CN112358969A - 一种促进饵料微藻扩繁的方法 - Google Patents

Abstract

一种促进饵料微藻扩繁的方法。本发明提供一种饵料微藻扩繁的方法，通过添加分离自假微型海链藻和微拟球藻藻液中的一种藻际有益细菌来提高这些饵料微藻最高繁殖密度以及平台期维持时间。所述的藻际有益细菌是保藏号为CCTCC M 20200448的海杆菌。本发明方法使微型海链藻和微拟球藻的繁殖速度远高于常规微藻营养液培养微藻的速度，而最高繁殖密度以及平台期维持时间远高于常规培养方法，在同样水体条件下可以提供更多的微藻供应，同时由于平台期较常不容易衰败，非常利于实际贝类规模化生产过程中微藻量控制和生产管理。

Description

一种促进饵料微藻扩繁的方法

技术领域

本发明属于水产养殖饵料微藻培养技术领域，具体涉及一种促进饵料微藻扩繁的方法，能够有效提高假微型海链藻和微拟球藻等重要饵料微藻最高繁殖密度以及平台期维持时间。

背景技术

国内外学者在贝类培育过程中均发现，目前还没有人工配合饵料能够应用于滩涂贝类的苗种繁育，即使使用微藻干粉或者冷藏储存的微藻，其效果也远远不及活体微藻(Espinosa et al.,2006)，所以在实际贝类苗种繁殖生产中，只有新鲜培养的活体微藻细胞才是贝类苗种培育的唯一饵料选择。其中饵料效果较好的微藻主要包括球等鞭金藻、假微型海链藻、角毛藻、微拟球藻等。

目前，国内外对这些饵料微藻的培养影响因素研究聚焦于光照、盐度、温度等环境因素，培养基均是针对微藻营养需求的有机和无机营养成分，但即使尽量控制适合的环境条件和营养条件，实际大规模露天繁殖过程中，微藻的最高繁殖密度依旧不够高，非常容易衰败，不能满足贝类规模化苗种繁育的饵料需求。

研究表明，藻际细菌对微藻扩繁有着重要的影响。例如，噬纤维菌(Cytophagasp.)可通过直接攻击的方式抑制硅藻和鞭毛藻的扩繁 (Imai et al.,1993)，亚硫酸杆菌(Sulfitobacter sp.)却可以通过分泌吲哚乙酸来促进硅藻的繁殖(Amin et al.,2015)。而目前实际微藻扩繁技术均没有考虑藻际细菌的影响。

发明内容

本发明目的是提供一种饵料微藻扩繁的方法，通过添加分离自假微型海链藻和微拟球藻藻液中的一种藻际有益细菌来提高这些饵料微藻最高繁殖密度以及平台期维持时间，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的饵料微藻扩繁的方法，是在饵料微藻培养的过程中添加从饵料微藻中筛选的藻际有益细菌；

所述的藻际有益细菌，是海杆菌属的海杆菌(Marinobacter sp.) NBU-A-0002，属于变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲 (Gammaproteobacteria)、海杆菌属(Marinobacter)中的一种，从微型海链藻、微拟球藻藻液培养液中分离获得，保藏号为：CCTCCNO: M 20200448。保藏日期为2020年8月26日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学。

本发明所提供的方法中所使用的一种藻菌扩培液，其一种组成配比如下：

50-200mg/L KNO₃、5-20mg/L KH₂PO₄、1-5mg/L Fe-citrate·5 H₂O、0.06-0.6g/L红糖、2-10μg/L VB₁、0.01-0.1μg/L VB₁₂。

作为优选，所述的藻菌扩培液的具体组成如下：

100mg/L KNO₃、10mg/L KH₂PO₄、3mg/L Fe-citrate·5H₂O、0.6 g/L红糖、6μg/LVB₁、0.05μg/L VB₁₂。

本发明方法使微型海链藻和微拟球藻的繁殖速度远高于常规微藻营养液培养微藻的速度，而最高繁殖密度以及平台期维持时间远高于常规培养方法，在同样水体条件下可以提供更多的微藻供应，同时由于平台期较常不容易衰败，非常利于实际贝类规模化生产过程中微藻量控制和生产管理。

附图说明

图1：海杆菌菌株(Marinobacter sp.)的菌落形态图；

图2：本发明中不同培养方案对微型海链藻和微拟球藻生长的影响图；

图3：本发明中不同培养基对海杆菌生长的影响图。

具体实施方式

以下结合实施案例对本发明进行详细的描述。

实施例1：筛选藻际有益细菌

将无菌纯化的微型海链藻、微拟球藻和从藻液中分离获得的藻际细菌分别培养至指数生长期。将微型海链藻、微拟球藻藻液按每份 50mL分装至100mL无菌锥形瓶中。将各扩摇菌液13000rpm，低温离心10min收集并用宁大三号海水培养基清洗三次以去除2216E液体培养基。按藻菌细胞密度比1:50的比例，向微型海链藻和微拟球藻培养液中分别加入不同的藻际细菌，每组设置三个平行，添加宁大三号海水培养基作为对照组。以微型海链藻和微拟球藻细胞密度为指标，分析各藻际细菌对微型海链藻和微拟球藻生长的影响。结果表明，分离自藻液的海杆菌对微型海链藻、微拟球藻的生长具有明显的促进作用。

本发明筛选的共生菌株的鉴定主要涉及以下几个步骤：菌液PCR 扩增、凝胶电泳及PCR产物割胶回收、PCR产物连接T载体及感受态细胞的转化、阳性菌落鉴定及测序。最终对所测得的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)进行同源性比较与系统发育学分析。在NCBI上进行Blast比对，找到同源性序列并利用MEGA5软件建立系统发育树。根据Blast比对和系统发育学分析结果，本发明的藻际有益细菌菌株属于变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、海杆菌属(Marinobacter)中的一种。

该菌株生物学特性如下：杆状，菌落呈圆形，不透明米白色，表面湿润光滑，挑起呈粘稠状，革兰氏阴性菌(图1)。

实施例2：扩繁饵料微藻

首先制备藻菌扩培液，其组成如下：50-200mg/L KNO₃、5-20 mg/L KH₂PO1-5 mg/LFe-citrate·5H₂O、0.01-0.1g/L红糖、2-10μg/L VB₁、0.01-0.1μg/L VB₁₂。

一种藻菌扩培液的具体组成如下：

100mg/L KNO₃、10mg/L KH₂PO₄、3mg/L Fe-citrate·5H₂O、0.6 g/L红糖、6μg/LVB₁、0.05μg/L VB₁₂。

红糖可以选用市场中常用的品种。

藻菌扩培液的一种具体制备方法如下：

(1)准备50mL过滤海水(盐度25‰)，加入5mg KNO₃、0.5mg KH₂PO₄、0.15mg Fe-citrate·5H₂O灭菌后备用。

(2)取3g红糖于10mL纯水中溶解，过0.22μm滤膜后取10μL 加入上述50mL已灭菌溶液中。

(3)取240μLVB₁、1mLVB₁₂于8.76mL纯水中溶解，过0.22μm 滤膜后用无菌水稀释100倍，取50μL于上述50mL已灭菌溶液中。

以上三步即完成新型藻菌扩培液的制备。

将筛选的海杆菌在2216E固体平板上进行活化，挑取单克隆至1 mL 2216E液体培养基中，置于28℃，200rpm摇床中培养4～6h。将活化后的菌液进一步培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6。

在100mL玻璃锥形瓶中，加入50mL上述灭菌的新型藻菌扩培液，加入100μL OD₆₀₀＝0.4～0.6的活化后的海杆菌，接入1mL藻细胞密度为10⁶cell/mL的微型海链藻、微拟球藻藻种，混合均匀后，置于25℃、光强4000Lux、光照周期光/暗(12h/12h)的光照培养箱中培养。共培养时间为10天，每两天通过检测藻细胞叶绿素a的含量评估细菌对藻生长密度的影响(图2)。

在100mL玻璃锥形瓶中，分别使用本发明中的藻菌扩培液、本发明中的藻菌扩培液并添加非藻际分离的从海洋微生物菌种保藏管理中心(http://mccc.org.cn/)购买的海杆菌以及本发明中的藻菌扩培液并添加本发明中筛选的海杆菌进行培养，每一种培养液设三个平行，接种密度为2×10⁴cell/mL，每天用血球计数板对培养密度进行计数。培养结果表明，假微型海链藻、微拟球藻在本发明中的藻菌扩培液并添加本发明中筛选的海杆菌组中，藻细胞的叶绿素a含量从共培养的第4天开始均显著高于对照组，共培养的第十天叶绿素a含量约达到对照组的两倍，说明本发明中筛选的海杆菌促进假微型海链藻和微拟球藻扩繁的效果随培养时间的延长而更显著。

此外，在共培养的第十天，添加本发明中筛选的海杆菌组仍始终维持高密度培养(图2)。另外，海杆菌在本发明的藻菌扩培液中最高细胞培养密度可以达到100x10⁷，而在常规NMB3培养基中细菌细胞密度只能维持在15x10⁷左右(图3)。

综上，本发明提供的培养方法扩培微藻效果明显优于常规微藻培养方法。因此，本发明培养方法具有很好的应用前景。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种促进饵料微藻扩繁的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 海杆菌(Marinobacter sp.)

<400> 1

cttgcatgcc tgcaggtcga cgattagagt ttgatcatgg ctcagattga acgctggcgg 60

caggcttaac acatgcaagt cgagcggtaa cagggggtgc ttgcaccccg ctgacgagcg 120

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cgtagctggt ctgagaggat gatcagccac atcgggactg agacacggcc cgaactccta 360

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gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgcagaga 1020

actttccaga gatggattgg tgccttcggg aactctgaca caggtgctgc atggccgtcg 1080

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc ctatccctag 1140

ttgctagcag ttcggctgag aactctaggg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1200

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gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgt gaatcagaat 1380

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tgcaccagaa gtggttagtc taaccttcgg gaggacgatc accacggtgt ggttcatgac 1500

tggggtgaag tcgtaacaag gtaaccgtaa atctctagag gatccccggg taccgagctc 1560

gaatcg 1566

Claims (5)

1.一种饵料微藻扩繁的方法，其特征在于，所述的方法是在饵料微藻培养的过程中添加从饵料微藻中筛选的藻际有益细菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻际有益细菌是保藏编号为CCTCC M20200448的海杆菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饵料微藻为假微型海链藻或微拟球藻。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法，其中使用的培养液的组成配比如下：

50-200mg/L KNO₃、5-20mg/L KH₂PO₄、1-5mg/L Fe-citrate·5H₂O、0.06-0.6g/L红糖、2-10μg/L VB₁、0.01-0.1μg/L VB₁₂。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法，其中使用的培养液的组成配比如下：

100mg/L KNO₃、10mg/L KH₂PO₄、3mg/L Fe-citrate·5H₂O、0.6g/L红糖、6μg/L VB₁、0.05μg/L VB₁₂。

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