CN105647825B

CN105647825B - 一种同时提高螺旋藻生物质和多糖产率的方法

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Publication number: CN105647825B
Application number: CN201410639520.7A
Authority: CN
Inventors: 薛松; 姚长洪; 陆洪斌; 曹旭鹏
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2034-11-13
Also published as: CN105647825A

Abstract

本发明涉及螺旋藻培养积累生物质和多糖，具体的说是一种通过控制营养盐的添加培养螺旋藻，使其生物质和多糖同时积累。将培养至指数生长期的螺旋藻细胞转入营养限制性培养基，自然光照或人工光照，培养至稳定期收获藻细胞，其生物质产率是营养丰富条件下培养的1～4倍，多糖产率比营养丰富条件下培养提高0.8～20倍，多糖含量达到藻干重的45％～80％，比营养丰富条件下培养提高2～6倍。本发明解决了螺旋藻生物质与多糖不能同时积累的矛盾，实现了快速高效地生产螺旋藻多糖，具有营养盐消耗少、生产成本低、多糖含量高等优点，有利于简化下游加工操作，促进螺旋藻多糖的产业化生产。

Description

一种同时提高螺旋藻生物质和多糖产率的方法

技术领域

本发明涉及螺旋藻培养积累生物质和多糖，具体的说是一种通过控制营养盐的添加，采用合适的接种密度、光照、温度和pH值培养螺旋藻，使其生物质和多糖同时积累。可用于螺旋藻培养及其多糖的生产以及以螺旋藻多糖为原料的食品、医药、能源等相关领域。

背景技术

螺旋藻是一种的多细胞丝状蓝藻(Blue Green Algae)，又称蓝细菌(Cyanobacteria)，属蓝藻门(Cyanophyta)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Osciallatoriaceae)、节旋藻属(Arthrospira)，主要分布于热带、亚热带地区淡水或盐碱性湖泊中。螺旋藻含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、色素、多糖、维生素和微量元素，被认为是21世纪最理想的保健品，目前国内外已将螺旋藻广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药、饲料等行业。

螺旋藻多糖是螺旋藻细胞内的一种水溶性多糖，具有抗肿瘤、抗辐射、抗突变等生物活性，能提高机体细胞和体液的免疫功能，抵制癌细胞增殖，减轻辐射所引起的遗传损伤等，在防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面具有广阔的应用前景。此外，螺旋藻多糖主要由葡萄糖残基连接而成，经过水解后可用于发酵法生产生物乙醇、生物丁醇、生物氢、甲烷等生物能源，因此在微藻生物能源领域具有潜在应用价值。然而在营养丰富条件下螺旋藻多糖含量很少，占细胞干重的8％以下，这严重影响了螺旋藻多糖的产量，增加了后续加工提取的成本，使其难于产业化生产。另一方面，在胁迫条件下，微藻细胞倾向于积累糖类和油脂，但同时蛋白质的合成受到阻碍，这会影响细胞的生长和光合固碳效率，降低生物质的产率，从而使多糖的产率没有明显提高。因此，开发一种积累螺旋藻多糖，同时不影响细胞生物质生产的方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种同时提高螺旋藻生物质和多糖产率的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将培养至指数生长期的螺旋藻细胞转入营养限制性培养基，通过控制营养盐的添加，采用合适的接种密度、光照、温度和pH值培养螺旋藻，使其生物质和多糖同时积累。可按如下步骤具体操作：

1)藻种的培养

螺旋藻细胞在营养丰富的培养基中培养，每升水体含：NaHCO₃ 3～20g，KCl 0～1g，NaCl 0～2g，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02g，MgCl₂·6H₂O 0～0.2g，CaCl₂·2H₂O 0～0.05g，H₃BO₃ 0～3mg，MnCl₂·4H₂O 0～2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0～0.5mg，ZnSO₄·7H₂O 0～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0～0.3mg，并通过添加NaNO₃控制培养基中N浓度在0.16～0.64g/L，通过添加K₂HPO₄和H₃PO₄控制P浓度在0.04～0.16g/L，通过添加K₂SO₄和MgSO₄·7H₂O控制S浓度在0.2～0.4g/L；初始接种密度OD₅₆₀为0.3～0.5，温度20～35℃，pH值8～12，自然条件下光照或人工光暗比12h:12h～24h:0h光照，培养液受光面光照强度80～3000μmol m^–2s^–1，培养至指数生长期。

2)藻细胞生物质和多糖的同时积累

将培养至指数生长期的螺旋藻细胞作为藻种，将原藻种液经离心或过滤洗涤后得到藻泥，接入新鲜营养限制性培养基并调整初始接种密度OD₅₆₀为0.3～0.5；或原藻种液经新鲜新鲜营养限制性培养基直接稀释至初始接种密度OD₅₆₀为0.3～0.5；温度20～35℃，pH值8～12，自然条件下光照或人工光暗比12h:12h～24h:0h光照，培养液受光面光照强度80～3000μmolm^–2s^–1，培养至稳定期收获藻细胞。

步骤2)所述营养限制性培养基中每升水体含：NaHCO₃ 3～20g，KCl0～1g，NaCl 0～2g，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02g，MgCl₂·6H₂O 0～0.2g，CaCl₂·2H₂O 0～0.05g，H₃BO₃ 0～3mg，MnCl₂·4H₂O 0～2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0～0.5mg，ZnSO₄·7H₂O 0～0.3mg，CuSO₄·5H₂O 0～0.3mg，并通过添加NaNO₃控制培养基中N浓度在0～10mg/L，通过添加K₂HPO₄和H₃PO₄控制P浓度在0.04～0.16g/L，通过添加K₂SO₄和MgSO₄·7H₂O控制S浓度在0.2～0.4g/L；或通过添加NaNO₃控制培养基中N浓度在0.16～0.64g/L，通过添加K₂HPO₄和H₃PO₄控制P浓度在0～1mg/L，通过添加K₂SO₄和MgSO₄·7H₂O控制S浓度在0.2～0.4g/L；或通过添加NaNO₃控制培养基中N浓度在0.16～0.64g/L，通过添加K₂HPO₄和H₃PO₄控制P浓度在0.04～0.16g/L，通过添加K₂SO₄和MgSO₄·7H₂O控制S浓度在1.0～1.5mg/L。

步骤1)和2)所述营养限制性培养基的水体来源为天然盐碱水、地下水、自来水或积累多糖的藻细胞收获后的培养废水。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.实现了螺旋藻生物质和多糖产率的同时提高：依此方法培养螺旋藻，其生物质产率是营养丰富条件下培养的1～4倍，多糖产率比营养丰富条件下培养提高0.8～20倍，多糖含量达到藻干重的45％～80％，比营养丰富条件下培养提高2～6倍。

2.培养成本低，多糖积累迅速：利用营养限制性培养基培养螺旋藻，可以降低营养盐的消耗，提高单位营养盐投入的产品产出，有利于降低生产成本；多糖在藻细胞内迅速积累，一般3～4天可以达到最大多糖产率，生产周期短。

3.螺旋藻多糖生产的可持续性好：利用天然盐碱水培养并循环利用采收废水，可以节约淡水资源，减少污水排放，同时可以在不适合粮食种植和人类居住的碱湖附近进行培养，不占用耕地。

总之，本发明解决了螺旋藻生物质与多糖不能同时积累的矛盾，实现了快速高效地生产螺旋藻多糖，具有营养盐消耗少、生产成本低、多糖含量高等优点，有利于简化下游加工操作，促进螺旋藻多糖的产业化生产，可广泛应用于以螺旋藻多糖为原料的食品、医药、能源等相关领域。

附图说明

图1为本发明在营养丰富(+N+P+S)、P限制(-P)和S限制(-S)下培养螺旋藻的生物质积累情况。

图2为本发明在营养丰富(+N+P+S)、P限制(-P)和S限制(-S)下培养螺旋藻的多糖含量变化情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法和结果进行说明。本发明通过控制营养盐的添加，采用合适的接种密度、光照、温度和pH值培养螺旋藻，使其生物质和多糖同时积累。

实施例1

考察P限制和S限制条件下螺旋藻生物质和多糖积累情况。

藻种培养和多糖积累过程均在500mL柱形鼓泡式光生物反应器(玻璃材质，直径50mm，高400mm)进行。

1)藻种的培养

螺旋藻细胞在营养丰富的培养基(Zarrouk)中培养，培养基用去离子水配制，每升水体含：NaHCO₃ 16.8g，K₂HPO₄ 0.5g，NaNO₃ 2.5g，K₂SO₄1g，NaCl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg。初始接种密度OD₅₆₀为0.5，培养温度30±2℃，连续单排照光，光照强度200μmol m^–2s^–1，通入空气流量0.4vvm。

2)藻细胞生物质和多糖的同时积累

将培养至OD₅₆₀为3的细胞以4000rpm离心5min，弃上清，藻泥用不含K₂HPO₄、K₂SO₄和MgSO₄·7H₂O的Zarrouk培养基(Zarrouk-P-S)洗一次后重悬于Zarrouk-P-S中，调整细胞密度OD₅₆₀为0.5，接种于500mL柱形鼓泡式光生物反应器。培养温度30±2℃，连续单排照光，光照强度80μmolm^–2s^–1，通入空气流量0.4vvm。

营养丰富条件(+N+P+S)：每升藻液加入K₂HPO₄ 0.5g，K₂SO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g。

P限制条件(-P)：每升藻液加入KCl 0.43g，K₂SO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O0.2g。

S限制条件(-S)：每升藻液加入K₂HPO₄ 0.5g，KCl 0.43g，MgCl₂·6H₂O0.17g。

从图1可以看出，利用上述光照生物反应器进行螺旋藻培养，在初始接种量、温度、光照强度、通气速率等培养条件均一样的情况下，P限制的螺旋藻细胞在培养的7天内生物质积累均高于营养丰富下的生物质积累；在第6天收获细胞，生物质浓度达到2.3g/L，生物质产率达到0.25g/(L·d)，比营养丰富条件下生物质产率提高27％。S限制下生物质产率比营养丰富条件下略高。

从图2可以看出，利用上述光照生物反应器进行螺旋藻培养，在初始接种量、温度、光照强度、通气速率等培养条件均一样的情况下，P限制的螺旋藻细胞在培养的第6天多糖占细胞干重含量达到最大值84.5％，比营养丰富条件下提高3.5倍；多糖产率达到0.31g/(L·d)，比营养丰富条件下提高5.5倍。S限制的螺旋藻细胞在培养的第2天多糖占细胞干重含量达到45％，比营养丰富条件下提高1倍；多糖产率达到0.23g/(L·d)，比营养丰富条件下提高1.7倍。

此实施例说明，P限制和S限制均能同时提高螺旋藻生物质和多糖产率。

实施例2

考察N限制对室内小规模培养螺旋藻的生物质和多糖积累影响。

藻种的培养与实施例1中藻种的培养相同。多糖积累过程在6L塑料方形盆中进行，水深8cm。

将培养至OD₅₆₀为3的细胞以4000rpm离心5min，弃上清，藻泥用不含NaNO₃的Zarrouk培养基(Zarrouk-N)洗一次后重悬于Zarrouk-N中，调整细胞密度OD₅₆₀为0.5，接种于6L塑料方形盆中，以功率为5W的潜水泵对藻液进行搅拌。培养温度23±2℃，自然条件下光照，藻液表面最大光照强度有90％的时间不超过84.5μmol m^–2s^–1。

营养丰富条件(+N)：每升藻液加入NaNO₃ 2.5g。

N限制条件(-N)：每升藻液加入NaCl 1.72g。

培养至第4天收获，-N下生物质产量为0.41g/L，是+N下的1.2倍；-N下生物质产率达到0.020g/(L·d)，比+N下提高3倍；-N下多糖含量达到细胞干重的74.3％，比+N下提高6.4倍。

此实施例说明，N限制能同时提高螺旋藻生物质和多糖产率。

实施例3

利用N限制在室外跑道池大规模培养螺旋藻，提高生物质和多糖产率。

藻种培养和多糖积累过程均在室外1亩跑道池中进行，水深30cm，水流速度20cm/s。

1)藻种的培养

螺旋藻细胞在营养丰富的天然母液碱培养基(MYJ)中培养，培养基用地下淡水水配制，每升水体含：鄂尔多斯高原天然碱湖所产母液碱6g(含NaHCO₃约3.4g)，NaNO₃ 1g，KCl0.5g，H₃PO₄ 0.12g，FeSO₄·7H₂O0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.01g。初始接种密度OD₅₆₀为0.3，培养温度32±5℃，自然条件光照，藻液表面最大光照强度3000μmol m^–2s^–1。

2)藻细胞生物质和多糖的同时积累

将培养至OD₅₆₀为0.45的细胞经80目滤网过滤，用地下水洗涤3次，得到含水量约90％的藻泥，将其接入1亩跑道池中，用不含NaNO₃的MYJ培养基重悬混匀，调整细胞密度OD₅₆₀为0.4，培养温度32±5℃，自然条件光照，藻液表面最大光照强度3000μmol m^–2s^–1。

营养丰富条件(+N)：每升藻液加入NaNO₃ 1g。

N限制条件(-N)：藻液中不加N源。

培养至第3天收获，-N下生物质产量为0.15g/L，是+N下的1.25倍；-N下生物质产率和多糖产率分别达到0.056g/(L·d)和0.062g/(L·d)，分别是+N下的1.4倍和21倍；-N下多糖含量达到细胞干重的51.8％，比+N下提高5.5倍；

此实施例说明，利用N限制在室外跑道池大规模培养螺旋藻，能有效提高生物质和多糖产率，具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种同时提高螺旋藻生物质和多糖产率的方法，其特征在于，将培养至指数生长期的螺旋藻细胞作为藻种，转入营养限制性培养基，初始接种密度OD₅₆₀ 为0.5，接种于500mL柱形鼓泡式光生物反应器，培养温度28~32℃，连续单排照光，光照强度80μmol m^–2 s^–1，通入空气流量0.4vvm，培养至稳定期收获藻细胞；

所述营养限制性培养基为P限制性培养基或S限制性培养基，P 限制条件下培养基用去离子水配制，每升水体含：NaHCO₃ 6.8g，KCl 0.43g，NaNO₃2.5g，K₂SO₄ 1g，NaCl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg；

S限制条件下培养基用去离子水配制，每升水体含：NaHCO₃ 6.8g，K₂HPO₄ 0.5g，NaNO₃2.5g，KCl 0.43g，NaCl 1g，MgCl₂·6H₂O 0.17g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5H₂O 0.08mg。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，转入营养限制性培养基的方式为：原藻种液经离心或过滤洗涤后得到藻泥，接入新鲜营养限制性培养基并调整至所需细胞密度，或原藻种液经新鲜营养限制性培养基直接稀释至所需细胞密度。