搅拌及通空气3L/min条件下，将三角褐指藻以初始OD750＝1.5通入第一反应装置内进行异养培养，第一反应装置内的培养基为f/2+10g/L甘油，异养培养5h后得到第一培养液；
S2.利用蠕动泵将培养6h后的微藻及第一培养液经循环回路导入第二反应装置中，同时提供10000lux光照，按照培养液的进样顺序，各个柱式光生物反应器中CO2浓度梯度增加，从1％至2％至5％的CO2浓度，在第二反应装置内利用蠕动泵经循环回路流动1h后得到第二培养液；
S3.将第二培养液输送回第一反应装置内进行异养培养；
S4.重复循环步骤S2、S3，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为5:1。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及岩藻黄质含量。
实验例11：
使用本发明提供的装置和方法培养三角褐指藻，
本实验例与实验例10的不同之处在于，利用蠕动泵控制第一培养液和第二培养液的体积比为1.5:1，且微藻每轮循环在第一反应装置内异养培养时长为1.5h，其它条件与实验例10均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及岩藻黄质含量。
如图6A、B所示，按照实验例10和实验例11的方法分别培养5天后，三角褐指藻的生物量分别为4.46g/L、7.13g/L，岩藻黄质含量分别为16.3mg/g(DCW)、22.3mg/g(DCW)。即使用本装置和方法培养三角褐指藻时，第一培养液和第二培养液的体积比为1.5:1为最优值。
实验例12：
使用本发明提供的装置和方法培养三角褐指藻，
本实验例与实验例11的不同之处在于，本实验例的每轮循环中三角褐指藻在第二反应装置中的兼养培养时长为2h、在第一反应装置中的异养培养时长为3h，其它条件与实验例11均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及岩藻黄质含量。
实验例13：
使用本发明提供的装置和方法培养三角褐指藻，
本实验例与实验例11的不同之处在于，本实验例的每轮循环中三角褐指藻在第二反应装置中的兼养培养时长为3h、在第一反应装置中的异养培养时长为4.5h，其它条件与实验例11均相同。
在培养5天后，收集装置内微藻及培养液，测定生物量及岩藻黄质含量。
如图7A、B所示，按照实验例11、实验例12和实验例13的方法分别培养5天后，三角褐指藻的生物量分别为7.13g/L、4.6g/L和8.11g/L，岩藻黄质含量分别为22.3mg/g(DCW)、16.1mg/g(DCW)和25.1mg/g(DCW)。即使用本装置和方法培养三角褐指藻时，每轮循环里三角褐指藻在第二反应装置中兼养培养3h为最优时长。
实验例14
使用M.afer藻验证本发明的三种第二反应装置的设置方式，分别按照实施例1、2、3提供的装置实施实验例5提供的方法对M.afer藻进行培养，且保证每组培养装置中的第一反应装置和第二反应装置的体积比为5:1，在第二反应装置中的停留时间为120min。培养5天后，测定微藻的生物量。
如图8所示，对比可知，不同组装方式对生物量积累有影响，分别得到的生物为6.8g/L，7.1g/L，7.7g/L，使用图1C的配置方式，能使微藻在每次CO2浓度每提升一次后就进行一段时间光合作用，能更好的使微藻适应培养液中CO2的浓度变化，并固定CO2。
实验例15
使用M.afer藻，按照实施例4提供的装置实施实验例5提供的方法进行培养，柱式光生物反应器2的体积等于与其并联的毛细管式光生物反应器3的体积，第一培养液和第二培养液的体积比为5:1，在第二反应装置内培养1h后得到第二培养液；在培养2天后，调整三通阀6将第二培养液导流至毛细管式光生物反应器3中，并根据微藻生物量的增加提高三通阀6的调整数量。共计培养5天后，测定微藻的生物量。
如图9所示，培养得到的微藻的生物量为8.2g/L，由图4A可知，实施例5培养得到的微藻生物量为7.0g/L。与实施例5相比，通过根据微藻生物量的增加调整第二培养装置中的光照时长，能使微藻的持续高速增长。
从原理分析，随着培养的进行，微藻在培养装置内的浓度不断增大，所需单位面积光照随之增多，但由于微藻密度的增大使透光效率降低，因此减小微藻在第二反应装置中的流经装置的内径能延长微藻在第二反应装置中的停留时间，使微藻得到更充分的光照，从而提高微藻的生长速率，并使微藻能更好地行使光合固碳作用，保证微藻不因细胞浓度的增加而影响生长速率和生产速率。
实验例16
本发明在生产生物质中的应用，具体为使用实验例1培养得的微拟球藻、实验例5培养得的M.afer藻或实验例11培养得的三角褐指藻获得藻泥、藻粉等形式的生物质。
实验例17
本发明在生产高附加值产品中的应用，具体为使用实验例1培养得的微拟球藻、实验例5培养得的M.afer藻或实验例11培养得的三角褐指藻中提取油脂、色素等高附加值产品。
对比例1：
使用专利文献CN 113136341A提供的装置和方法培养微拟球藻，5天后收集装置内微藻及培养液，测定生物量及EPA产量。
如图10所示，按照实验例2和对比例1的方法分别培养5天后，微拟球藻的生物量分别为8.7g/L和7.8g/L。
对比可知，使用本发明提供的装置和方法培养微拟球藻不仅能提高微拟球藻的生物量，也能有效提高EPA的产量。本发明对于兼养条件下CO2和光照的利用更加充分，所以相对于现有技术能够更符合微藻的生理生化特性，达到兼养和异养的共同促进的技术效果。
对比例2：
使用专利文献CN 113136341 A提供的装置和方法培养M.afer藻，5天后收集装置内微藻及培养液，测定生物量及神经酸产量。
如图11所示，按照实验例5和对比例2的方法分别培养5天后，M.afer藻的生物量分别为7.0g/L和6.6g/L。
对比可知，使用本发明提供的装置和方法培养M.afer藻不仅能提高M.afer藻的生物量，也能有效提高神经酸的产量。本发明对于兼养条件下CO2和光照的利用更加充分，所以相对于现有技术能够更符合微藻的生理生化特性，达到兼养和异养的共同促进的技术效果。
对比例3：
使用专利文献CN 113136341 A提供的装置和方法培养三角褐指藻，5天后收集装置内微藻及培养液，测定生物量及高岩藻黄质产量。
如图12所示，按照实验例11和对比例3的方法分别培养5天后，三角褐指藻的生物量分别为6.8g/L和6.2g/L。
对比可知，使用本发明提供的装置和方法培养三角褐指藻不仅能提高三角褐指藻的生物量，也能有效提高岩藻黄质的产量。本发明对于兼养条件下CO2和光照的利用更加充分，所以相对于现有技术能够更符合微藻的生理生化特性，达到兼养和异养的共同促进的技术效果。
结合上述实验例数据和对比例数据，利用本发明提供的装置和方法对微拟球藻、M.afer藻、三角褐指藻进行培养均能获得优于现有装置和培养方法的生物量及产物产量，同时利用本发明提供的装置和方法对其它微藻，如小球藻(Chlorella spp.)、裸藻(Euglena spp.)、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)和栅藻(Scenedesmus spp.)等单细胞经济种类的微藻进行培养，同样可以取得良好效果。

Claims (10)

1.一种微藻循环兼养培养的方法，其特征是，方法在由循环回路连接的第一反应装置和第二反应装置中进行，方法具体如下：
S1.在搅拌、通空气条件下，将微藻通入第一反应装置内进行异养培养，得到第一培养液；
S2.在光照下，将第一培养液经循环回路输送至第二反应装置内，并按照进样顺序逐渐增大CO2的通入浓度，兼养培养得到第二培养液；
S3.将第二培养液经循环回路输送回第一反应装置内进行异养培养；
S4.重复步骤S2、S3，并在重复过程中控制微藻在第二反应装置中光照时长。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述第一培养液和第二培养液的体积比例范围为10:1-1:1；优选的，所述第一培养液和第二培养液的体积比例范围为5:1-1.5:1。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述微藻在第二反应装置内停留时间为0.5-5小时，微藻在第一、第二反应装置内停留时间的比值与第一、第二培养液体积的比值相同；优选的，所述微藻在第二反应装置内停留时间为1-2小时。
4.如权利要求1任一所述的方法，其特征是，所述步骤S4的重复过程中，通过调整第二培养液的流经装置延长微藻的光照时长。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述第一反应装置中搅拌转速为200rpm-500rpm，空气的通气量为1L/min-5L/min；第二反应装置中，光照强度为1500lux-12000lux，CO2的通气量为10mL/min-50mL/min；优选的，第一反应装置中搅拌转速为300rpm-400rpm，空气的通气量为2L/min-4L/min；第二反应装置中，光照强度为4000lux-10000lux，CO2的通气量为30mL/min-40mL/min。
6.一种微藻循环兼养培养的培养装置，其特征是，所述培养装置包括第一反应装置和第二反应装置，所述第一反应装置和第二反应装置由循环回路首尾连接，循环回路上设有用于循环培养液的泵送装置，第一反应装置为发酵罐，第二反应装置包括用于控制CO2浓度的加气单元和用于控制微藻光照时间的光合单元；培养装置还包括给光合单元施加光照的光源。
7.如权利要求6所述的培养装置，其特征是，所述循环回路中的加气单元利用分流装置分别串联和/或并联有光合单元。
8.如权利要求7所述的培养装置，其特征是，所述加气单元为柱式光生物反应器，所述光合单元为毛细管式光生物反应器，即透明硅胶管，所述泵送装置为差速蠕动泵，所述分流装置为三通阀；优选的，毛细管式光生物反应器的内径为3-10mm。
9.如权利要求1～5任一项所述的方法制备的微藻的应用，或权利要求6～8任一项所述的装置制备的微藻的应用，用于制取藻泥或藻粉形式的生物质。
10.如权利要求1～5任一项所述的方法制备的微藻的应用，或权利要求6～8任一项所述的装置制备的微藻的应用，用于提取高附加值产品油脂或色素。
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