CN104762214A - 一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法 - Google Patents

一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法 Download PDF

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顾志敏
郭建林
黄鲜明
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Abstract

本发明公开了一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于按以下工艺步骤：1）培养容器的选择及前处理；2）培养液的配制；3）培养的种类及接种；4）日常管理。本发明方法设计合理，利用小球藻可以进行混合营养培养的特点，结合传统的塑料袋培养方法，进行简化和优化，同时通过提供混合营养生长所需的营养物质和条件，改变小球藻传统培养方式中仅进行光合自养的代谢方式，形成了利用塑料袋进行小球藻混合营养培养的方法，采用该方法培养小球藻，可有效提高藻类的培养效率，减少对设备的依赖和能源的消耗，从而缩减了小球藻培养的成本，便于进行推广应用。

Description

一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法
技术领域
本发明属于藻类生物培养技术领域，属于水产生物饵料培养的范畴，具体涉及一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法。
背景技术  
小球藻（Chlorella）是第一个被人工培养的微藻，是绿藻门（Chlorophyta）绿球藻目(Chlorococcales)小球藻科(Chlorellaceae)中重要的一个属，可以作为人类的食品及食品添加剂，或作为水产动物的人工育苗阶段的饵料和饲料添加剂，或作为培养轮虫的饵料，或用于提取EPA、DHA、类胡萝卜素和虾青素等生物活性物质，由此可见，小球藻有着非常重要的经济价值。小球藻的培养开始于19世纪末，荷兰微生物学家Beijerinck首先在琼脂平板上分离到了一种小球藻的纯培养物。
小球藻大规模培养研究可以分为两个阶段，50年代至70年代末，主要进行开放池培养的研究，80年代以后开始进行密闭和半密闭反应器的研究。传统的产业化微藻培养多利用开放的水池，微藻以光合自养的模式生长。开放池培养具有设施简易，投资低，成本小等特点，但产量低，一般藻类细胞密度200mg-500mg/L，培养面积大，生长因子难控制，CO2补加困难，收获成本高，易被其他生物污染，产量低等因素，限制了开放池培养的发展。采用透明容器或玻璃管道设计的半密闭和密闭光照生物反应器培养系统进行培养，藻类细胞的密度提高了6-12倍，总体积相对减少，分离成本大大降低，各种生长因子及工艺可以采用自动化、集约化管理，提高了生产效率和产品质量，可以避免受其他生物和非生物物质的污染，但存在光反应器一次性投资大，许多技术尚未完全解决的问题。近年来，小球藻的高密度异养发酵培养培养技术也取得了巨大的进步，大幅度提高了小球藻的生长速度，使小球藻异养培养的工业化生产成为可能，然而其存在异养代谢过程同自养代谢或混养代谢有很大差异，对设备要求高，投资大等不足，一般的水产养殖企业不愿意高投资进行小球藻生产，而且设备的操作流程比较复杂和难以掌握。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于按以下工艺步骤：
1）培养容器的选择及前处理
选用容积为20-100L的透明塑料袋作为培养容器，培养容器在使用前用漂白粉溶液浸泡24小时后曝晒12小时，备用；塑料袋可采用藻类培养专用的塑料袋，也可采用虾苗鱼苗尼龙袋；
2）培养液的配制
培养液由基础培养基、葡萄糖、水组成，基础培养基选用BG11培养基、f/2培养基、复合肥配培养基中的任一种，其中，葡萄糖的添加量为每升培养液中添加0.5-1g；培养基中添加葡萄糖，可为小球藻提供异养生长的条件，使得小球藻在自然条件下有无光照均能进行生长，同时，也可弥补单纯使用无机营养盐培养小球藻导致的营养不均衡的缺陷；
3）培养的种类及接种
培养的种类为普通小球藻，接种入培养容器中的藻类为正处于指数生长期的小球藻，将经过步骤1）处理的培养容器内装入经步骤2）配制的培养液普通小球藻藻种至容积的50%，接种量为10-50%，于上午9:00-11:00进行接种，接种完成后，将培养容器密封，于10℃以上的温度条件下进行混合营养培养，接种的小球藻藻液的温度与培养液的温度基本保持一致，最多相差0.5℃；本发明采取自然光照，在气温较低时，最好将培养容器放置在玻璃阳光房或塑料大棚内进行培养；密封时，藻类培养专用塑料袋用封口盖密封，虾苗鱼苗尼龙袋用橡皮圈打结封口；
4）日常管理
接种完成后，将培养容器整齐摆放在有白色瓷砖的地面上，每天摆动培养容器至少四次，观察培养容器内藻类的生长情况。通常在在接种的第二天开始，色泽稍微变浓且有小气泡产生，表明生长正常；接种后两天若袋内颜色没有变化或无气泡产生，且颜色灰黄的袋子表明接种失败，应及时放弃、清理。当培养容器内的藻液变得浓绿时即可接种到其他藻类培养容器内，接种方法相同。在留够足量藻种的情况下，便可将培养的藻类用于轮虫、枝角类和鱼苗或虾苗的培育。使用过的培养容器及塑料袋在保证没有破损的前提下，经漂白粉溶液消毒后方可用于下一次的培养。
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤1）中塑料袋为立式袋或平面式袋，漂白粉溶液的浓度为50-100mg/L。
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤1）中塑料袋为藻类培养专用塑料袋或尼龙袋。
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤2）中BG11培养基的配方为NaNO3 1.5g/L，K2HPO4.3H2O 0.04g/L，MgSO4.7H2O 0.075g/L，CaCl2.2H2O 0.036g/L，柠檬酸0.006g/L, 柠檬酸铁0.006g/L，EDTANa2 0.001g/L，Na2CO3 0.02g/L，微量元素溶液 1ml/L，加超纯水至1L，用HCl和NaOH调节pH值至7.1。
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤2）中f/2的配方为：NaNO3 0.075g/L，NaH2PO4. 2H2O 0.00565 g/L，f/2 微量元素溶液 1ml/L，f/2维生素溶液 1ml/L，加超纯水至1L。
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤2）中复合肥培养基的配方为：俄罗斯阿康复合肥0.5-10g/L，加超纯水至1L。
所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于2）中葡萄糖的添加量为每升培养液中添加1g。
本发明方法设计合理，利用小球藻可以进行混合营养培养的特点，结合传统的塑料袋培养方法，进行简化和优化，同时通过提供混合营养生长所需的营养物质和条件，改变小球藻传统培养方式中仅进行光合自养的代谢方式，形成了利用塑料袋进行小球藻混合营养培养的方法，采用该方法培养小球藻，可有效提高藻类的培养效率，减少对设备的依赖和能源的消耗，从而缩减了小球藻培养的成本，便于进行推广应用。
附图说明
    图1为三种培养基混合营养培养小球藻的效果对比图。
具体实施方式
通过以下说明书附图及具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
在容积为20L的平面藻类培养袋中，使用BG11作为藻类基础培养基，添加葡萄糖量为1g/L，进行小球藻培养，接种密度量为10%，培养体积为10L，接种后的初始OD值为0.091，平均气温为26.35℃，培养1天、2天、3天和4天后藻类OD值分别为0.1345、0.404、0.7855和1.201；换算成细胞密度分别为174.70、594.31、1188.31和1835.24 万个/ml；换算成细胞干重分别为0.03、0.09、0.17和0.25mg/ml。
实施例2
在容积为20L的平面藻类培养袋中，使用f/2作为藻类基础培养基，添加葡萄糖量为1g/L，进行小球藻培养，接种密度量为10%，培养体积为10L，接种后的初始OD值为0.091，平均气温为26.35℃，培养1天、2天、3天、和4天藻类OD值分别为0.1175、0.355、0.7595和0.9735；换算成细胞密度分别为148.23、518.02、1147.83和1481.02 万个/ml；换算成细胞干重分别为0.03、0.08、0.16和0.20mg/ml。
实施例3
在容积为20L的平面藻类培养袋中，使复合肥培养基作为藻类基础培养基，复合肥添加量为1g/L，添加葡萄糖量为1g/L，进行小球藻培养，接种密度量为10%，培养体积为10L，接种后的初始OD值为0.091，平均气温为26.35℃，培养1天、2天、3天、和4天藻类OD值分别为0.1105、0.314、0.5255和0.641；换算成细胞密度分别为137.33、454.18、783.49和963.32万个/ml；换算成细胞干重分别为0.03、0.07、0.11和0.14mg/ml。实施例1、2、3三种培养基混合营养培养小球藻的效果对比见图1。
从图1可以看出：培养1天和2天时，三种培养基混合营养培养小球藻以BG11效果最好，f/2次之，但三者之间差异不显著；培养3天，三种培养基混合营养培养小球藻也是以BG11效果最好，f/2次之，BG11和f/2之间的差异不显著，但两者与复合肥培养基之间差异均显著；培养4天，三种培养基混合营养培养小球藻以BG11效果最好，BG11与其他两个培养基之间的差异均显著。
实施例4
在容积为40L的鱼苗尼龙袋中，使用复合肥培养基作为藻类基础培养基，复合肥添加量为1g/L，添加葡萄糖量为1g/L，进行小球藻培养，接种密度量为10%，培养体积为10L，接种后的初始OD值为0.092，平均气温为26.35℃，培养2天、3天、4天、5天藻类OD值分别为0.246 、0.433、0.547和0.601；换算成细胞密度分别为348.31、693.47、816.96和901.04万个/ml；换算成细胞干重分别为0.05、0.09、0.12和0.13mg/ml。
实施例5
在容积为40L的鱼苗尼龙袋中，使用复合肥培养基作为藻类基础培养基，复合肥添加量为0.5g/L，添加葡萄糖量为0.5g/L，进行小球藻培养，接种密度量为10%，培养体积为10L，接种后的初始OD值为0.103，平均气温为26.35℃，培养2天、3天、4天、5天藻类OD值分别为0.320、0.371、0.415和0.385 ；换算成细胞密度分别为463.52、542.93、611.44和564.73万个/ml；换算成细胞干重分别为0.07、0.08、0.09、0.08mg/ml。
运用其他规格或样式的塑料袋和其他培养基进行小球藻及其他藻类的混合营养培养均属于本专利的保护范围。

Claims (7)

1. 一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于按以下工艺步骤：
1）培养容器的选择及前处理
选用容积为20-100L的透明塑料袋作为培养容器，培养容器在使用前用漂白粉溶液浸泡24小时后曝晒12小时，备用；
2）培养液的配制
培养液由基础培养基、葡萄糖、水组成，基础培养基选用BG11培养基、f/2培养基、复合肥配培养基中的任一种，其中，葡萄糖的添加量为每升培养液中添加0.5-1g；
3）培养的种类及接种
培养的种类为普通小球藻，接种入培养容器中的藻类为正处于指数生长期的小球藻，将经过步骤1）处理的培养容器内装入经步骤2）配制的培养液和普通小球藻藻种至容积的50%，接种量为10-50%，于上午9:00-11:00进行接种，接种完成后，将培养容器密封，于10℃以上的温度和自然光照条件下进行混合营养培养，接种的小球藻藻液的温度与培养液的温度基本保持一致，最多相差0.5℃；
4）日常管理
接种完成后，将培养容器整齐摆放在有白色瓷砖的地面上，每天摆动培养容器至少四次，观察培养容器内藻类的生长情况。
2. 根据权利要求1所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤1）中塑料袋为立式袋或平面式袋，漂白粉溶液的浓度为50-100mg/L。
3. 根据权利要求1所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤1）中塑料袋为藻类培养专用塑料袋或尼龙袋。
4. 根据权利要求1所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤2）中BG11培养基的配方为NaNO3 1.5g/L，K2HPO4.3H2O 0.04g/L，MgSO4.7H2O 0.075g/L，CaCl2.2H2O 0.036g/L，柠檬酸0.006g/L, 柠檬酸铁0.006g/L，EDTANa2 0.001g/L，Na2CO3 0.02g/L，微量元素溶液 1ml/L，加超纯水至1L，用HCl和NaOH调节pH值至7.1。
5. 根据权利要求1所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤2）中f/2的配方为：NaNO3 0.075g/L，NaH2PO4.2H2O 0.00565 g/L，f/2 微量元素溶液 1ml/L，f/2维生素溶液 1ml/L，加超纯水至1L。
6. 根据权利要求1所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于步骤2）中复合肥培养基的配方为：俄罗斯阿康复合肥0.5-10g/L，加超纯水至1L。
7. 根据权利要求1所述的一种利用塑料袋混合营养培养小球藻的方法，其特征在于2）中葡萄糖的添加量为每升培养液中添加1g。
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