KR101972494B1 - 셀레늄 저항성 신규 미세조류 - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류 및 그의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 상기 미세조류를 이용하여 셀레늄 함유 배양체를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

셀레늄 저항성 신규 미세조류{NOVERL MICROALGAE HAVING RESISTANCE AGAINST SELENIUM}

본 발명은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류 및 상기 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.

셀레늄은 동물의 생체 내에서 작용하는 여러 효소에 함유되는 필수 미량 성분이다. 셀레늄은 강력한 항산화력으로 세포막 손상을 일으키는 과산화수소와 같은 활성산소를 제거하여 신체 조직의 노화 및 변성을 막거나 그 속도를 지연시킨다. 셀레늄을 함유하는 글루타티온퍼옥시다아제는 세포의 과산화물 또는 활성산소 종의 소거에 작용하는 글루타티온에 대해 촉매로 작용한다.

셀레늄은 자연에서 유기 또는 무기 형태로 발견된다. 무기 셀레늄은소듐셀레나이트와 같은 염으로 대부분의 동물에게 독성을 나타낸다. 유기 셀레늄의 주요 공급원인 L-셀레노메티오닌은 인간을 포함한 동물에서 음식물을 통해 수득될 수 있다. 유기 셀레늄을 수득하기 위한 방법 중 하나는 무기 셀레늄을 이용하여 미생물에 유기 셀레늄을 강화하는 것으로, 효모와 세균이 셀레늄 강화 미생물로 제조된 바 있다.

미세조류(microalgae)인 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)는 독특한 색상과 냄새를 지니며, 세포 분열 속도가 매우 빠르다. 현재 미세조류의 지질 함량을 증가시키거나, 미세조류를 이용하여 축산폐수를 처리하거나 또는 방사성 핵종을 제거하는 등의 연구가 보고되어 있다. 본 발명자들은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류를 발견하고, 이의 셀레늄 함량을 증가시키는 방법을 개발하였다.

본 발명은 셀레늄에 대한 저항성을 갖는 신규한 미세조류 및 셀레늄 함유 미세조류의 생산방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 수탁번호가 KCTC 13228BP인 신규 클로렐라 소로키니아나균주를 제공한다. 또한, 수탁번호가 KCTC 13229BP인 신규 클로렐라 소로키니아나균주를 제공한다.

수탁번호가 KCTC 13228BP인 클로렐라 소로키니아나균주 또는 수탁번호가 KCTC 13229BP인 클로렐라 소로키니아나균주를셀레늄염이 첨가된 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "배양"은, 인공적으로 조절된 환경조건하에서 미생물을 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. 상기 클로렐라 균주를 배양하는 방법은 당해 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 배양은 화학종속영양(chemo-heterotrophic) 배양일 수 있다. 용어 "화학종속영양" 배양은 광의 부재하에 유기 탄소 공급원 및/또는 무기 또는 유기 질소 공급원의 존재하에 배양하는 것을 의미한다.

상기 방법에서, 상기 셀레늄염은 소듐셀레나이트(sodium selenite)일 수 있다. 상기 셀레늄염은 통상의 기술자에 의해 적절한 농도로 첨가될 수 있다. 예를 들면, 상기 셀레늄염은 1 μM 내지 300 μM, 100 μM 내지 300 μM, 200 μM 내지 300 μM, 1 μM 내지 100 μM, 1 μM 내지 70 μM, 1 μM 내지 60 μM, 또는 1 μM 내지 50 μM의 농도로 배양액에 첨가될 수 있다. 상기 셀레늄염은 단회 첨가 또는 2회 이상 분할 첨가될 수 있다.

상기 방법에서 배양 온도는 20℃ 내지 40℃ 또는 25℃ 내지 35℃일 수 있다. 상기 방법에서 배양 pH는 5 내지 8, 5.5 내지 8, 또는 6 내지 8일 수 있다. 상기 방법에서 배양액에 산소 또는 산소 함유 기체가 도입될 수 있다. 상기 방법에서 배양은 교반기에 의한 교반과 함께 이루어질 수 있다.

상기 방법에서 배양 시간은 상기 균주의 접종 후 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 또는 24시간 내지 36시간일 수 있다. 상기 방법에서 셀레늄염은 상기 균주의 접종 후 24시간 내지 48시간 차에 첨가될 수 있다. 상기 셀레늄염은 상기 균주의 접종 후 24시간 내지 48시간 차에 단회로 또는 2회 이상 분할하여 첨가될 수 있다.

상기 방법에서 첨가되는 셀레늄염의 농도 및 배양 시간은 배양 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 방법을 통해 셀레늄 함유 클로렐라를 살아있는 상태로 얻고자 할 경우, 첨가되는 셀레늄염의 농도는 1 μM 내지 60 μM 또는 1 μM 내지 50 μM일 수 있다. 또는, 첨가되는 셀레늄염의 농도가 60 μM 내지 300 μM일 경우, 배양 시간은 셀레늄염의 첨가 후 48시간 이하, 36시간 이하, 24시간 이하, 12시간 이하, 또는 6시간 이하일 수 있다.

상기 방법에서 배양액은 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 칼륨 공급원 및 인 공급원 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 마그네슘, 칼슘, 철, 및 미량 원소 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양액은 글루코스, NaCl, 및 효모 추출물(yeast extract)을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 펩톤을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 셀레늄 저항성 신규 미세조류를 이용하면, 셀레늄 함유 배양체를 대량으로 생산할 수 있다.

도 1은 수집된 미세조류의 염기서열을 이용한 계통학적 분류 결과를 나타낸다.
도 2a는 HNU-NDG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다.
도 2b는 HNU-GSG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다.
도 3은 MAE 배지 상에서 HNU-NDG1 균주의 doubling time 분석 결과를 나타낸다.
도 4a는 아셀렌산나트륨 분할처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다.
도 4b는 아셀렌산나트륨 단독처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1에서 아셀렌산나트륨의 처리에 따른 유기태 셀레늄의 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다.

실시예 1: 클로렐라 소로키니아나 균주의 동정 및 서열 분석

1.1. 미세조류의 수집 및 특성 분석

충청도 및 전남 순천에서 7종의 미세조류를 수집하였다. 모두 녹색의 구형 균주이고 YEP 영양배지 상에서 높은 성장률을 나타내었다. 수집된 7종의 미세조류를 대상으로 소듐셀레나이트(sodium selenite)에 대한 최소 억제 농도(minimal inhibition concentration: MIC)를 측정하였다. HNU-NDG1 및 HNU-GSG1를 포함한 6종의 조류가 최대 40 ppm의 높은 저항성을 나타내었다. 또한, 수집된 미세조류 및 시판 미세조류를 대상으로 소듐셀레나이트를농도별 처리한 후 Chlorophyll a 함량을 측정하여 생존 저해능을 평가하였다. 그 결과, HNU-NDG1 및 HNU-GSG1를 포함한 5종 및 시판 미세조류가 소듐셀레나이트에 대하여 40 ppm의 높은 저항성을 나타내었다.

HNU-NDG1 균주는 충청남도 홍성군 서부면 남당리에 위치한 어사리선착장 인근의 해수로부터 수집된 균주이다. HNU-GSG1 균주는 충청북도 괴산군 사리면 이곡리에 소재하고 있는 이곡저수지의 담수로부터 수집된 균주이다. 두 균주는 YEP 영양배지 상에서 가장 높은 성장률을 나타내었다.

도 1은 수집된 미세조류의 염기서열을 이용한 계통학적 분류 결과를 나타낸다. 각 미세조류의 18S rRNA 서열을 이용하여 Jukes-Cantor 모델을 적용한 Neighbour-joining 방법에 따라 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 수집된 균주들은 모두 클로렐라 소로키나아나(Chlorella sorokiniana)에 속하는 것으로 확인되었다.

이 중, 클로렐라 소로키나아나 HNU-NDG1 균주를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2017년 3월 21일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13229BP를 부여받았다. 또한, 클로렐라 소로키나아나 HNU-GSG1 균주를 한국생명공학연구원에 2017년 3월 21일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13228BP를 부여받았다.

1.2. 클로렐라 소로키니아나 균주의 서열 분석

상기 수집된 균주의 게놈 DNA를 분리하고 18S rRNA에 대한 염기서열을 수득하였다. NCBI의 BLAST tool을 이용하여 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 18s rRNA의 서열 및 HNU-GSG1의 18s rRNA의 서열을 각각 기존에 알려진 서열과 비교하였다.

도 2a는 HNU-NDG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다. HNU-NDG1의 18S rRNA 서열 분석 결과, 높은 상동성을 나타내는 서열로 클로렐라 소로키니아나 표준 균주(type strain)의 18S rRNA 서열이 확인되었으나 이 서열은 HNU-NDG1의 18S rRNA 서열과 동일하지는 않았다. 따라서, HNU-NDG1은 기존에 알려진 클로렐라 종과 유전적으로 상이한 균주인 것으로 확인되었다.

도 2b는 HNU-GSG1의 18S rRNA 서열과 기존 클로렐라 종의 서열 비교 결과를 나타낸다. HNU-GSG1의 18S rRNA 서열 분석 결과, 클로렐라 소로키니아나 표준 균주의 18S rRNA 서열과 90% 내지 95%의 상동성을 나타내었으나 이 서열은 HNU-GSG1의 18S rRNA 서열과 동일하지는 않았다. 따라서, HNU-GSG1 또한 기존에 알려진 클로렐라 종과 유전적으로 상이한 균주인 것으로 확인되었다.

실시예 2: 클로렐라 소로키니아나 HNU - NDG1 및 HNU - GSG1의 배양 실험

HNU-NDG1 균주를 대상으로 최적 암배양(chemo-heterotrophic culture)이 가능한 산업용 배양배지 조성에 관한 실험을 수행하였다. 하기 표 1과 같이 47종의 다양한 조성의 배지에 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1 배양액을 5% 접종 후 0.4 vvm, 130 rpm, pH 7.5, 및 30℃의 조건으로 72시간 동안 배양한 후 생균수 분석을 통하여 최적 배양용 배지 조성을 선정하였다.

그 결과, 5번 배지 조성에서 최적의 성장을 확인하고, 이를 MAE 배지(Micro-Algae Enrichment medium)로 명명하였다. 또한, 상기 MAE 배지 상에서 HNU-NDG1 및 HNU-GSG1 균주의 doubling time은 6.8시간으로 확인되었다.

도 3은 MAE 배지 상에서 HNU-NDG1 균주의 doubling time 분석 결과를 나타낸다.

실시예 3: 클로렐라 소로키니아나 HNU - NDG1 및 HNU - GSG1 의 유기성셀레늄 함량 분석

소듐셀레나이트의 처리 방식에 따른 유기성셀레늄 함량을 ICP/MS로 분석하여 확인하였다.

하기 표 2는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1을 이용한 유기태 셀레늄의 생산에 있어서 소듐셀레나이트의 처리 방법을 나타낸다. 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 소듐셀레나이트를 0.00211 mM, 0.26401 mM, 0.05280 mM, 및 0.07920 mM로 나누어 각각 단회 처리하거나 분할 처리하였다. 예비 실험에서 소듐셀레나이트에 의하여 조류의 성장이 억제되었기 때문에 고농도로 단회 처리하거나 고농도를 2회로 분할하여 처리하였다.

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 시료 1 내지 4는 분할 처리한 경우로, 클로렐라 소로키니아나의 접종 직후(0 hour), 배양 24시간 경과 후(24 hour), 소듐셀레나이트의 첨가 24시간 경과 후(48 hour), 및 소듐셀레나이트의 첨가 48시간 경과 후(72 hour)에 각각 시료를 채취하여 생균수 및 총균수를 측정하였다. 시료 5 내지 8은 단회 처리한 경우로, 클로렐라 소로키니아나의 접종 직후(0 hour), 배양 48시간 경과 후(48 hour), 및 소듐셀레나이트의 첨가 24시간 경과 후(72 hour)에 각각 시료를 채취하여 생균수 및 총균수를 측정하였다.

하기 표 3은 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1을 이용한 유기태 셀레늄의 생산에 있어서 소듐셀레나이트의 처리 방법에 따른 생균수 및 총균수를 나타낸다 (단위: log cells/㎖).

도 4a는 소듐셀레나이트 분할처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다. 도 4b는 소듐셀레나이트 단독처리 후 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1의 생균 분석 결과를 나타낸다.

소듐셀레나이트 분할 처리 결과 저농도인 0.00211 mM 및 0.05280 mM에서는 분할 및 단회 처리시에도 균체의 사멸이 크게 이루어지지 않았지만, 고농도인 0.26401 mM 및 0.07920 mM의 경우 처리 후 24시간 차에는 생존하였으나 48시간 경과 후 전 개체가 사멸하였다. 총균 분석 결과에서는 서로 유의적으로 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기 처리한 시료에 멸균 인산 완충 염수(PBS)를 이용한 원심 분리 및 세척을 5회 반복하여 균체외막에 잔존하는 소듐셀레나이트를 충분히 세척하였다. 이후 동결 건조하여 분말로 제조하였고, 제조 분말에 대하여 HPLC ICP/MS를 이용하여 체내 함유된 셀레늄을 분석하였다.

하기 표 4는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1에서 소듐셀레나이트의 처리에 따른 유기태 셀레늄의 분석 결과를 나타낸다.

도 5는 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1에서 소듐셀레나이트의 처리에 따른 유기태 셀레늄의 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 (a) 및 (b)는 각각 분할 처리 및 단회 처리를 나타낸다.

상기 표 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1을 이용한 소듐셀레나이트농도별 분할 및 단회 처리 샘플에 대한 셀레늄 분석 결과, 저농도인 0.002 mM 처리시 분할 처리가 단회 처리 대비 19% 함량이 증가함을 확인할 수 있었으며, 고농도인 0.266 mM 처리의 경우 분할 처리가 단회 처리 대비 31% 증가함을 확인할 수 있었다.

또한, HNU-NDG1에 대하여 전술된 방법을 기반으로 클로렐라 소로키니아나 HNU-GSG1에 대해서도 아셀렌나트륨의 처리에 따른 유기성셀레늄 함량을 분석하였다. HNU-GSG1의 경우, HNU-NDG1에 비하여 소듐셀레나이트에 대한 감수성이 예민하게 나타나 소듐셀레나이트의 처리 농도 0.23 mM을 단회 및 분할 처리하였고, 그 외 실험 방법은 NDG1과 동일하게 진행하였다. 분할 처리시 균 체내 유기태 셀레늄 함량은 8.60 mM로 확인되고 단독 처리의 경우 4.98 mM로 확인되어, 분할 처리가 단회 처리에 비하여 유기태 셀레늄 함량을 높이는데 유리한 것으로 평가되었다.

이로부터 고농도의 소듐셀레나이트가 처리되면 미세조류 클로렐라 소로키니아나 HNU-NDG1 및 HNU-GSG1의 성장을 억제하게 되어 체내 흡수가 되지 않지만, 저농도로 분할 처리하면 생존에 영향을 주지 않고 흡수율을 향상시킬 수 있는 것으로 사료된다.

한국생명공학연구원 KCTC13228BP 20170321 한국생명공학연구원 KCTC13229BP 20170321

Claims (9)

1. 수탁번호가 KCTC 13228BP인 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 균주.
   
2. 수탁번호가 KCTC 13229BP인 신규 클로렐라 소로키니아나균주.
   
3. 수탁번호가 KCTC 13228BP인 클로렐라 소로키니아나균주 또는 수탁번호가 KCTC 13229BP인 클로렐라 소로키니아나균주를 셀레늄염이 첨가된 글루코스, NaCl, 효모 추출물(Yeast extract) 및 펩톤을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 배양은 화학종속영양(chemo-heterotrophic) 배양인 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 셀레늄염은 소듐셀레나이트인 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 셀레늄염은 1 μM 내지 300 μM 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
   
7. 제3항에 있어서,
   상기 셀레늄염은 단회 첨가 또는 2회 이상 분할 첨가되는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
   
8. 제3항에 있어서,
   상기 배양은 셀레늄염의 첨가 후 48시간 이하로 이루어지는 것을 특징으로 하는 셀레늄 함유 클로렐라의 생산방법.
   
9. 삭제

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