CN110184193B - 一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法及装置 - Google Patents

一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法及装置，步骤是：不同梯度补料培养基的配制；雨生红球藻活化扩种；雨生红球藻接种至发酵罐：检测扩种后的藻液细胞数，以新鲜灭菌的培养基洗净后重悬，接入发酵罐；监测培养参数/pH控制；定向调节培养基碳氮比。装置由发酵罐、出/进气口、出/进样口、补料口、pH/温度/溶氧控制单元、连续梯度补料单元组成，该方法避免了转换培养过程中的染菌，提高了对底物的利用效率，且生产的细胞用于后续虾青素诱导，存活率高，该阶段的生物量及虾青素产率分别高达0.30 g L‑1 d‑1和15.45 mg L‑1 d‑1。

Description

一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法及装置
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法，同时还涉及一种连续梯度补料的装置，尤其适合于雨生红球藻大规模培养中种源高效扩繁的阶段。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种淡水单细胞的绿藻，具有双鞭毛，隶属于绿藻门，团藻目，红球藻科。在胁迫条件，如强光照、氮缺乏等条件下细胞内能积累类胡萝卜素，其中约85％以上为虾青素和虾青素酯。
虾青素，是一类维生素A源的酮式次生类胡萝卜素，化学名为3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素。值得注意的是，虾青素分子中含有长的多共轭不饱和双键，这种结构极易与自由基反应并对其进行清除，因此具有强大的抗氧化性能。天然虾青素在医药、营养品、保健品、化妆品等领域有所应用，特别在鱼类养殖行业中被用作饲料添加剂和着色剂，能改善鱼类体色并提高了使用价值，同时也增加了鱼体的抗病能力。
目前已有的雨生红球藻的规模化培养通常采用两步法，第一步实现雨生红球藻营养细胞的分裂和繁殖；第二步雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素。虾青素产率在实际生产中是雨生红球藻规模化培养中最为关键的评价指标，该指标由细胞密度、虾青素含量、细胞在光合诱导过程的存活率三个方面决定，其中围绕着细胞密度和虾青素含量两个方面已有许多文献及专利的报道，而嫌少关注细胞在光合诱导过程的存活率，该存活率与细胞的形态有很大关系，处于孢子阶段的细胞，存活率最高。
第一步的目的是获得高密度的细胞。许多文献专注如何获得高密度的雨生红球藻细胞，却忽视了细胞的状态，绿色阶段的细胞(游动细胞、不动胶囊细胞)在第二阶段会出现漂白死亡等现象，导致细胞在该阶段的生物量和虾青素产率低下。因此，在第一阶段中，细胞产率和细胞状态需要同时考虑。在第一阶段细胞培养中，已有的文献报道中存在3种培养模式，一为光合自养模式，也就是利用光能进行光合作用，国际上已成功实现规模化生产的模式主要是基于光合自养的两阶段模式，传统的两阶段光自养存在诸如扩种难、产量低、占地大、受季节变化影响大、效率低等问题。此外，也有鲜少报道雨生红球藻异养发酵培养，通过异养发酵的生物量可以达到27g/L。但是，从表1可见，由于异养发酵过程中细胞在长时间黑暗的条件下，所获得的细胞的光合活性很低，其最大光合效率Fv/Fm低于0.6，造成了异养生长获得的细胞在第二阶段高光照、缺氮等胁迫条件，大部分细胞的色素体会被漂白，造成异养生长的细胞在第二阶段生物量和虾青素产率低下(表1-BPs和APs)。因此，在细胞培养的阶段，有必要探索一种新型的雨生红球藻高密度且全孢子化的种源培养模式，将为后续的光合诱导产虾青素阶段提供高密度高品质的种源，将能大幅度降低其规模化培养的成本，从而实现国内外雨生红球藻生产的更新迭代。除了光合自养和异养发酵，雨生红球藻还存在一种兼性培养模式，该模式既能利用有机碳进行异养生长获得高密度的细胞，同时，此阶段的雨生红球藻可以积累有效的虾青素，并伴随着细胞孢子化(不动胶壳细胞、不动孢子等)且能维持较高的光合活性，有利于下一步的虾青素诱导合成阶段。
本发明在经过大量的实验之后，明确了碳氮比对雨生红球藻细胞分裂及分化的影响，构建了连续梯度补料装置应用于雨生红球藻种源扩繁的方法，发现该系统能维持培养基中碳氮比稳定，相较于传统的置换无氮培养基方法，操作简易高效，不再经过配料、灭菌工序，避免了转换培养过程中的染菌，并提高对底物的利用效率。通过多批次的雨生红球藻培养，发现雨生红球藻的种源能稳定在9.0g/L生物量，且在15天后的培养终期细胞形态能100％形成有效的孢子，有利于下一步的光合诱导虾青素合成阶段，表明本发明有望应用于开发一种新型的“兼性培养扩繁-光合诱导产虾青素”的生产模式，可提高雨生红球藻规模化培养的实际生产效率。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料方法，结合实时检测胞外的碳氮浓度的数据，以醋酸作为碳源，并作为能调节pH的酸剂，以硝酸钠作为氮源，两者在不同补料瓶中以不同配比(摩尔比)组合，形成从低到高的摩尔配比的浓缩补料瓶，浓缩比例控制在30～50倍。在培养过程中，藻液的pH会逐渐上升，细胞也会消耗一定浓度的碳和氮营养源，可以依据细胞的生长状态定向地打开相应浓缩瓶的阀门，原位定向调节藻液的碳氮比，达到了调控平衡雨生红球藻细胞分裂和虾青素积累的作用。提高了单位生物量对营养的利用效率，通过培养了多批次雨生红球藻，发现雨生红球藻的种源能稳定在9.0g/L生物量，且在15天后的培养终期细胞形态能100％形成有效的孢子，有利于下一步的光合诱导虾青素合成阶段，应用于雨生红球藻种源高效扩繁。
本发明的另一个目的是在于提供了一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料的装置，有效地用于原位控制不同梯度浓缩液的补料。经过大量批次实验的基础上，发现了胞外碳氮比对雨生红球藻细胞分裂及分化的影响，体现为高的胞外碳氮比促进细胞在短时间内分化且积累有效浓度的虾青素含量，使得细胞体积变大，质量增加；发现高的胞外碳氮比能有效的地提高乙酸激酶的活性，显著提高了雨生红球藻对营养的利用效率，并能促进吸收同化的碳骨架进入类胡萝卜素合成途径，并能提高在叶绿体中产生的前体胡萝卜素进入胞质中的油滴，解除了在叶绿体中的底物抑制效应，从而提高了虾青素的产率。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料方法，其步骤是：
A、不同梯度补料培养基的配制。所述的罐中培养基为改良后的kobayashi’sbasal培养基，将其中酵母提取物替换为硝酸钠，其余组分配比如下：醋酸钠(CH3COONa),0.405g L-天冬酰胺(L-asparagine)，0.5g硝酸钠(NaNO3),0.2g六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)，0.01g七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，0.02g二水合氯化钙(CaCl2·2H2O)和1000mL去离子水；对配制好的全培养基进行高温121℃，28－32min灭菌；连续梯度补料单元为一组连续的不同碳氮比梯度的碳氮补料浓缩液，以醋酸钠和硝酸钠分别作为碳源和氮源，每个碳氮补料瓶中醋酸钠的浓度维持不变，从1号瓶-5号瓶的硝酸钠的浓度从高至无，形成比例从10－50不同梯度的碳氮比(摩尔比)的浓缩液。
B、雨生红球藻活化扩种。在超净工作台将灭菌后的培养基转移至50～250mL三角烧瓶，并接入新鲜的雨生红球藻藻株(中科院淡水藻种库FACHB-797)：固体平板上刮取克隆接入培养基，或从液体种子中转接至培养基进行扩培，培养条件为：光照强度为3～10μmolphotons·m-2·s-1，温度控制在24-26℃，通气培养7～10天至足量。
C、雨生红球藻接种至发酵罐。检测扩种7～10天后的藻液细胞数以决定接种量V1，确定接种量V1之后对藻液进行离心浓缩，以新鲜灭菌的培养基洗净后重悬，接入发酵罐，藻株(中国科学院淡水藻种库编号FACHB-797雨生红球藻)接入细胞浓度C2为1.0-3.0×105cells/mL，培养条件为光照强度为3～5μmol photons·m-2·s-1，温度控制在24-26℃，实验组和对照组发酵罐的碳氮比分别维持在50和10(摩尔比)。
D、监测培养参数/pH控制。主控单元监测藻液的pH(7-8)、相对溶氧值(80％-100％)及温度(24-26℃)等培养参数，每日取样，监测培养基中的残留有机非颗粒碳和总氮浓度，据此添加适量(日均约20-30ml)体积的碳氮浓缩液，维持培养基的pH(7-8)和碳氮比(摩尔比)恒定。
E、定向调节培养基碳氮比。在培养初期(0～5天)维持罐内碳氮比在10左右；此后3天，维持罐内碳氮比在20(摩尔比)左右，以此类推，每3～4天提高罐内碳氮比，在培养末期(后3～5天)添加不含硝酸钠的碳源浓缩液，维持高碳氮比(摩尔比)。定向形成在细胞生长前期培养液维持较低的碳氮比，逐渐提高培养液碳氮比。
上述的五个步骤中，最为关键的步骤为E(定向调节培养基碳氮比)，该步骤主要解决了雨生红球藻细胞生长与虾青素积累两个生理过程对碳氮素配比需求不同的矛盾。传统的“两阶段培养”分为第一阶段的扩种阶段，和第二阶段的虾青素诱导合成阶段。据目前文献/专利报道，第一阶段的扩种阶段所采用的培养模式分为三种，分别是光合自养、异性培养及混合营养三种类型。光合自养需要占据较大的空间和生产面积，单位时间和体积生产效率较为低下；而添加有机营养能显著促进细胞增殖，因此异性培养和混合营养成为了一种细胞扩繁的常用手段。由于“两阶段培养”中第二阶段为强光诱导，因而要求第一阶段生产的雨生红球藻细胞保持较高的光合活性。据报道，异性培养(长期黑暗)下的细胞，其光合活性较弱，不利于直接用于强光诱导。据此，本发明基于混合营养的培养模式，为平衡细胞生长和虾青素生产对碳氮素需求间的矛盾，开发一种连续梯度补料装置及方法，实现了同一培养罐内碳氮素配比的定向变化：前期维持利于细胞生长的低碳氮素配比，逐渐提高培养基中碳的比例；提高碳氮素配比，利于后期的虾青素积累，相较于传统的缺氮处理，该装置使用方便，能维持培养基中碳氮比稳定，操作简易高效，无需重新更换新鲜的无菌缺氮培养基，不仅缩短实际培养周期，提高对底物的利用效率和培养工艺的易控性。
该技术方案目的在于为第二阶段提供高密度的优质细胞，该发明与其他培养方法相比，重视了雨生红球藻的生长和虾青素积累的营养需求特点，改进了细胞培养的补料策略，经过大量实验摸索，在实验室内使用该方法培养雨生红球藻，结果发现，雨生红球藻的种源能稳定在9.0g/L生物量，且在15天后的培养终期细胞形态能100％形成有效的孢子，如表1，该技术方案所生产的雨生红球藻孢子，密度高，且具备较强的光合活性，使其在整个生产周期(室内模拟)获得目前文献报道的最高生物量产率。
一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料装置，它由发酵罐、进气口、出气口、进样口、出样口、补料口、pH控制单元、溶氧控制单元、温度控制单元组成，其特征在于：发酵罐分别与主控单元、连续梯度补料单元、空气输入单元相连；主控单元分别与pH控制单元、溶氧控制单元、温度控制单元相连；连续梯度补料单元与补料口相连；空气输入单元与进气口相连。连续梯度补料单元由连续碳氮浓缩补料单元、微量元素浓缩补料单元、水瓶组成，其特征在于：每一单元分别与补料导管和通气导管连接，补料导管的上端与蠕动泵连接。连续碳氮浓缩补料单元由连续的5-8个碳氮浓缩补料瓶、补料导管、通气导管、多通式液体分流装置组成，其特征在于：每个碳氮浓缩补料瓶分别与补料导管和通气导管连接，补料导管与多通式液体分流装置连接，多通式液体分流装置的上端与补料导管连接，补料导管与蠕动泵连接。所述的多通式液体分流装置不局限于六通式，可依据梯度要求，设置流通阀门数目。
上述22个零部件，最关键的技术难点和技术问题是多通式液体分流装置和碳氮浓缩补料瓶，这两个零部件的结合，正也是该发明的创新之处，它们与阀门、补料导管和通气导管相结合组成连续碳氮浓缩补料单元，发展了一种新型的补料策略，这种连接方式实现了原位定向改变培养罐中的碳氮素配比，避免了更换新鲜培养基/或更换培养基碳或氮组分的环节，从而大幅度降低了生产周期，提高了培养流程工艺的易控性，经过大量的实验验证，该装置能维持培养基中的碳氮素配比恒定。
本发明在室内5-L发酵罐试验结果发现，该发明用于雨生红球藻第一阶段的细胞生产阶段，细胞生物量能达到9.1g/L，且100％孢子率，且该生产的细胞，在模拟户外强光诱导，能获得了高达0.30g L-1d-1的生物产率和15.45mg L-1d-1虾青素产率。将本发明的连续梯度补料技术与户外光合自养耦联培养构成一组关键技术，可以突破现阶段实际生产阶段中的大型光生物反应器光能高效利用的瓶颈，假定在一10吨发酵罐生产12天，获得高密度种源(近200万红球藻孢子/ml)，按10％稀释率，可以用于100,000L光合生物反应器的第二阶段虾青素生产8天，按室内结果计算，整一生产周期(合计20天)可以获得18kg虾青素。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和显著效果：
方法易行，操作简便，有效的提高了单位生物量对营养的利用效率，通过培养了多批次雨生红球藻，发现雨生红球藻的种源能稳定在9.0g/L生物量，且在15天后的培养终期细胞形态能100％形成有效的孢子，能有效的利于下一步的光合诱导虾青素合成阶段，应用于雨生红球藻种源高效扩繁。能连续地逐渐提高培养基中碳氮比，使得细胞在培养前期处于低的胞外碳氮比水平，逐渐升高碳氮比，最终处于高的胞外碳氮比，利于细胞孢子化和虾青素合成。该装置结构简单，使用方便，能有效地维持培养液的碳氮比，基于不同碳氮比对雨生红球藻细胞分裂和虾青素积累的影响的研究结果，能在雨生红球藻不同培养阶段实现不同的碳氮比，在培养前期，维持培养液的低碳氮比，随后逐渐上调培养液的碳氮比，促进虾青素的产生和积累，且细胞孢子化。能维持培养基中碳氮比稳定，相较于传统置换无氮培养基，操作简易高效，无需重新更换新鲜的无菌缺氮培养基，不仅缩短实际培养周期，而且避免了污染。本发明利用连续梯度补料方法，在线进行pH恒定的定向调节培养基碳氮比，获得高密度且全孢子率的细胞，相较于以往的文献报道，该细胞用于后续虾青素诱导，存活率高，该阶段的生物量及虾青素产率分别高达0.30g L-1d-1和15.45mg L-1d-1；相对传统的缺氮法诱导，不再经过配料、灭菌工序，避免了转换培养过程中的染菌，并提高对底物的利用效率。
附图说明
图1为一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的装置结构示意图。
图2为一种连续梯度补料单元的示意图。
图3为一种连续碳氮浓缩补料单元的示意图。
图4为一种应用于雨生红球藻高效扩繁的实验结果图。
其中，A图表示连续梯度补料方法与单一碳氮比组的细胞浓度，C图表示两组条件下的细胞干重，B图表示培养终期(第15天)的细胞显微照片；D图表示在连续梯度补料方法下，细胞形态(绿色游动细胞和不动孢子)在培养过程中的相对比例。结果显示，连续梯度补料方法能显著提高单位体积雨生红球藻的生物量，稳定在9.0g/L生物量，且在15天后的培养终期细胞形态能100％形成有效的孢子，有利于下一步的光合诱导虾青素合成阶段，生物量相较于对照组而言，提高了近3.4倍，进一步表明基于该装置及方法应用于雨生红球藻种源高效扩繁的有效性。
图5为一种运用代谢组和酶学的结果解析胞外碳氮比对雨生红球藻虾青素合成的影响示意图。
其中：高的胞外碳氮比能有效地提高乙酸激酶的活性，显著提高了雨生红球藻对营养的利用效率，并能促进吸收同化的碳骨架进入类胡萝卜素合成途径，并能提高在叶绿体中产生的前体胡萝卜素进入胞质中的油滴，解除了在叶绿体中的底物抑制效应，从而提高了虾青素的产率。
其中：1－发酵罐(市场上购置)、2－进气口、3－出气口、4－进样口、5－出样口、6－补料口、7－pH控制单元(包括梅特勒405型pH电极和蠕动泵双向开关控制系统)、8－溶氧控制单元(包括梅特勒6800型DO电极和转速联动控制系统)、9－温度控制单元(包括Pt100型铂电极、玻璃罐底部加热盘和水进夹套)、10－主控单元(由德国西门子S7-200系列PLC系统和液晶显示器)、11-连续梯度补料单元(包括连续碳氮浓缩补料瓶、水瓶和微量元素浓缩补料瓶及其与通气导管和补料导管相连)、12－空气输入单元(由市售空气压缩机、导管、气源接口、减压阀稳压器、空气转子流量计、空气过滤器及罐内的特质空气分布器和尾气排口组成)、13－连续碳氮浓缩补料单元(包括多联的碳氮浓缩补料瓶22及其与补料导管、阀门、通气导管相连)、14－微量元素浓缩补料单元(包括一微量元素浓缩补料瓶及其与补料导管、通气导管相连)、15－水瓶(市场上购置)、16－补料导管、17－通气导管、18－蠕动泵(市场上购置)、19－阀门(市场上购置)、20－补料导管、21－多通式液体分流装置(市场上购置的六通式阀门，及其与补料导管相连)、22-碳氮浓缩补料瓶。
具体实施方式
该方法适合所有可兼养(异养)的经济微藻的高密度种源扩繁，优先可以应用于适合雨生红球藻这一类对生长和产物积累的条件要求存在差异的微藻。本文以雨生红球藻为例，说明该方法的具体实施步骤，但不构成对本发明的限制，本发明所述技术方案，如无特别说明，均为本领域中的常规方案，所用原料均为市场流通的商品。
实施例1：
以雨生红球藻FACHB-797为例，但不构成对本发明的限制，本方法可以应用于所有可兼养(异养)的雨生红球藻。
一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料方法，其步骤是：
A、不同梯度补料培养基的配制：
案例所用的罐中培养基为改良后的kobayashi’s basal培养基，将其中酵母提取物替换为硝酸钠，其余组分配比如下：1.2g醋酸钠(CH3COONa),0.405g(L-天冬酰胺(L-asparagine)，0.5g硝酸钠(NaNO3)，0.2g六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)，0.01g七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，0.02g二水合氯化钙(CaCl2·2H2O)和1000mL去离子水；对配制好的全培养基进行高温121℃，30min左右灭菌；连续梯度补料单元为一组连续的不同碳氮比梯度的碳氮补料浓缩液，以醋酸钠和硝酸钠分别作为碳源和氮源，每个碳氮补料瓶中醋酸钠的浓度维持不变，从1号瓶-6号瓶的硝酸钠的浓度从高至低，形成比例从10～50不同梯度的碳氮比(摩尔比)的浓缩液。本案例中使用的是六通式分流装置，因此设置6个碳氮浓缩补料瓶，但不构成对本发明的限制，本方法可以应用于所有梯度的连续补料。
B、雨生红球藻活化扩种：
在超净工作台将灭菌后的培养基转移至50或100或250mL三角烧瓶，并接入新鲜的雨生红球藻藻株：固体平板上刮取克隆接入培养基，或从液体种子中转接至培养基进行扩培，培养条件为：光照强度为3或4或5或6或7或8或9或10μmol photons·m-2·s-1，温度控制在24或25或26℃，通气培养7或8或9或10天至足量。
C、雨生红球藻株接种至发酵罐：
检测扩种7或8或9或10天后的藻液细胞数以决定接种量V1，确定接种量V1之后对藻液进行离心浓缩，以新鲜灭菌的培养基洗净后重悬，接入发酵罐，藻株(中国科学院淡水藻种库编号FACHB-797雨生红球藻)接入细胞浓度C2为1.0或2.0或3.0×105cells/mL，培养条件为光照强度为3或4或5μmol photons·m-2·s-1，温度控制在24或25或26℃。本发明在大量实验之后，结果发现低的胞外碳氮比在10(摩尔比)左右，对雨生红球藻细胞分裂最为合适，因此设置实验组发酵罐的初始碳氮比维持在10(摩尔比)左右，但不构成对本发明的限制，本方法可以在前期经过批次实验结果后明确最适宜微藻细胞生长的碳氮比，依据结果明确罐内初始的碳氮比。
D、监测培养参数/pH控制：
主控单元监测藻液的pH(控制在7.5左右)、溶氧值及温度(分别控制在80％-100％，和23-25℃)等培养参数，每日取样，监测培养基中的残留有机非颗粒碳和总氮浓度，计算实时的胞外碳氮比，在培养过程中，藻液的pH会逐渐上升(上升至9左右)，据此添加适量(日均约20mL)体积的碳氮浓缩液(醋酸除了作为碳源之外，还可以充当调酸剂)，以维持培养基的pH(7.5左右)和碳氮比(摩尔比)恒定。
E、定向调节培养基碳氮比：
在培养初期1天或2天或3天或4天或5天，维持罐内碳氮比在10(摩尔比)左右；此后3天，维持罐内碳氮比在20(摩尔比)左右，以此类推，每3或4天提高罐内碳氮比，在培养末期(后3或4或5天)添加不含硝酸钠的碳源浓缩液，维持高碳氮比。本案例中提及的培养天数依据雨生红球藻藻株状态而定，但不构成对本发明的限制。
F、在实验室条件验证方法的有效性：
实验室以5-L的发酵罐作为验证的培养体系，培养周期在15天，每3天逐次更换阀门，补料导管依次连通碳氮比＝10，至20，至30，至40，至50，至∞，培养终期，可以收获9.18g/L，相较于对照组，获得6.50g/L的净增，且在培养终期，雨生红球藻细胞全处于孢子的阶段，有利于下一步的虾青素光合诱导阶段，说明本发明可应用于雨生红球藻种源的高效扩繁。
实施例2：
根据图1、图2、图3可知，一种连续梯度补料方法应用于雨生红球藻种源高效扩繁的装置，它由发酵罐1、进气口2、出气口3、进样口4、出样口5、补料口6、pH控制单元7、溶氧控制单元8、温度控制单元9、主控单元10、连续梯度补料单元11、空气输入单元12、连续碳氮浓缩补料单元13、微量元素浓缩补料单元14、水瓶15、补料导管16、通气导管17、蠕动泵18、阀门19、补料导管20、多通式液体分流装置21、碳氮浓缩补料瓶22组成，其特征在于：发酵罐1分别与主控单元10、连续梯度补料单元11、空气输入单元12相连，构成雨生红球藻的培养罐主体部分，主控单元10分别与pH控制单元7、溶氧控制单元8、温度控制单元9相连，将培养液的信息输入端与输出端连接，连续梯度补料单元11与补料口6相连，为雨生红球藻的恒化培养提供营养源补料；空气输入单元12与进气口2相连，鼓动/搅动培养液达到混匀效果，所述的连续梯度补料单元11它由连续碳氮浓缩补料单元13、微量元素浓缩补料单元14、水瓶15组成，其特征在于：连续碳氮浓缩补料单元13、微量元素浓缩补料单元14、水瓶15分别与补料导管16和通气导管17连接，构成细雨生红球藻的恒化培养的营养供给源，补料导管16的上端与蠕动泵18连接，蠕动泵可以将营养供给源泵入培养罐，所述的连续碳氮浓缩补料单元13它由连续的5或6或7或8个碳氮浓缩补料瓶22、补料导管20、通气导管17、多通式液体分流装置21组成，其特征在于：碳氮浓缩补料瓶22分别与补料导管20和通气导管17连接，碳氮浓缩营养源与培养罐连接，实现定向调节培养罐中碳氮素配比的功能，也为该发明的创新之处，补料导管20与多通式液体分流装置21连接，多通式液体分流装置21的上端与补料导管16连接，补料导管16与蠕动泵18连接，多通式液体分流装置可以依据培养周期不同而定向接入不同碳氮素配比的碳氮浓缩补料瓶，实现定向调节培养罐中碳氮素配比的功能，所述的多通式液体分流装置21，其特征在于：所述的多通式液体分流装置21不局限于六通式(如五通、七通、八通等)，可依据所述的梯度要求，设置流通阀门数目(5-8)。
该装置在经过大量的实验之后，明确了碳氮比对雨生红球藻细胞分裂及分化的影响，构建了连续梯度补料装置应用于雨生红球藻种源扩繁的方法，发现该系统能原位定向调节藻液的碳氮比，从而达到调控平衡雨生红球藻细胞分裂和虾青素积累的作用。相较于传统置换无氮培养基，操作简易高效，且能提高了单位生物量对营养的利用效率。经过大量的实验结果发现，该连续梯度补料方法配合传统的发酵罐，操作方法与传统的缺氮处理相比，能提高单位生物量对营养的利用效率，通过培养了多批次雨生红球藻，发现雨生红球藻的种源能稳定在9.0g/L生物量，且在15天后的培养终期细胞形态能100％形成有效的孢子，有利于下一步的光合诱导虾青素合成阶段，表明本发明可应用于雨生红球藻种源高效扩繁。
实施例3：
一种应用于雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料方法，其过程是：
对使用连续梯度补料方法获得的不动细胞在室内条件进行光合诱导产虾青素，将上述来源的细胞用灭菌自来水稀释10倍，光照条件为100μmol photons·m-2·s-1，温度控制在24或25或26℃，培养8或9或10天，最终虾青素产率为15.45mg L-1d-1，平均生物量产率为0.50g L-1d-1。
效果如表1。表1为本装置与已报道的“两步法”培养雨生红球藻生产虾青素的文献比较，结果可见，运用连续梯度补料方法和装置应用于雨生红球藻高效扩繁，可以在短时间内获得大量的不动孢子，且该些孢子在第二阶段的光合诱导条件下，其平均生物量产率和虾青素产率均为报道的最高。
表1：“两步法”培养雨生红球藻生产虾青素的文献比较
其中：1、SVf代表雨生红球藻第一阶段的培养体积(L)；2、代表雨生红球藻第一阶段的培养方法：异养(H)、兼性培养(M)、光合自养(A)；3、CP代表第一阶段的细胞生产效率(105mL-1d-1)；4、CW代表雨生红球藻第一阶段的单位细胞质量(ng cell-1)；5、代表第一阶段的生物量产率(BPf,g L-1d-1)，过渡阶段的生物量产率(BPt,g L-1d-1)和第三阶段的生物量产率(BPs,g L-1d-1)；6、TC代表第一阶段的培养周期(TCf,days)，过渡阶段的培养周期(TCt,days)、第二阶段的培养周期(TCs,days)和总的培养周期(TCT＝TCf+TCt+TCs)；7、CV代表雨生红球藻从第一阶段到第二阶段的存活率(％)；8、DR代表第一阶段的细胞稀释到第二阶段时的稀释率(％)；9、APs代表第二阶段的虾青素生产效率(mg L-1d-1)；10、ABP代表整个培养周期下的平均生物量产率(g L-1d-1)，计算公式：ABP＝(BPf×TCf+BPt×TCt+BPs×TCs)/TCT。
其制备步骤与实施例1相同。

Claims (1)

1.一种雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料方法，其步骤是：
A、不同梯度补料培养基的配制：罐中培养基为改良后的kobayashi’s basal培养基，将其中酵母提取物替换为硝酸钠，其余组分如下：1.2g醋酸钠、0.405gL-天冬酰胺，0.5g硝酸钠，0.2g六水合氯化镁，0.01g七水合硫酸亚铁，0.02g二水合氯化钙和1000 mL去离子水，对配制的全培养基进行高温121 °C，28-32min灭菌；连续梯度补料单元为一组连续的不同碳氮比梯度的碳氮补料浓缩液，以醋酸钠和硝酸钠分别作为碳源和氮源，每个碳氮补料瓶中醋酸钠的浓度维持不变，从1号瓶-5号瓶的硝酸钠的浓度从高至无，形成比例从50-10不同梯度的碳氮比的浓缩液；
B、雨生红球藻活化扩种：在超净工作台将灭菌后的培养基转移至50-250mL三角烧瓶，并接入新鲜的雨生红球藻藻种，固体平板上刮取克隆接入培养基，或从液体种子中转接至培养基进行扩培，培养条件为：光照强度为3~10μmol photons∙m-2∙s-1，温度控制在24-26 °C，通气培养7-10天；
C、雨生红球藻接种至发酵罐：检测扩种7-10天后的藻液细胞数以接种量V1，接种量V1之后对藻液进行离心浓缩，以新鲜灭菌的培养基洗净后重悬，接入发酵罐，雨生红球藻藻株接入细胞浓度C2为1.0-3.0×105 cells/mL，培养条件为光照强度为3~5μmol photons∙m-2∙s-1，温度控制在24-26 °C，实验组和对照组发酵罐的碳氮比分别维持在50和10；
D、监测培养参数/pH控制：主控单元监测藻液的pH7-8，相对溶氧值及温度培养参数，每日取样，监测培养基中的残留有机非颗粒碳和总氮浓度，添加20-30ml的碳氮浓缩液，维持培养基的pH7-8和碳氮比恒定；
E、定向调节培养基碳氮比：在培养初期0-5天维持罐内碳氮比在10；此后3天，维持罐内碳氮比在20，此后3天，维持罐内碳氮比在30，以此类推，每3天提高罐内碳氮比，在培养末期3-5天添加不含硝酸钠的碳源浓缩液，维持高碳氮比；
所述补料方法使用一种雨生红球藻种源高效扩繁的连续梯度补料装置，它由发酵罐（1）、进气口（2）、出气口（3）、进样口（4）、出样口（5）、补料口（6）、pH控制单元（7）、溶氧控制单元（8）、温度控制单元（9）组成，其特征在于：发酵罐（1）分别与主控单元（10）、连续梯度补料单元（11）、空气输入单元（12）相连；主控单元（10）分别与pH控制单元（7）、溶氧控制单元（8）、温度控制单元（9）相连，连续梯度补料单元（11）与补料口（6）相连，空气输入单元（12）与进气口（2）相连；
所述的连续梯度补料单元（11）由连续碳氮浓缩补料单元（13）、微量元素浓缩补料单元（14）、水瓶（15）组成，连续碳氮浓缩补料单元（13）、微量元素浓缩补料单元（14）、水瓶（15）分别与补料导管（16）和通气导管（17）连接，补料导管（16）的上端与蠕动泵（18）连接；所述的连续碳氮浓缩补料单元（13）它由连续的5－8个碳氮浓缩补料瓶（22）、补料导管（20）、通气导管（17）、多通式液体分流装置（21）组成，碳氮浓缩补料瓶（22）分别与补料导管（20）和通气导管（17）连接，补料导管（20）与多通式液体分流装置（21）连接，多通式液体分流装置（21）的上端与补料导管（16）连接，补料导管（16）与蠕动泵（18）连接。
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