CN103834570B - 三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养高产方法；三角褐指藻和小新月菱形藻传统上使用f／2培养基并使用开放水泥池且分开单独培养，生长速度慢，产量低，易污染，操作麻烦。使用我发明的培养基并使用矿泉水桶混合培养三角褐指藻和小新月菱形藻，脂肪酸含量高、成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且在培养基中增加了蛋白胨、琼脂、麦芽糖、山梨酸钾、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、人尿、牛粪和羊粪浸出液，营养更全面、均衡，藻生长速度大幅提高，产量提高180％。而且，混合培养，两种藻互利共生，优势互补，相互促进，充分利用营养盐，提高了经济效益。
Description
技术领域
本发明属于微藻养殖领域，尤其涉及一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养高产技术。
背景技术
三角褐指藻PhaeodactylumtricornutumBohlin是一种海洋单细胞微藻，隶属硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属。细胞卵形、梭形或放射形，在不同环境条件下形状可以转变。卵形细胞长8微米，宽3微米，只有一个硅质壳面，中心有一细胞核，有黄褐色色素体1-3片。梭形细胞长20微米，两臂末端较钝。平行分裂成2个形态相同细胞进行繁殖。细胞无硅质壳，故在裂殖时出与硅藻不一样，藻体不缩小。在9-92‰盐度范围内生活，最适盐度为25-32‰。适温范围5-25℃，最适10-20℃，在0℃条件下仍能繁殖，超过25℃停止生长，随温度升高逐渐大量死亡。适宜光照强度1000-8000lux，最适3000-5000lux，小型培养时忌强烈阳光直射。pH7-10环境下均能生长、繁殖，最适7.5-8.5。该藻营养价值极高，除富含蛋白质、脂类和多糖，可贵的是它含有EPA、DHA等被称为“脑黄金”的多不饱和脂肪酸，且生长繁殖快，易培养。作为鱼、虾、贝等海洋动物最佳开口饵料，是最早进行人工培养的海洋微藻，已在栉孔扇贝、马粪海胆、日本对虾、牡蛎、文蛤、贻贝、舌鳎、银鲛、鲍鱼、梭子蟹等多种名贵海产经济动物苗种生产中应用。
小新月菱形藻Nitzschiaclosterium属硅藻门，羽纹纲，双菱形目，菱形藻科，菱形藻属，细胞中央膨大成纺锤形，两端渐尖，似月牙形。细胞长12-23微米，宽2-3微米，中央有一细胞核。色素体黄褐色，两片，位于核两侧。分布于世界各海水、半咸和淡水水域，我国各海区均有。最适盐度范围25-32‰，适温15-20℃，水温超过28℃，停止生长；最适光照强度3000-8000lux，培养时忌直射阳光；适宜pH7-10，最适7.5-8.5。小新月菱形藻俗称“小硅藻”，富含蛋白质、碳水化合物及多种高不饱和脂肪酸，是海洋经济动物大菱鲆、中国对虾、海湾扇贝、鲍鱼、马粪海胆和海参的良好饵料，能促进幼体和亲体生长发育，增强幼苗抗病力，有重要培养价值。
海水中无机碳的存在形式以HCO3 -为主(占90％)，而游离的CO2不足1％。过去人们一直认为，水体中游离CO2是藻类利用外源无机碳的唯一形式。张学成的工作表明，螺旋藻培养基中添加50-100mmol/LNaHCO3，不仅可以满足螺旋藻生长的需要，而且有助于保持藻体生长的pH值。林惠民认为，NaHCO3可作为藻类生长的碳源。我的研究表明三角褐指藻和小新月菱形藻可以利用HCO3 -作为碳源。
温度、光照、盐度、营养盐等对三角褐指藻和小新月菱形藻生长都有重要影响。氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是三角褐指藻和小新月菱形藻生长最重要的营养元素。我的研究显示，对三角褐指藻和小新月菱形藻来说，尿素用作氮源无论对细胞的生长繁殖、不饱和脂肪酸合成、色素积累等方面的效果均优于NaNO3和NH4Cl。人尿中95％是水，5％是可溶性无机盐，其中2％是尿素。在藻细胞的氮代谢中，氮必须以NH4 +的形式与细胞内的碳水化合物衍生的酮酸作用生成氨基酸，再合成蛋白质。已经证实许多藻含有尿素酶，在它的催化作用下，尿素分解出氨被微藻利用，酶功能的差异是造成各种微藻利用尿素能力差异的主要原因。孙凌毅指出，三角褐指藻对铵盐和尿素的利用强于硝酸盐。张贵杰等研究指出培养小新月菱形藻以尿素效果最好，硝酸钠次之，氯化铵最差。张青田等认为以尿素为氮源培养三角褐指藻效果强于氯化铵。本人研究证实每升培养液中添加适量的的尿液对三角褐指藻和小新月菱形藻生长有较好促进作用。
三角褐指藻和小新月菱形藻的培养传统上使用f／2培养基并使用开放水泥池式培养，藻细胞倍增时间长，生长速度慢，投资大，产量低，容易污染，操作麻烦。使用本发明提供的培养基并使用矿泉水桶培养三角褐指藻和小新月菱形藻细胞不饱和脂肪酸含量高，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且我在培养基中增加了碳酸氢钠、山梨酸钾、蛋白胨、琼指、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、人尿、牛粪和羊粪浸出液等营养成分，有机肥和无机肥混合搭配使用，营养更加全面、均衡，三角褐指藻和小新月菱形藻生长速度大幅度提高，培养周期缩短，产量提高180％。而且，与传统的单种培养相比，混合培养有利于发挥两种微藻营养需求的差异和互利共生作用，优势互补，相互促进，更加充分地利用营养盐，更加高效地吸收光能，减少了营养盐的损失，提高了经济效益。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养高产技术的培养基，其配方如下：
NH4NO320毫克，NaNO36毫克，尿素3毫克，KH2PO41.5毫克，Na2SiO310毫克，NaHCO3400毫克，九二0植物生长刺激素7国际单位，蛋白胨6毫克，琼脂5毫克，麦芽糖8毫克，蔗糖10毫克，山梨酸钾12毫克，葡萄糖45毫克，海藻酸丙二醇酯20毫克，环己基氨基磺酸钠13毫克，蜂胶6毫克，乳酸钠-L6毫克，麦芽糖醇10毫克，硬脂酰乳酸钠5毫克，焦磷酸铁3毫克，柠檬酸钾5毫克，乙酸钠6毫克，山梨糖醇液1.5毫升，三聚甘油单硬脂酸酯8毫克，人尿1.5毫升，海泥抽取液1.2毫升，土壤抽出液2.5毫升，牛粪浸出液2毫升，羊粪浸出液1.5毫升，f／2微量元素溶液1.4毫升，f／2维生素溶液1.2毫升，煮沸冷却后的纯净海水1000毫升，其中f／2微量元素溶液配方：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4·5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克，Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升，
f／2维生素溶液配方：维生素B120.5毫克，维生素B1100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏水1000毫升。
一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，具体步骤如下：
培养容器为家庭用的矿泉水桶，容积20升，无色透明或浅天蓝色，洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入前述的培养基12升，充分摇匀5分钟，选择生命力旺盛、无污染的三角褐指藻和小新月菱形藻藻液分别进行接种，先接种三角褐指藻，接种密度6×104cell／mL，再接种小新月菱形藻，接种密度8×104cell／mL，接种后轻轻摇动矿泉水桶5分钟，使两种藻混合均匀；瓶口插入两根干净玻璃管，一根较长，顶端露出瓶口7-10厘米，下端插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根较短，16厘米，两端露出瓶口即可，用以排气；两根玻璃管同样粗细，直径6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干净的透明胶带封口并将两根玻璃管固定；长的玻璃管上端用料管与充气泵相连，充入混合气体，混合气体成分和体积比例是空气∶纯二氧化碳∶臭氧∶一氧化氮＝90％∶8％∶1％∶1％；充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；室内培养，空调控温，最佳温度23±2℃，日光灯照射，光照强度12000-15000lux，光／暗周期为16L／8D，即光照16小时，黑暗8小时；培养至第6天，停止充气，揭开透明胶带，用漏斗从瓶口加入3升新鲜培养基，胶带重新封口，充气，继续培养，至第9天，三角褐指藻和小新月菱形藻密度分别增加至3500×104cell／mL和1000×104cell／mL，停止培养，从瓶口倒出藻液，将矿泉水桶洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养；
所述中药消毒液：由以下重量比的物质组成：黄芩7-10份、黄秋葵粉3-5份、鱼腥草3-5份、丹参5-10份、牛黄5-10份；将上述药材放入可加热的容器中，加入3-5倍体积的纯净水，煮沸后持续煮30-50分钟，后过滤，沉淀1-2小时，后取澄清液即可；所述黄秋葵粉是清洗干净并烘干后的黄秋葵茎叶、花及籽粒经超微粉碎机粉碎至250目，然后搅匀、灭菌所得；
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用紫外灯消毒，消毒10-20分钟。
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用高压氮气喷射消毒，消毒5-10分钟；
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒5-6分钟；
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后分两个阶段消毒，先使用高压氮气喷射消毒，消毒2-3分钟；使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒2-3分钟；消毒完毕后再进行藻类培养。
有益效果：三角褐指藻和小新月菱形藻的培养传统上是分开单独培养，使用f／2培养基并使用开放水泥池式培养，不能发挥二种藻营养需求上优势互补、相互促进的有利条件，生长速度慢，产量低，容易污染，操作麻烦。使用我发明的培养基并使用矿泉水桶混合培养三角褐指藻和小新月菱形藻，不但高不饱和脂肪酸含量高、成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且在培养基中增加了碳酸氢钠、蛋白胨、琼脂、麦芽糖、山梨酸钾、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、人尿、牛粪和羊粪浸出液等营养成分，有机肥和无机肥搭配使用，营养更加全面、均衡，三角褐指藻和小新月菱形藻生长速度大幅度提高，培养周期缩短，产量提高180％。而且，与传统的单种培养相比，混合培养有利于发挥两种微藻营养需求的差异和互利共生作用，优势互补，相互促进，更加充分地利用营养盐，更加高效地吸收光能，减少了营养盐的损失，提高了经济效益。
附图说明
图1一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法图。
其中附图标记为：1矿泉水桶；2充气管；3排气管；4藻液。
具体实施方式
1)接种用的三角褐指藻和小新月菱形藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如索氏提取法)，以确保接种时藻种处于指数生长期；
2)九二0植物生长刺激素为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；
3)因柠檬酸铁(FeC6H5O7·5H2O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
4)各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
5)各种营养盐特别是f／2微量元素溶液和f／2维生素溶液均需预先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过60天；
6)全部营养盐加完后要摇动水桶15分钟，使营养盐混合均匀后即可接种；
7)人尿制备方法：取人尿1000毫升，烧瓶煮沸后冷却备用；
8)羊粪浸出液制备方法：取新鲜羊粪10公斤，加入麸皮1公斤，玉米面0.5公斤，自来水1升，充分搅拌，装入塑料袋发酵10天，后取2公斤放入盆中，加入6升蒸馏水，充分搅拌15分钟，静置，48小时后500目筛绢过滤，取滤液加热煮沸30分钟，以杀死其中的微生物，冷却，静置72小时，取上清液，即为羊粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，置于4℃冰箱备用；
9)牛粪浸出液制备方法：取牛粪50公斤，加入麸皮3公斤，玉米面1公斤，自来水4升，充分搅拌，堆成圆锥状，自然发酵15天，后摊成薄层，阳光下暴晒3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸馏水，充分搅匀，静置，48小时后400目筛绢过滤，取滤液加热，煮沸45分钟，杀死其中的细菌、霉菌、病毒等，冷却，沉淀48小时，取上清液，即得牛粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，置于4℃冰箱备用；
10)海泥抽取液制备方法：取比较肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2份淡水，充分搅拌均匀，静置1-2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加1克NaOH的量加入NaOH，煮沸25分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置24小时取上清液备用；
11)土壤抽出液制备方法：取草地上层松散且富含有机质的土壤1公斤，加蒸馏水4000毫升，再加入NaOH2-3克，煮沸60分钟，冷却后过滤，将清液置于暗处静置48小时，取上清液备用；
12)所用化学药品纯度均需化学纯级别；
13)一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养高产培养基，其配方如下：
NH4NO320毫克，NaNO36毫克，尿素3毫克，KH2PO41.5毫克，Na2SiO310毫克，NaHCO3400毫克，九二0植物生长刺激素7国际单位，蛋白胨6毫克，琼脂5毫克，麦芽糖8毫克，蔗糖10毫克，山梨酸钾12毫克，葡萄糖45毫克，海藻酸丙二醇酯20毫克，环己基氨基磺酸钠13毫克，蜂胶6毫克，乳酸钠-L6毫克，麦芽糖醇10毫克，硬脂酰乳酸钠5毫克，焦磷酸铁3毫克，柠檬酸钾5毫克，乙酸钠6毫克，山梨糖醇液1.5毫升，三聚甘油单硬脂酸酯8毫克，人尿1.5毫升，海泥抽取液1.2毫升，土壤抽出液2.5毫升，牛粪浸出液2毫升，羊粪浸出液1.5毫升，f／2微量元素溶液1.4毫升，f／2维生素溶液1.2毫升，煮沸冷却后的纯净海水1000毫升，
其中f／2微量元素溶液配方：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4·5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克，Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升，
f／2维生素溶液配方：维生素B120.5毫克，维生素B1100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏水1000毫升。
14)一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，具体步骤如下：
培养容器为家庭用的矿泉水桶，容积20升，无色透明或带浅天蓝色，洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入所述的培养基12升，充分摇匀5分钟，选择生命力旺盛、无污染的三角褐指藻和小新月菱形藻藻液分别进行接种，先接种三角褐指藻，接种密度6×104cell／mL，再接种小新月菱形藻，接种密度8×104cell／mL，接种后轻轻摇动矿泉水桶5分钟，使两种藻混合均匀；瓶口插入两根干净玻璃管，一根较长，顶端露出瓶口7-10厘米，下端插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根较短，16厘米，两端露出瓶口即可，用以排气；两根玻璃管同样粗细，直径6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干净的透明胶带封口并将两根玻璃管固定；长的玻璃管上端用料管与充气泵相连，充入混合气体，混合气体成分和体积比例是空气∶纯二氧化碳∶臭氧∶一氧化氮＝90％∶8％∶1％∶1％；充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；室内培养，空调控温，最佳温度23±2℃，日光灯照射，光照强度12000-15000lux，光／暗周期为16L／8D，即光照16小时，黑暗8小时；培养至第6天，停止充气，揭开透明胶带，用漏斗从瓶口加入3升新鲜培养基，胶带重新封口，充气，继续培养，至第9天，三角褐指藻和小新月菱形藻密度分别增加至3500×104cell／mL和1000×104cell／mL，停止培养，从瓶口倒出藻液，将矿泉水桶洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养；
15)所述中药消毒液：由以下重量比的物质组成：黄芩7-10份、黄秋葵粉3-5份、鱼腥草3-5份、丹参5-10份、牛黄5-10份；将上述药材放入可加热的容器中，加入3-5倍体积的纯净水，煮沸后持续煮30-50分钟，后过滤，沉淀1-2小时，后取澄清液即可；所述黄秋葵粉是清洗干净并烘干后的黄秋葵茎叶、花及籽粒经超微粉碎机粉碎至250目，然后搅匀、灭菌所得；
16)优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用紫外灯消毒，消毒10-20分钟。
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用高压氮气喷射消毒，消毒5-10分钟；
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒5-6分钟；
优选地，对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后分两个阶段消毒，先使用高压氮气喷射消毒，消毒2-3分钟；使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒2-3分钟；消毒完毕后再进行藻类培养。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养高产技术的培养基，其特征在于：其配方如下：NH4NO320毫克，NaNO36毫克，尿素3毫克，KH2PO41.5毫克，Na2SiO310毫克，NaHCO3400毫克，九二0植物生长刺激素7国际单位，蛋白胨6毫克，琼脂5毫克，麦芽糖8毫克，蔗糖10毫克，山梨酸钾12毫克，葡萄糖45毫克，海藻酸丙二醇酯20毫克，环己基氨基磺酸钠13毫克，蜂胶6毫克，乳酸钠-L6毫克，麦芽糖醇10毫克，硬脂酰乳酸钠5毫克，焦磷酸铁3毫克，柠檬酸钾5毫克，乙酸钠6毫克，山梨糖醇液1.5毫升，三聚甘油单硬脂酸酯8毫克，人尿1.5毫升，海泥抽取液1.2毫升，土壤抽出液2.5毫升，牛粪浸出液2毫升，羊粪浸出液1.5毫升，f/2微量元素溶液1.4毫升，f/2维生素溶液1.2毫升，煮沸冷却后的纯净海水1000毫升；
其中f/2微量元素溶液配方：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4·5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克，Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；
f/2维生素溶液配方：维生素B120.5毫克，维生素B1100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏水1000毫升。
2.一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，其特征在于具体步骤如下：
培养容器为家庭用的矿泉水桶，容积20升，无色透明或浅天蓝色，洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入权利要求1所述的培养基12升，充分摇匀5分钟，选择生命力旺盛、无污染的三角褐指藻和小新月菱形藻藻液分别进行接种，先接种三角褐指藻，接种密度6×104cell/mL，再接种小新月菱形藻，接种密度8×104cell/mL，接种后轻轻摇动矿泉水桶5分钟，使两种藻混合均匀；瓶口插入两根干净玻璃管，一根较长，顶端露出瓶口7-10厘米，下端插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根较短，16厘米，两端露出瓶口即可，用以排气；两根玻璃管同样粗细，直径6毫米；最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干净的透明胶带封口并将两根玻璃管固定；长的玻璃管上端用料管与充气泵相连，充入混合气体，混合气体成分和体积比例是空气∶纯二氧化碳∶臭氧∶一氧化氮＝90％∶8％∶1％∶1％；充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；室内培养，空调控温，最佳温度23±2℃，日光灯照射，光照强度12000-15000lux，光/暗周期为16L/8D，即光照16小时，黑暗8小时；培养至第6天，停止充气，揭开透明胶带，用漏斗从瓶口加入3升新鲜培养基，胶带重新封口，充气，继续培养，至第9天，三角褐指藻和小新月菱形藻密度分别增加至3500×104cell/mL和1000×104cell/mL，停止培养，从瓶口倒出藻液，将矿泉水桶洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养；
所述中药消毒液：由以下重量比的物质组成：黄芩7-10份、黄秋葵粉3-5份、鱼腥草3-5份、丹参5-10份、牛黄5-10份；将上述药材放入可加热的容器中，加入3-5倍体积的纯净水，煮沸后持续煮30-50分钟，后过滤，沉淀1-2小时，后取澄清液即可；所述黄秋葵粉是清洗干净并烘干后的黄秋葵茎叶、花及籽粒经超微粉碎机粉碎至250目，然后搅匀、灭菌所得。
3.根据权利要求2所述的一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，其特征在于：对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用紫外灯消毒，消毒10-20分钟。
4.根据权利要求2所述的一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，其特征在于：对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用高压氮气喷射消毒，消毒5-10分钟。
5.根据权利要求2所述的一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，其特征在于：对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后进行消毒，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒5-6分钟。
6.根据权利要求2所述的一种三角褐指藻和小新月菱形藻混合高产培养方法，其特征在于：对选用的所述的矿泉水桶，洗刷干净后分两个阶段消毒，先使用高压氮气喷射消毒，消毒2-3分钟；使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒2-3分钟；消毒完毕后再进行藻类培养。
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