CN109456905A - 一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母及其应用，命名为隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU‑1的菌株已于2018年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16595。所述隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU‑1可促进微藻高效利用蔗糖进行生长，在与微藻共培养体系中，具有较高的胞外蔗糖酶活，且该酵母细胞自身生长缓慢，其生长速率远低于微藻细胞的生长速率。在促进微藻高效利用蔗糖生长的同时，还可以实现较高的微藻细胞比例，有利于藻基产品的生产。

Description

一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母及其应用

技术领域

本发明具体涉及一株促进微藻利用蔗糖的共生隐球酵母及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

异养培养是一种较好的微藻培养方法，通过利用外源碳源，可以有效解决微藻自养培养过程中存在光限制问题，同时细胞的生长速率和细胞产率也得到极大提高，使得培养周期大大缩短。此外，异养培养无需光照供应，避免了光反应器中光照系统的实验，使得反应器的设计、放大和运行更加简单。

碳源是异养培养必需的底物之一，而葡萄糖是当前微藻异养培养应用最为广泛的碳源，但是由于葡萄糖的成本较高，作为规模化培养生产如生物柴油之类的价值较低产品的过程，基于葡萄糖的微藻异养培养过程的经济性较差。与葡萄糖等单糖相比，蔗糖是一种比较廉价的工业发酵的底物，被广泛应用于包括生物乙醇等的生产过程中，此外，制糖工业中产生大量的蔗渣、废糖蜜等下脚料富含大量的蔗糖，是一种极具前景的微藻异养培养的碳源。但是，现有研究显示，大多数微藻对蔗糖等二糖的代谢能力较差，在异养培养下，难以利用蔗糖生长。

多种微生物可以通过分泌胞外蔗糖酶，将蔗糖降解为单糖后再转运至胞内同化，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），红发夫酵母（Phaffiarhodozyma），粘红酵母(Rhodotorula glutinis)等（Wieczorke R.,Krampe S.,Weierstall T., et al.Concurrent knock-out of at least 21 transporter genes is required to blockuptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett.,1999, 464:123-128）；与此同时，细胞对蔗糖的降解速度远高于细胞对单糖的吸收速度，从而使得胞外具有明显的单糖积累（Kilian S.G., Sutherland F.C.W., Meyer P.S., et al.Transport-limited sucrose utilization and neokestoseproduction by phaffiarhodozyma.Biotechnol. Lett., 1996, 18:975-980）。基于上述理论，CN 105441524 A和CN105441525 A分别公开了一种基于酵母共培养的利用蔗糖异养培养微藻的方法，通过将微藻与具有胞外蔗糖酶分泌能力的酵母共培养，微藻细胞可以利用酵母胞外降解蔗糖产生的单糖异养生长，有效的解决了微藻难以利用蔗糖异养生长的问题（Wang S.K., Wu Y.,Wang X. Heterotrophic cultivation of Chlorella pyrenoidosa using sucrose asthe sole carbon source by co-culture with Rhodotorulaglutinis. Bioresour.Technol., 2016, 220: 615-620）。但是，在实际应用中我们发现，现有的酵母，包括酿酒酵母、粘红酵母、红法夫酵母、隐球酵母等在共培养过程中，酵母细胞的生长远高于微藻的生长，使得共培养体系中微藻细胞的比例较低，难以获得较高的微藻生物量产率，不利于藻基产品的生产。如Wang等人在报道的利用蛋白核小球藻与粘红酵母共培养异养代谢蔗糖的过程中，蛋白核小球藻的最终细胞比例只有20~45%（Wang S.K., Wu Y., Wang X.Heterotrophic cultivation of Chlorella pyrenoidosa using sucrose as the solecarbon source by co-culture with Rhodotorulaglutinis. Bioresour. Technol.,2016, 220: 615-620）。当前尚无利用隐球酵母与微藻共培养的报道。

发明内容

针对现有微藻与酵母共培养利用蔗糖异养培养过程中，现有的酵母细胞生长迅速，微藻细胞比例低，难以找到合适的共培养微生物的问题，本发明的目的是提供一株在微藻共培养过程中具有较好的蔗糖水解能力，同时细胞自身生长缓慢的隐球酵母并进行实际应用，为利用蔗糖进行微藻的异养培养提供一株较好的共生菌。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明从小球藻藻种中分离筛选（采集于扬州大学生物科学与技术学院，采集时间，2018年9月，采集人，王仕楷，汪旭，电话，18036262702）出一株与微藻共生的可促进微藻异养利用蔗糖的隐球酵母，命名为隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1的菌株已于2018年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.16595，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101。

本发明所述隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1用于促进微藻高效利用蔗糖进行生长。所述微藻为小球藻、栅藻、衣藻、布朗葡萄藻、雨生红球藻等可以利用葡萄糖的淡水藻以及微拟球藻、三角褐指藻、裂殖壶菌等海洋藻。

本发明所述隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1在常规的微藻培养基中具有较高的胞外蔗糖酶活，且酵母细胞自身生长缓慢，其生长速率远低于微藻细胞的生长速率。隐球酵母细胞与微藻细胞共培养后，隐球酵母细胞的数量占细胞总数的0.2~8.6%，细胞总数为隐球酵母细胞与微藻细胞的数量之和。

所述微藻培养基包括BBM培养基，Chu 13培养基，BG 11培养基，CT培养基，SE培养基，1/2f培养基等。

本发明所述隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1的菌落呈乳白色，表面光滑（图1和图2）。在常规培养基以及室温下生长良好。

本发明还提供一株促进微藻利用蔗糖隐球酵母的应用，所述隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1促进微藻高效利用蔗糖进行生长。

具体包括如下步骤：

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在培养器皿中，加入适量的微藻培养基，添加1~40 g/L的蔗糖，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的微藻以2~15%的接种量接入，然后以藻细胞数的0.5~10%（即加入的隐球酵母细胞数为藻细胞数的0.5~10%）的比例加入步骤（1）制得的隐球酵母菌液；

（4）在20~28℃、0.5~4 vvm的通气量以及pH 6.5. ~8.5的条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。

与现有的微藻异养培养过程相比，本发明的创新点及先进性在于：

（1）本发明提供的一株促进微藻利用蔗糖生长的共生隐球酵母YZU-1有效地解决了现有微生物在与微藻共培养过程中生长迅速，导致微藻细胞比例低等问题，实现了微藻的高效培养；

（2）本发明提供的一株促进微藻利用蔗糖生长的共生隐球酵母YZU-1来源于小球藻共生菌，具有较好的安全性，可广泛适用于各种藻基生物产品的生产过程中。

附图说明

图1为本发明所述的隐球酵母YZU-1在YPD培养基上的菌落特征；

图2 为本发明所述的隐球酵母YZU-1在500倍光学显微镜下的形态特征；

图3为本发明所述的隐球酵母YZU-1 26S rDNA序列（SEQ ID No.1）；

隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1的菌株于2018年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16595，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101；分类命名为Cryptococcussp。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制的实施例如下：

实施例1

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在250 mL三角瓶中，加入适量的BG-11培养基，添加1 g/L的蔗糖，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的蛋白核小球藻以10%的接种量接入，然后以藻细胞数的5%的比例加入15 μL的酵母菌液；

（4）在25℃、光照35 μmol·m⁻²·s⁻¹、2 vvm的通气量以及pH 7.0的条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。

处理效果测试：

微藻的最终浓度达到了1.06 g/L，而隐球酵母YZU-1的细胞数仅占细胞总数的2.5%。

实施例2

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在500 mL三角瓶中，加入适量的SE培养基，添加2 g/L的蔗糖，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的二形栅藻以5%的接种量接入，然后以藻细胞数的3%的比例加入20 μL的酵母菌液；

（4）在26℃、4 vvm的通气量以及pH 8.0的黑暗条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。

处理效果测试：

微藻的最终浓度达到了1.51 g/L，而隐球酵母YZU-1的细胞数仅占细胞总数的1.2%。

实施例3

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在2 L通气式发酵罐中，加入适量的Chu 13培养基，添加1 g/L的纯蔗糖，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的布朗葡萄藻以15%的接种量接入，然后以藻细胞数的2%的比例加入20 μL的酵母菌液；

（4）在20℃、0.5 vvm的通气量以及pH 6.5的黑暗条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。

处理效果测试：

微藻的最终浓度达到了2.0 g/L，而隐球酵母YZU-1的细胞数与布朗葡萄藻细胞簇的比例约为1:8。

实施例4

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在2 L三角瓶中，加入适量的BG-11培养基，添加20 g/L蔗糖当量的废糖蜜，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的雨生红球藻以2%的接种量接入，然后以藻细胞数的8%的比例加入25 μL的酵母菌液；

（4）在26℃、3 vvm的通气量以及pH 8.0的黑暗条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。

处理效果测试：

微藻的最终浓度达到了10.2 g/L，而隐球酵母YZU-1的细胞数仅占细胞总数的0.6%。

实施例5

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在10 L气升式反应器中，加入适量的BG-11培养基，添加40 g/L的纯蔗糖，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的蛋白核小球藻以8%的接种量接入，然后以藻细胞数的10%的比例加入1 mL的酵母菌液；

（4）在28℃、1 vvm的通气量以及pH 8.5的黑暗条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。

处理效果测试：

微藻的最终浓度达到了31.7 g/L，而隐球酵母YZU-1的细胞数仅占细胞总数的0.7%。

以上实施例中，微藻的终浓度受微藻种类、反应器类型、培养条件的综合影响，但是综合各因素没有明显的规律可循。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母及其应用

<140> xhx2018120702

<141> 2018-12-07

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> DNA

<213> Cryptococcus sp

<400> 1

gctaaggatc cctagtacgg cgagtgaagc gggaagagct caaatttgaa atctagtagc 60

cttcggctgc tcgagttgta atctagagaa gtgttttccg tgccggccca tgtacaagtc 120

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atctaaagct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa gtaccgtgag ggaaagatga 300

aaagcacttt gg 312

Claims (6)

1. 一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母，其特征在于，隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1的菌株于2018年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16595，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2. 如权利要求1所述的一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母，其特征在于，隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1在常规的微藻培养基中具有高的胞外蔗糖酶活，且隐球酵母细胞生长速率低于微藻细胞的生长速率，隐球酵母细胞与微藻细胞共培养后，隐球酵母细胞的数量占细胞总数的0.2~8.6%，细胞总数为隐球酵母细胞与微藻细胞的数量之和。

3. 如权利要求2所述的一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母，其特征在于，所述微藻培养基为BBM培养基，Chu 13培养基，BG 11培养基，CT培养基，SE培养基或1/2f培养基。

4. 权利要求1所述的一株促进微藻利用蔗糖隐球酵母的应用，其特征在于，所述隐球酵母（Cryptococcus sp）YZU-1促进微藻利用蔗糖进行生长。

5.如权利要求4所述的一株促进微藻利用蔗糖的隐球酵母的应用，其特征在于，所述微藻为可以利用葡萄糖的淡水藻或海洋藻，淡水藻为小球藻、栅藻、衣藻、布朗葡萄藻、雨生红球藻的一种或几种，海洋藻为微拟球藻、三角褐指藻、裂殖壶菌的一种或几种。

6.权利要求1所述的一株促进微藻利用蔗糖隐球酵母的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）培养隐球酵母YZU-1至对数期；

（2）在培养器皿中，加入适量的微藻培养基，添加1~40 g/L的蔗糖，灭菌并冷却；

（3）将处于对数生长期的微藻以2~15%的接种量接入，然后以藻细胞数的0.5~10%的比例加入步骤（1）制得的隐球酵母菌液；

（4）在20~28℃、0.5~4 vvm的通气量以及pH 6.5. ~8.5的条件下培养，待细胞生长至稳定期后，收集藻液。