CN105441524A - 一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法 - Google Patents

一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法，步骤如下：(1)在常规的微藻培养基中，添加蔗糖或蔗糖替代物，灭菌待用；(2)选择并收集处于对数生长期的产油脂的微藻细胞，将微藻细胞与具有胞外蔗糖酶活性的酵母以25:1～2:1的比例混合，并接种到微藻培养基中；(3)在通气条件下培养，收集微藻藻体和酵母菌体的混合物，用于油脂的提取。本发明的主要特点是将富含油脂但单蔗糖利用能力差的微藻与具有胞外蔗糖酶分泌能力且能积累油脂的酵母进行共培养，使能源微藻在以蔗糖为碳源的培养基中能够正常生长，并与酵母共同积累油脂，有效地解决产油微藻不能利用蔗糖的问题，降低异养培养过程中油脂的生产成本。

Description

一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法
技术领域
本发明具体涉及一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法，属于生物技术领域。
背景技术
微藻是一类光驱动的“细胞工厂”，它可以通过光合作用将二氧化碳和水转化成多种化学物质，如蛋白质、脂肪酸、维生素、矿物质和抗氧化物质等；一些藻类还含有一些其他的活性物质，如富含胡萝卜素的螺旋藻，富含虾青素的雨生红球藻等，因此，微藻广泛应用于动物饵料、食品、药品以及食品添加剂等的生产。此外，微藻还可以积累大量的油脂以及烃类等物质，微藻是一种优良的能源生物，由于其具有油脂含量高，分布范围广，不占用耕地等优点，被认为是有巨大潜力补充化石能源短缺的能源生物。
作为光合自养型微生物，微藻常规的培养模式是以CO2等无机碳源，利用光进行光合自养型培养；但是自养条件下，由于细胞对光的吸收与散射，以及细胞之间的相互遮挡，使得培养液中存在光衰减作用，从而使得微藻的生长受到光照条件的限制，同时使得光合反应器的设计和运行比较困难，自养培养过程中细胞的生长比较缓慢，培养周期较长，且最终生物量浓度较低，而且较低的生物量浓度会进一步增加后续细胞采收过程的成本。相比之下，利用有机碳源对微藻进行异养培养，可以显著促进细胞的生长速率，缩短培养周期，而且可以达到较高的生物量浓度，此外，异养培养过程无需光照，反应器的设计和运行比较简单。
当前，微藻的异养培养研究大多利用葡萄糖为碳源，研究表明，许多产油微藻都具有一定的葡萄糖等单糖的代谢能力，但是由于葡萄糖的成本较高，作为大规模培养以生产生物柴油的过程，基于葡萄糖的微藻异养培养过程的经济性较差。
与葡萄糖等单糖相比，蔗糖的成本较低，且制糖工业中产生的蔗渣、废糖蜜等下脚料富含大量的蔗糖，在微藻的异养培养中具有较好的应用前景。但是，研究显示，大多数微藻对蔗糖等二糖的代谢能力较差，在以蔗糖为碳源的异养培养过程中细胞的生长和油脂的产率均较低。
通过对蔗糖的代谢机制进行研究发现，在植物和微藻中，蔗糖的代谢主要基于细胞膜上的蔗糖转运蛋白，藻类中可能由于相关基因的缺失或表达水平较低，使得微藻中蔗糖代谢能力较差；但是在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，研究人员发现酿酒酵母具有胞外蔗糖酶分泌能力，可以在胞外将蔗糖降解为单糖后供细胞吸收利用(WieczorkeR.,KrampeS.,WeierstallT.,FreidelK.,HollenbergC.P.,BolesE.Concurrentknock-outofatleast21transportergenesisrequiredtoblockuptakeofhexosesinSaccharomycescerevisiae.FEBSLett.,1999,464:123-128)。另外，在其它的酵母中，如红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)等中同样发现了胞外蔗糖降解能力，且红发夫酵母中蔗糖的降解速度高于酵母细胞对糖的吸收速度，使得胞外具有明显的单糖积累(KilianS.G.,SutherlandF.C.W.,MeyerP.S.,duPreezJ.C.Transport-limitedsucroseutilizationandneokestoseproductionbyphaffiarhodozyma.Biotechnol.Lett.,1996,18:975-980)。另外，在其他产油酵母，如弯隐球酵母(Cryptococcusalbidun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)等中，也发现有一定的胞外蔗糖酶分泌能力。
发明内容
在以蔗糖为碳源的微藻培养生产生物能源(油脂)的过程中，针对微藻对蔗糖利用能力差的问题，本发明提供了一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法，将产油微藻与具有胞外蔗糖酶分泌能力的酵母共培养，使得微藻利用酵母降解蔗糖后产生的单糖进行生长与代谢，有效解决蔗糖异养培养下微藻对碳源的利用效率低、生长缓慢的问题，有效降低微藻生物能源生产过程中的碳源成本，还大大提高了培养过程中微藻细胞的生长速率和油脂产率。
为实现上述目的，本发明的一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法包括以下步骤：
(1)配置培养基：在常规的微藻培养基中，添加蔗糖或蔗糖替代物，灭菌待用；
(2)接种：选择并收集处于对数生长期的产油脂的微藻细胞，将上述微藻细胞与具有胞外蔗糖酶活性的酵母以25:1～2:1质量比的比例混合，并接种到步骤(1)所配置的培养基中；
(3)培养并提取油脂：在通气条件下进行培养，收集微藻藻体和酵母菌体的混合物，用于油脂的提取。
进一步地，步骤(1)中，所述微藻培养基为BBM培养基、Chu13培养基、BG11培养基、CT培养基或SE培养基；所述蔗糖替代物为废糖蜜或蔗渣；所述蔗糖或蔗糖替代物的添加量为1～40g/L。
进一步地，步骤(2)中，所述微藻细胞与具有胞外蔗糖酶活性的酵母以15:1～5:1质量比的比例混合。所述微藻为淡水能源藻；所述具有胞外蔗糖酶活性的酵母为弯隐球酵母(Cryptococcusalbidun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)、产油油脂酵母(Lipomyslipofer)或茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans；接种后微藻细胞和酵母混合物的初始生物量为0.05～0.6g/L。所述淡水能源藻为小球藻、布朗葡萄藻、栅藻、衣藻、新绿藻或菱形藻。
进一步地，步骤(3)中，培养的条件如下：温度为20～30℃；通气量为2～25vvm；培养的时间为3～12天；培养的pH为5～8。
本发明提供的一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法，使能源微藻可以高效地利用蔗糖进行微藻细胞生物量和油脂积累，大大提高了蔗糖的利用效率，使得培养过程中油脂的产率得到明显提高。
与传统的异养培养过程相比，本发明的创新点及先进性在于：
(1)本发明提供的方法可以有效地解决产油微藻不能利用蔗糖的问题，使得微藻的异养培养可以利用比较低廉的有机碳源进行，提高了现有蔗糖废料的利用率，废物利用，降低了培养系统中油脂的培养成本；
(2)本发明的微藻利用酵母降解蔗糖后产生的单糖进行生长与代谢，可以有效提高培养过程中微藻细胞的生物量和油脂的产率；而且本发明的微藻藻体与酵母菌体共同生产积累油脂，双重积累，大大提高了油脂的产量，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了15～25％。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制的实施例如下：
实施例1
(1)在BBM培养基中添加10g/L的蔗糖，灭菌；
(2)将处于对数生长期的椭圆小球藻收集后，与弯隐球酵母以5:1的比例和0.5g/L的初始生物量添加到培养基中；
(3)在30℃、pH6.0、5vvm的通气量下培养5天后，收集藻体和菌体混合物，用于油脂的提取。
处理效果测试：
培养过程中油脂的产率达到2.2g/L/day，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了18％。
实施例2
(1)在Chu13培养基中添加1g/L蔗糖当量的废糖蜜，灭菌；
(2)将处于对数生长期的布朗葡萄藻收集后，与斯达氏油脂酵母以25:1的比例和0.05g/L的初始生物量添加到培养基中；
(3)在20℃、pH7.0、2vvm的通气量下培养12天后，收集藻体和菌体混合物，用于油脂的提取。
处理效果测试：
培养过程中油脂的产率达到1g/L/day，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了15％。
实施例3
(1)在BG11培养基中添加20g/L的蔗糖，灭菌；
(2)将处于对数生长期的斜生栅藻收集后，与浅白色隐球酵母以10:1的比例和0.15g/L的初始生物量添加到培养基中；
(3)在22℃、pH8.0、10vvm的通气量下培养7天后，收集藻体和菌体混合物，用于油脂的提取。
处理效果测试：
培养过程中油脂的产率达到2.5g/L/day，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了25％。
实施例4
(1)在CT培养基中添加40g/L蔗糖当量的蔗渣，灭菌；
(2)将处于对数生长期的莱茵衣藻收集后，与胶粘红酵母以15:1的比例和0.6g/L的初始生物量添加到培养基中；
(3)在24℃、pH5.0、25vvm的通气量下培养3天后，收集藻体和菌体混合物，用于油脂的提取。
处理效果测试：
培养过程中油脂的产率达到1.4g/L/day，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了20％。
实施例5
(1)在SE培养基中添加30g/L的蔗糖，灭菌；
(2)将处于对数生长期的富油新绿藻收集后，与产油油脂酵母以2:1的比例和0.45g/L的初始生物量添加到培养基中；
(3)在26℃、pH6.5、20vvm的通气量下培养9天后，收集藻体和菌体混合物，用于油脂的提取。
处理效果测试：
培养过程中油脂的产率达到1.6g/L/day，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了22％。
实施例6
(1)在BG11培养基中添加25g/L蔗糖当量的废糖蜜，灭菌；
(2)将处于对数生长期的菱形藻收集后，与茁芽丝孢酵母以20:1的比例和0.3g/L的初始生物量添加到培养基中；
(3)在28℃、pH7.5、15vvm的通气量下培养10天后，收集藻体和菌体混合物，用于油脂的提取。
处理效果测试：
培养过程中油脂的产率达到2.0g/L/day，比单纯微藻以葡萄糖为碳源的纯培养下提高了23％。
以上实施例中，油脂的产率主要受微藻种类的影响，同时其他条件也会对产率有所影响，但是综合各因素没有明显的规律可循。

Claims (6)

1.一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)配置培养基：在常规的微藻培养基中，添加蔗糖或蔗糖替代物，灭菌待用；
(2)接种：选择并收集处于对数生长期的产油脂的微藻细胞，将上述微藻细胞与具有胞外蔗糖酶活性的酵母以25:1～2:1质量比的比例混合，并接种到步骤(1)所配置的微藻培养基中；
(3)培养并提取油脂：在通气条件下进行培养，收集微藻藻体和酵母菌体的混合物，用于油脂的提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微藻培养基为BBM培养基、Chu13培养基、BG11培养基、CT培养基或SE培养基；所述蔗糖替代物为废糖蜜或蔗渣；所述蔗糖或蔗糖替代物的添加量为1～40g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微藻细胞与具有胞外蔗糖酶活性的酵母以15:1～5:1质量比的比例混合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微藻为淡水能源藻；所述具有胞外蔗糖酶活性的酵母为弯隐球酵母(Cryptococcusalbidun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)、产油油脂酵母(Lipomyslipofer)或茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans；接种后微藻细胞和酵母混合物的初始生物量为0.05～0.6g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述淡水能源藻为小球藻、布朗葡萄藻、栅藻、衣藻、新绿藻或菱形藻。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，培养条件如下：温度为20～30℃；通气量为2～25vvm；培养的时间为3～12天；培养的pH为5～8。
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