CN108587914B - 一种分离纯化雨生红球藻藻种的方法 - Google Patents

一种分离纯化雨生红球藻藻种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离纯化雨生红球藻藻种的方法，其通过选取含有雨生红球藻细胞的水样或含有杂菌的单种雨生红球藻藻液，加入适合雨生红球藻生长的无机培养基，在诱导培养处理后，静置，收集培养容器底部的细胞；将收集的藻细胞复溶解于配置好的无菌氯化钠溶液中，静置后，去掉上清液，收集底部细胞；将底部细胞溶解于含有抗生素的培养基中处理一定时间，静置，沉降；去掉上清液后，复溶于无菌培养基中，并稀释成一定浓度；将稀释液接入培养孔板中培养；通过镜检和菌类检测，选出纯化的藻株。通过本发明提供的方法，能够在短时间内得到纯度较高的藻种，缩短生长周期，提高大规模生长的成功几率。

Description

一种分离纯化雨生红球藻藻种的方法
技术领域
本发明涉及微藻藻种纯化技术领域，尤其涉及一种分离纯化雨生红球藻藻种的方法。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科，是一种淡水生双鞭毛单细胞绿藻。在整个生命周期中出现四种典型的细胞形态：小虫体、长有鞭毛的大虫体、没有运动能力的胶鞘体、带有坚硬细胞壁的红色大细胞——红孢囊(Haematocysts)。在有充足营养的清洁环境中，大虫体占主导地位；一旦环境恶化就会转化为胶鞘体，之后转化为红孢囊。红孢囊形成后，细胞密度急剧增大(我们的研究发现其密度可高达1.04-1.08g/cm3，而其余细胞密度通常不高于1.02g/cm3)，且对外界不利条件的抵抗能力随之增强。随后，当周围的环境又变得营养充足适宜的时候，红孢囊变成可运动的小虫体，这些小虫体长成胶鞘体或者大虫体。
雨生红球藻在多种胁迫条件下能够迅速合成并大量积累虾青素，其积累量远远高于从水产品废弃物中提取和利用红发夫酵母发酵生产虾青素的产量，因此被公认是目前自然界中生产天然虾青素最理想的工具。与螺旋藻、小球藻等人类常用保健的微藻相比，雨生红球藻有着更加令人惊异的抗氧化作用，同时也有着更加高难度的养殖与保存技术。
培养时，不管是利用光生物反应器进行自养培养还是利用发酵罐进行异养培养，都要求藻种为纯种藻株。目前报道的藻种纯化方法主要有显微镜挑取藻细胞和藻液添加抗生素除菌，前者操作复杂，对操作人员的技术要求较高，需要一定的藻类分类经验，同时单个藻细胞的培养难度较大，不易成活；后者在藻液中直接加入抗生素，虽然能够有效的抑制藻液中杂菌，但是无法完全除菌还会影响藻类生长甚至诱导突变。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种适用于雨生红球藻藻种的快速、有效的获得纯种的方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种快速分离纯化雨生红球藻藻种的方法，其通过选取含有雨生红球藻细胞的水样或含有杂菌的单种雨生红球藻藻液，加入一定量合适雨生红球藻生长的无机培养基，在诱导培养一定时间后，静置，收集培养容器底部的细胞；将收集的藻细胞复溶解于一定浓度的无菌氯化钠溶液中，静置一定时间后，去掉上清液，收集底部细胞；将底部细胞溶解于含有抗生素的无菌水中处理一定时间，静置，沉降；去掉上清液后，复溶于无菌培养基中，并稀释成一定浓度；将稀释液接入培养孔板中培养一定时间；镜检和菌类检测，选出纯化的藻株。通过这种方式，在短时间内得到纯度较高的藻种，缩短生长周期，提高大规模生长的成功几率。
为实现上述目的，本发明提供了一种快速分离纯化雨生红球藻藻种的方法，包括以下步骤：
A、选取含有雨生红球藻细胞的水样或含有杂菌的单种藻液，加入配好的营养盐，经诱导培养后，静置，去掉上层液体，收集培养容器底部的藻细胞；
B、将收集得到的藻细胞复溶解于经配置的无菌氯化钠溶液中，经静置后，去掉上清液，收集底部细胞；
C、将底部细胞溶解于含有抗生素的培养基中处理，随后静置、沉降；
D、将经沉降的液体去掉上清液，然后用无菌培养基稀释；
E、将得到的稀释液接入培养孔板中培养；
F、通过镜检和菌类检测，选出纯化的藻株。
进一步地，步骤A中，营养盐不含N(氮)、P(磷)，营养盐包含：硫酸镁0.02g/L，氯化钙0 .01g/L，柠檬酸钠0 .1g/L，VB110μg/L，VB120 .1μg/L，氯化铁0 .588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L。
更进一步地，诱导培养的时间为8-72h。
优选地，诱导培养采用的条件为3000-20000lx的光照处理、0.5-1‰的高氯化钠处理或者28-35℃的温度处理。
进一步地，步骤B中，配置成的氯化钠溶液浓度为15-20‰；氯化钠溶液处理藻细胞的时间为15min-3h。
进一步地，步骤C中，采用的抗生素至少是2种，其中一种是制霉菌素，另外则是青霉素、链霉素、土霉素、氯霉素中的一种或几种；抗生素的使用浓度是通常用来除菌浓度的1-10倍，为50-500μg/mL；抗生素的处理时间为15min-3h。
进一步地，步骤D中，无菌培养基组成为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB110μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-103个大细胞/mL。
进一步地，步骤E中，取液体50-300μL，接种于96孔板中；在光强300-2000lx、温度23±2°C、光暗比L:D＝12h:12h的条件下，培养2-7d。
进一步地，步骤F中，将96孔板先培养1-2周，在接种于三角瓶扩大培养之前，先进行镜检和细菌检测，选出纯化的藻株。
本发明还优选了一种快速分离纯化雨生红球藻藻种的方法，包括以下步骤：
A、选取含有雨生红球藻细胞的水样或含有杂菌的单种藻液，加入配好的营养盐，经诱导培养后，静置，去掉上层液体，收集培养容器底部的藻细胞，其中，营养盐配方为：硫酸镁0 .02g/L，氯化钙0 .01g/L，柠檬酸钠0 .1g/L，VB110μg/L，VB120 .1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，诱导培养时间为24-48h，采用3000-5000lx的光强；
B、将收集得到的藻细胞复溶解于经配置的浓度为20‰的无菌氯化钠溶液中处理15min-1h，随后经静置后去掉上清液，收集底部细胞；
C、将底部细胞溶解于含有抗生素的培养基中，其中，抗生素使用浓度为通常除菌浓度的2-5倍，其中含有使用浓度20-250μg/mL的制霉菌素，其余成分的使用浓度为100-250μg/mL，使用抗生素处理1-3次，处理时间15min-1h，随后静置、沉降；
D、将经沉降的液体去掉上清液，然后用无菌培养基稀释，无菌培养基组成为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB110μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-100个/mL；
E、将得到的稀释液接入培养孔板中培养，其中，取样体积为50-100μL，光强为300-500lx；F、将培养孔板在光强300-2000lx、温度23±2°C、光暗比L:D＝12h:12h的条件下培养2-7d，然后通过镜检和菌类检测，选出纯化的藻株。
本发明所带来的有益技术效果为：
本发明利用雨生红球藻细胞在不利条件下迅速形成红孢囊细胞，细胞密度和体积增大，对外界不利条件抵抗力大大增强等特性，采用高光、高盐等不利条件，除掉或部分除掉样品中的杂藻或杂菌，挑选出密度和颜色都与其余藻有明显差异的雨生红球藻细胞；然后，利用短时间的抗生素处理、结合稀释等综合措施，可在1-2周左右的时间内得到纯度较高的藻种，远比平板划线等措施所需的2-3个月的时间要短；筛选过程中只在短时间内使用抗生素，不会出现因长期使用抗生素导致的藻种突变，便于维持藻种性状稳定。
本发明针对雨生红球藻藻种筛选时间长及传代过程及规模培养过程中极易染菌的问题，利用高光、高盐等不利条件结合短期内的抗生素处理、藻液稀释等综合措施，发明了一种成本低廉、操作简易的藻种纯化程序，从而达到快速获得雨生红球藻纯种、适应规模化雨生红球藻生产的目的。
与现有技术相比，本发明提供了一种高效、简易分离纯化裸藻藻种的方法，从而获得无细菌污染的雨生红球藻藻种，起到降低藻种维护成本和快速获得批量藻种的目的。
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
实施例1
自然水样。在野外取样，某水域中雨生红球藻细胞为优势种群，从该水域中取样500mL。
(1)回到实验室，将水样转入灭过菌的无菌水中，并加入以下营养盐成分：硫酸镁0.02g/L，氯化钙0.01g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB110μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；采用5000lx的光强，24h/d光照，通入含CO21％的混合气体(0.2vvm)进行培养，培养温度为23±2°C，培养时间为24h；培养结束，静置1h，小心去掉上清液，收集培养容器底部的藻液约10mL。
(2)将收集的藻液转入灭菌的15‰的氯化钠溶液中摇匀，静置30min，小心去掉上清液，收集底部的细胞。
(3)用无菌水清洗藻细胞1-2次；收集的藻细胞加入无菌水后，加入制霉菌素20μg/mL+青霉素50μg/mL，处理时间为1h，重复该步骤1次；用无菌水清洗藻细胞1-2次，收集藻液约1ml。
(4)用无菌培养基稀释藻液，培养基成分为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0 .2g/L，氯化钙0 .1g/L，柠檬酸钠0 .1g/L，VB110μg/L，VB120 .1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-100个大细胞/mL。
(5)取液体100μL，接种于96孔板中；在光强约300lx，温度23±2°C，光暗比L:D＝12h:12h，培养7d。
(6)镜检和细菌检测，挑选出无菌的藻株。结果显示，大多数的培养孔板中的藻株为纯种雨生红球藻藻株。
上述实验室内操作，接种处理操作都在超净工作台内进行。
通过上述步骤，从野外采集的水样中分离得到了纯种的裸藻藻株，总共用时约10d。
实施例2
自然水样。在野外取样，某水域中有雨生红球藻细胞，雨生红球藻细胞、某些绿藻和硅藻同为优势藻株，从该水域中取样500mL。(1)回到实验室，将水样转入灭过菌的无菌水中，并加入以下营养样成分：硫酸镁0.02g/L，氯化钙0.01g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB110μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，采用5000lx的光强，24h/d光照，通入含CO21％的混合气体(0.2vvm)进行培养，培养温度为23±2°C，培养时间为48h；培养结束，静置30min，小心去掉上清液，收集培养容器底部的藻液约10mL。
(2)将收集的藻液转入灭菌的20‰的氯化钠溶液中摇匀，静置30min，小心去掉上清液，收集底部的细胞，重复该步骤1次。
(3)用无菌水清洗藻细胞1-2次；收集的藻细胞加入无菌水后，加入制霉菌素50μg/mL+青霉素100μg/mL，处理时间为1h，重复该步骤1次；用无菌水清洗藻细胞1-2次，收集藻液约1ml。
(4)用无菌培养基稀释藻液，培养基成分为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0 .2g/L，氯化钙0 .1g/L，柠檬酸钠0 .1g/L，VB110μg/L，VB120 .1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-100个大细胞/mL。
(5)取液体100μL，接种于96孔板中；在光强约300lx，温度23±2°C，光暗比L:D＝12h:12h，培养7d。
(6)镜检和细菌检测，挑选出无菌的藻株。结果显示，大多数的培养孔板中的藻株为纯种雨生红球藻藻株。
上述实验室内操作，接种处理操作都在超净工作台内进行。
通过上述步骤，从野外采集的水样中分离除了纯种的裸藻藻株，总共用时约10d。
实施例3：
自然水样。在野外取样时发明，某水域中有雨生红球藻细胞，但优势藻种为其余绿藻和硅藻。从该水域中取样500mL。
(1)回到实验室，将水样转入灭过菌的无菌水中，并加入以下营养样成分：硫酸镁0.02g/L，氯化钙0.01g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB110μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；采用5000lx的光强，24h/d光照，通入含CO21％的混合气体(0.2vvm)进行培养，培养温度为23±2°C，培养时间为72h；培养结束，静置15min，小心去掉上清液，收集培养容器底部的藻液约10mL。
(2)将收集的藻液转入灭菌的20‰的氯化钠溶液中摇匀，静置15min，小心去掉上清液，收集底部的细胞，重复该步骤1次。
(3)用无菌水清洗藻细胞1-2次；收集的藻细胞加入无菌水后，加入制霉菌素100μg/mL+青霉素200μg/mL，处理时间为30min，重复该步骤1次；用无菌水清洗藻细胞1-2次，收集藻液约1ml。
(4)用无菌培养基稀释藻液，培养基成分为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0 .2g/L，氯化钙0 .1g/L，柠檬酸钠0 .1g/L，VB110μg/L，VB120 .1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-100个大细胞/mL。
(5)取液体100μL，接种于96孔板中；在光强约300lx，温度23±2°C，光暗比L:D＝12h:12h，培养7d。
(6)镜检和细菌检测，挑选出无菌的藻株。结果显示，大多数的培养孔板中的藻株为纯种雨生红球藻藻株。接种处理操作都在超净工作台内进行。
上述实验室内操作，通过上述步骤，从野外采集的水样中分离除了纯种的裸藻藻株，总共用时约10d。
实施例4：
本藻株来自于申请人保存的雨生红球藻藻株。镜检显示，该藻株为单一藻株；菌类检测结果表明，该藻有细菌污染。
(1)回到实验室，将水样转入灭过菌的无菌水中，并加入以下营养样成分：硫酸镁0.02g/L，氯化钙0.01g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB110μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；采用5000lx的光强，24h/d光照，通入含CO21％的混合气体(0.2vvm)进行培养，培养温度为23±2°C培养时间为8h；培养结束，静置15min，小心去掉上清液，收集培养容器底部的藻液约10mL。
(2)将收集的藻液转入灭菌的15‰的氯化钠溶液中摇匀，静置30min，小心去掉上清液，收集底部的细胞。
(3)用无菌水清洗藻细胞1-2次；收集的藻细胞加入无菌水后，加入制霉菌素250μg/mL+青霉素250μg/mL，处理时间为15min，重复该步骤1次；用无菌水清洗藻细胞1-2次，收集藻液约1ml。
(4)用无菌培养基稀释藻液，培养基成分为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0 .2g/L，氯化钙0 .1g/L，柠檬酸钠0 .1g/L，VB110μg/L，VB120 .1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-100个大细胞/mL。
(5)取液体100μL，接种于96孔板中；在光强约300lx，温度23±2，°C光暗比L:D＝12h:12h，培养7d。
(6)镜检和细菌检测，挑选出无菌的藻株。结果显示，大多数的培养孔板中的藻株为纯种雨生红球藻藻株。
上述实验室内操作，接种处理操作都在超净工作台内进行。
通过上述步骤，将试验室有细菌污染的雨生红球藻藻株进行了纯化，总共用时约9d。
通过以上实施例可以看到，通过本发明记载的方法，可在很短时间内得到纯度较高的藻种，远比平板划线等措施所需的2-3个月的时间要短；本发明针对雨生红球藻藻种的分离纯化，操作简易、成本低廉，达到快速获得雨生红球藻纯种、适应规模化雨生红球藻生产的目的。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种分离纯化雨生红球藻藻种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、选取含有雨生红球藻细胞的水样或含有杂菌的单种藻液，加入配好的营养盐，经诱
导培养后，静置，去掉上层液体，收集培养容器底部的藻细胞，步骤A中，营养盐不含N、P，营养盐：硫酸镁0.02g/L，氯化钙0.01g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB1 10μg/L，VB 12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，诱导培养的时间为24-72h，诱导培养采用的条件为5000lx的光照处理，24h/d光照，通入含CO21％的混合气体，0.2vvm，进行培养，培养温度为23±2℃；
B、将收集得到的藻细胞复溶解于经配置的无菌氯化钠溶液中，经静置后，去掉上清液，收集底部细胞；配置成的氯化钠溶液浓度为15-20‰；氯化钠溶液处理藻细胞的时间为15min-30min；
C、将底部细胞溶解于含有抗生素的培养基中处理，随后静置、沉降；采用的抗生素至少是2种，其中一种是制霉菌素，另外是青霉素、链霉素、土霉素、氯霉素中的一种或几种；抗生素的使用浓度为70-500μg/mL；抗生素的处理时间为15min-1h；
D、将经沉降的液体去掉上清液，然后用无菌培养基稀释；无菌培养基组成为：硝酸钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠0.1g/L，VB 1 10μg/L，VB 12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，红色细胞浓度为10-100个大细胞/mL；
E、将得到的稀释液接入培养孔板中培养；取液体50-100μL，接种于96孔板中；在光强300lx、温度23±2℃、光暗比L:D＝12h:12h的条件下，培养7d；
F、通过镜检和菌类检测，选出纯化的藻株。
2.如权利要求1所述的分离纯化雨生红球藻藻种的方法，其特征在于，步骤F中，将96孔板先培养1-2周，在接种于三角瓶扩大培养之前，先进行镜检和细菌检测，选出纯化的藻株。
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