KR102102241B1 - 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법 - Google Patents

유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류(algae)를 제공한다. 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류를 다당류 생산 생물로서 배양함으로써 다당류를 제조하는 다당류의 제조 방법을 제공한다. 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류를 배양함으로써, 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유기 화합물을 제조하는 유기 화합물의 제조 방법을 제공한다.

Description

유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법{EUGLENA SPP. MICROALGAE, POLYSACCHARIDE MANUFACTURING METHOD, AND ORGANIC COMPOUND MANUFACTURING METHOD}
본원은, 일본 특원 2013-067558호의 우선권을 주장하고, 상기 출원이 인용에 의해 본원 명세서의 기재에 원용된다.
본 발명은, 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
유글레나속 미세 조류는, 연두 벌레로도 칭해지며, 배양에 의해 파라밀론(paramylon) 등의 다당류 등을 생산하는 미생물로서 알려져 있다.
종래, 유글레나속 미세 조류로서는, 다양한 것이 알려져 있으며, 예를 들면, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) NIES-48주가 알려져 있다(특허 문헌 1).
이러한 유글레나속 미세 조류는, 배양에 의해, 파라밀론 등의 다당류를 생산하고, 세포 내에 상기 다당류를 축적한다.
또한, 이러한 유글레나속 미세 조류는, 배양 조건에 따라, 축적된 다당류를 왁스 에스테르로 변환하거나, 다당류를 생산하면서 단백질도 생산할 수 있다. 그리고, 생산된 상기 미세 조류의 세포 내에 축적된 다당류, 지질, 단백질 등의 유기 화합물은, 연료나 식품 등의 용도에서 이용될 수 있다.
그러나, 이러한 유글레나속 미세 조류는, 다당류 등의 유기 화합물을 생산하는 성능이 반드시 충분하지 않은 과제가 있다.
일본공개특허 평07-070207호 공보
본 발명은, 상기한 과제 등을 감안하여, 적어도 다당류를 충분히 생산할 수 있는 유글레나속 미세 조류를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 다당류를 충분히 얻을 수 있는 다당류의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유기 화합물을 충분히 얻을 수 있는 유기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에 따른 유글레나속 미세 조류는, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 다당류의 제조 방법은, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류를 다당류 생산 생물로서 배양함으로써 다당류를 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다당류의 제조 방법의 일태양으로서, 상기 배양에서 사용되는 배양액이, 글루코오스를 15∼30 g/L 포함하는 태양을 채용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다당류의 제조 방법의 다른 태양으로서, 상기 배양에서 사용되는 배양액이, 효모 분해물을 포함하는 태양을 채용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다당류의 제조 방법의 다른 태양으로서, 상기 배양에서 사용되는 배양액이, AF6 배지의 조성을 가지는 태양을 채용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다당류의 제조 방법의 다른 태양으로서, 상기 다당류가 파라밀론인 태양을 채용할 수 있다.
본 발명에 따른 유기 화합물의 제조 방법은, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류를 배양함으로써, 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유기 화합물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)의 18S rRNA 유전자 염기 서열을 비교한 표이다.
도 2는 18S rRNA 유전자를 사용하여 작성한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.
도 3a는 RAPD 해석의 밴드 패턴을 나타내는 사진이다.
도 3b는 RAPD 해석의 밴드 패턴을 나타내는 사진이다.
도 3c는 RAPD 해석의 밴드 패턴을 나타내는 사진이다.
도 4는 종속영양 배양에서의 미세 조류의 글루코오스 전환율 및 미세 조류의 건조 중량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 광 종속영양 배양에서의 미세 조류의 배양 기간과 미세 조류의 건조 중량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 pH 조건이 상이한 각각의 배지에서 광 종속영양 배양했을 때의 미세 조류의 배양 기간과 미세 조류의 건조 중량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 pH 조건이 상이한 각각의 배지에서 광 종속영양 배양했을 때의 미세 조류의 배양 기간과 미세 조류의 건조 중량을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 광 종속영양 배양에서 호기 조건으로부터 혐기 조건으로 이행(移行)했을 때의 미세 조류의 배양 기간과 세포당의 파라밀론 함유율을 나타낸 그래프이다.
도 8b는 광 종속영양 배양에서 호기 조건으로부터 혐기 조건으로 이행했을 때의 미세 조류의 배양 기간과 배양액당의 파라밀론량을 나타낸 그래프이다.
도 9a는 광 종속영양 배양에 있어서 호기 조건으로부터 혐기 조건으로 이행했을 때의 미세 조류의 배양 기간과 세포당의 지질 함유율을 나타낸 그래프이다.
도 9b는 광 종속영양 배양에 있어서 호기 조건으로부터 혐기 조건으로 이행했을 때의 미세 조류의 배양 기간과 배양액당의 지질량을 나타낸 그래프이다.
이하에서, 본 발명에 따른 유글레나속 미세 조류의 일실시형태에 대하여 상세하게 설명한다.
본 실시형태의 유글레나속 미세 조류는, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530) 또는 그 변이주인, 적어도 다당류의 생산능을 가지는 것이다(이하, 간단히 유글레나속 미세 조류, 또는 미세 조류라고도 함).
본 실시형태의 유글레나속 미세 조류는, 적어도 다당류를 충분히 생산할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
상기 유글레나속 미세 조류는, 수중을 부유하면서 서식하는 생물이다. 또한, 상기 유글레나속 미세 조류는, 단세포성이며, 주에 따라 약간 다르지만 크기가 대략 10㎛에서 50㎛의 미소한 조류이다.
상기 유글레나속 미세 조류의 성질을 이하에서 상세하게 나타낸다.
(유글레나속 미세 조류의 형태적 성질)
상기 유글레나속 미세 조류의 영양형 세포는, 편모를 가지고, 활발하게 운동한다. 또한, 세포의 형상은, 대체로 방추형(紡錘形)이다. 세포 내에는, 핵, 엽록체, 미토콘드리아 등의 일반적인 오르가넬라(organelle)에 더하여 안점(眼點)이라고 하는 적색의 소기관을 가진다.
(유글레나속 미세 조류의 생리학적 또는 생화학적 성질)
(1) 배지: 주로 담수(淡水)로 이루어지는 배양액 중에서 증식할 수 있다(폐수 유래의 유기물을 이용해도 증식 가능).
(2) 광합성능: 광합성에 의한 광 독립영양 증식을 할 수 있다.
(3) 함유 색소: 클로로필 a, 클로로필 b, 및 다른 카로테노이드류를 포함한다.
(4) 동화 축적 물질: 단백질, 지질(왁스 에스테르), 다당류(파라밀론).
(5) 증식 온도역: 15℃∼35℃(최적 온도 25℃).
(6) 적절한 증식 pH역: pH 3.5∼5.5(단, 좌기 pH 범위 외에서도 증식 가능)
(유글레나속 미세 조류의 유전자 정보)
상기 유글레나속 미세 조류는, 서열 번호 1로 표시되는 18S rDNA(18S rRNA 유전자)를 가진다.
그리고, 18S rRNA 유전자의 해석은, 미세 조류의 확인 방법으로서 상용(常用)되고 있는 방법에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 18S rRNA 유전자의 해석은, 예를 들면, 실시예에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다.
상기 유글레나속 미세 조류의 18S rRNA 유전자에서의 염기 서열은, BLAST 상동성(homology) 검색을 사용하여, GenBank로부터 얻은 기지(旣知)의 유글레나속 미세 조류의 18S rRNA 유전자의 염기 서열과 비교할 수 있다. 기지의 유글레나속 미세 조류와의 배열 상동성의 일치의 정도를 비교한 결과는, 후술하는 실시예에서 나타낸다.
그리고, 데이터베이스로서는 EMBL, DDBJ 등을 사용할 수도 있다.
또한, 분자 계통수 작성 소프트웨어 Mega5 프로그램(Tamura 등. 2011, Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739)을 사용하여, 최우법에 의해 분자 계통수를 작성할 수 있다. 작성한 분자 계통수에 대해서는, 후술하는 실시예에서 상세하게 나타낸다.
상기한 방법에 의해, 후술하는 실시예의 결과로부터, 상기 유글레나속 미세 조류는, Euglena gracilis로 동정되어, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주로 명명되었다.
상기 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주는, 2013년 6월 28일자(원기탁일 2013년 3월 25일)로 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터(NITE-IPOD(우편 번호 292-0818 일본 지바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 120호실)에 부다페스트 조약의 규정 하에서, 수탁 번호 FERM BP-11530로서 국제 기탁되어 있다.
전술한 바와 같이, 상기 유글레나속 미세 조류는, 세포 내에 엽록체를 가지므로, 광합성에 의해 증식할 수 있다. 즉, 상기 유글레나속 미세 조류는, 광 독립영양 생물이다.
또한, 상기 유글레나속 미세 조류는, 포도당 등의 유기 영양소를 영양소로서 이용해도 증식할 수 있다. 즉, 상기 유글레나속 미세 조류는, 종속영양 생물이기도 하다.
이와 같이, 상기 유글레나속 미세 조류는, 광 독립영양에만 의해서도 증식하고, 종속영양에만 의해서도 증식하여, 광 독립영양 및 종속영양을 동시에 행해도 증식할 수 있다.
상기 변이주는, 예를 들면, 일반적인 돌연변이 처리를 행하는 것, 또는 계대 배양에 의한 적응 또는 자연 변이에 의해 제작된다.
상기 돌연변이 처리는, 일반적인 변이원을 사용하여 행할 수 있다. 변이원으로서는, 예를 들면, 변이원 작용을 가지는 약제, 자외선 등이 있다. 변이원 작용을 가지는 약제로서는, 예를 들면, 스트렙토마이신, 오플록사신, 에틸메탄술포네이트, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 브로모우라실 등의 뉴클레오티드 염기 유사체, 또는 아크리딘류 등이 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 다당류의 제조 방법의 일실시형태에 대하여 설명한다.
본 실시형태의 다당류의 제조 방법은, 상기 유글레나속 미세 조류를 배양함으로써, 적어도 다당류를 제조하는 것이다.
본 실시형태의 다당류의 제조 방법은, 다당류를 충분히 얻을 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
상세하게는, 본 실시형태의 다당류의 제조 방법은, 적어도 물을 포함하는 배양액 중에서, 상기 유글레나속 미세 조류를 배양하는 배양 공정을 포함한다.
상기 배양액으로서는, 미세 조류의 증식을 촉진하는 영양소와 물을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 영양소로서는, 무기 영양소, 또는 유기 영양소 등을 예로 들 수 있다.
상기 무기 영양소로서는, 예를 들면, 질소 함유 무기 화합물, 인 함유 무기 화합물 등이 있다. 또한, 상기 무기 영양소로서는, 예를 들면, 칼륨 이온, 철 이온, 망간 이온, 코발트 이온, 아연 이온, 동 이온, 몰리브덴 이온, 니켈 이온 등이 있다.
상기 무기 영양소의 배양액에서의 농도는, 통상, 일반적으로 알려져 있는 정도의 농도이다.
상기 유기 영양소로서는, 예를 들면, 포도당(글루코오스), 과당(프룩토오스) 등의 단당류, 비타민 B6, B12 등의 비타민류, 아르기닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 히스티딘 등의 아미노산, 말산, 시트르산, 숙신산, 아세트산 등의 유기산, 에탄올 등의 알코올류 등이 있다.
상기 배양액의 조성으로서는, 예를 들면, 후술하는 「AF-6 배지」의 조성, 「Cramer-Myers 배지」의 조성, 「Hutner 배지」의 조성, 또는 이들 조성과 유사한 조성 등이 채용된다.
상기 배양 공정에 있어서는, 배양액이, 탄소원으로서의 글루코오스를 15∼30 g/L 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 배양액이, 효모 분해물(후술함)을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 배양액이, AF6 배지의 조성을 가지는 것이 바람직하다.
상기 배양 공정은, 예를 들면, 상기한 배양액과 미세 조류가 혼합된 것을 수용하는 조내(槽內) 등에서 실시할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류에 광을 조사함으로써, 미세 조류에 광합성을 시킬 수 있다. 즉, 상기 배양 공정에 있어서는, 광 독립영양 배양을 행할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서 미세 조류에 광을 조사하면, 미세 조류는, 광합성에 의해 이산화 탄소를 세포 내에 받아들이고, 적어도 파라밀론 등의 다당류를 생산하면서 증식할 수 있다. 또한, 미세 조류는, 단백질, 및 지질, 색소나 비타민류 등의 2차 대사물 등을 생산하면서 증식할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서 미세 조류에 조사되는 광은, 미세 조류에 광합성을시키는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 광으로서는, 예를 들면, 태양으로부터의 자연광, 또는 조명으로부터의 광 등의 인공광 등이 채용된다.
상기 광 독립영양 배양 공정에 있어서 조사하는 광의 강도는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상, 50㎛ol/m2·s∼200㎛ol/m2·s이다.
상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류에 광을 조사하는 기간과 미세 조류에 광을 조사하지 않는 기간을 교호적(交互的)으로 반복할 수 있다.
즉, 상기 배양 공정에 있어서는, 광 독립영양 배양을 행하는 기간과 광 독립영양 배양을 행하지 않는 기간을 교호적으로 반복할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서 광을 조사하는 기간은, 통상, 일광이 나오는 낮 시간에 상당하는 8시간∼15시간이다. 또한, 미세 조류의 광합성을 억제하기 위해 광을 조사하지 않는 암 조건의 기간은, 통상, 일광이 나오지 않는 밤 시간에 상당하는 9시간∼16시간이다. 이들 기간은, 상황이나 목적에 따라 변화시킬 수 있다.
그리고, 광을 조사하지 않는 암 조건하란, 광합성 광량자속밀도(PPFD)가 50㎛ol/m2·s 이하의 조건 하이다.
한편, 상기 배양 공정에 있어서는, 전술한 영양소 중 유기 영양소의 존재 하에서 미세 조류를 배양하는 종속영양 배양을 행할 수도 있다. 상기 배양 공정에 있어서 유기 영양소의 존재 하에서 미세 조류를 배양하면, 미세 조류는, 유기 영양소를 세포 내에 받아들이고, 적어도 파라밀론 등의 다당류를 생산하면서 증식할 수 있다.
즉, 상기 배양 공정에 있어서는, 광 독립영양 배양, 및 종속영양 배양 중 적어도 한쪽을 행할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류의 증식을 더욱 촉진할 수 있는 점에서, 광 독립영양 배양, 및 종속영양 배양의 양쪽을 동시에 행하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 배양 공정에 있어서는, 광 종속영양 배양을 행하는 것이 바람직하다.
상기 종속영양 배양이나 광 종속영양 배양에서 사용하는 유기 영양소로서는, 상기 유글레나속 미세 조류를 이용할 수 있는, 에탄올 등의 알코올, 포도당이나 과당 등의 단당류 등, 또는 이들 성분을 함유하는 폐기물 등이 채용되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 유글레나속 미세 조류의 증식을 더욱 확실하게 촉진할 수 있는 점에서, 유기 영양소로서 효모 또는 효모 분해물(이하, 효모 엑기스라고도 함)이 병용되는 것이 바람직하다.
그리고, 전술한 각 유기 영양소 중 적어도 일부를 포함하는 것으로서, 양조주, 증류주, 청주박, 소주박, 당밀, 폐당밀 등을 예로 들 수 있다. 그리고, 이들 주류 등은, 유기 영양소의 공급원으로서 종속영양 배양이나 광 종속영양 배양에 있어서 사용될 수 있다.
상기 양조주는, 당분을 포함하는 원료를 효모에 의해 알코올 발효시켜 만들어진 것이며, 증류 처리가 행해져 있지 않은 것이다.
상기 양조주는, 증류 처리를 행하지 않고, 효모에 의한 알코올 발효 대사물을 포함하고 있으므로, 에탄올, 물 이외에, 효모가 생산한 포도당(글루코오스) 등의 당류, 단백질, 아미노산, 비타민, 인, 칼륨 등의 영양소를 포함하고 있다.
상기 양조주로서는, 맥주, 청주, 와인, 곡물을 원료로 한 양조주, 콩을 원료로 한 양조주, 고구마를 원료로 한 양조주, 또는 당을 원료로 한 양조주 등을 예로 들 수 있다.
상기 맥주는, 적어도 맥아에 포함되는 전분을 맥아 내의 효소에 의해 당화 시켜 당분을 생산시키고, 또한 이 당분을 맥주 효모에 의해 알코올 발효시켜 만들어진 것이다. 즉, 원료로서 적어도 맥아를 사용하여 상기한 바와 같이 만들어진 것이면, 다른 원료를 더 사용한 것이라도, 본 명세서에서의 맥주에 포함된다.
상기 맥아로서는, 통상, 보리의 맥아가 사용된다.
상기 청주(일본술)는, 쌀에 포함되는 전분을 누룩에 의해 당화시켜 당분을 생산시키고, 또한 이 당분을 효모에 의해 알코올 발효시켜 만들어진 것이다.
상기 와인은, 적어도 포도 과즙을 효모에 의해 알코올 발효시켜 만들어진 것이다.
상기 효모로서는, 예를 들면, 삭카로마이세스(Saccharomyces)속에 속하는 것이 있으며, 구체적으로는, Saccharomyces cerevisiae 등을 예로 들 수 있다.
또한, 상기 효모로서는, 예를 들면, 이른바 청주 효모, 이른바 와인 효모, 또는 이른바 맥주 효모 등이 있다.
상기 효모 분해물(효모 엑기스)으로서는, 상기 효모가 자기 소화함으로써 생기는 효모 자기 소화물, 효모를 열수와 접촉시켜 세포벽을 파괴한 것, 또는 효소에 의해 효모의 세포벽을 파괴한 것 등을 예로 들 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류의 산소 호흡을 유지시키기 위하여, 산소를 포함하는 가스를 배양액에 공급할 수 있다. 또한, 상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류의 광합성을 촉진하기 위해, 이산화탄소를 포함하는 가스를 배양액에 공급할 수 있다.
이러한 가스의 공급은, 배양액을 폭기(曝氣)하는 것, 배양액을 교반하는 것 등에 의해 행할 수 있다.
구체적으로는, 상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류에 호흡용 산소를 공급하기 위하여, 예를 들면, 공기에 의해 배양액을 폭기할 수 있다. 또한, 상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류의 광합성을 촉진시키기 위하여, 예를 들면, 이산화탄소를 비교적 많이 포함하는 배기 가스 등에 의해 배양액을 폭기할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 폭기 등에 의해 배양액 중에 산소 및 이산화탄소를 공급하면서, 광 독립영양 배양 및 종속영양 배양을 동시에 행하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 배양 공정에 있어서는, 미세 조류의 산소 호흡 및 광합성을 촉진시키기 위해, 산소 및 이산화탄소의 양쪽을 포함하는 가스를 폭기 등에 의해 배양액에 공급하면서, 유기 영양소의 존재 하에서 종속영양 배양을 행하면서, 광을 조사함으로써 광 종속영양 배양을 행하는 것이 바람직하다.
상기 배양 공정에 있어서는, 낮에, 미세 조류에 광을 조사하면서 배양액에 이산화탄소를 공급함으로써 미세 조류의 광합성을 촉진시킬 수 있다. 또한, 밤 등에 광이 조사되지 않을 때, 유기 영양소의 존재 하에서 배양액에 공기를 공급하여 미세 조류를 종속영양 배양할 수 있다.
이와 같이 하여 배양 공정을 행함으로써, 미세 조류의 증식이 보다 촉진되고, 나아가서는 미세 조류에 의한 파라밀론 등의 발생이 보다 촉진되는 장점이 있다.
상기 배양 공정에서의 배양 온도는, 미세 조류를 증식할 수 있는 온도이면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 배양 온도(배양액의 온도)로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 15℃∼35℃, 바람직하게는 20℃∼30℃가 채용된다.
상기 배양 공정에서의 배양액의 pH는, 미세 조류를 증식할 수 있는 pH 이면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 pH로서는, 예를 들면, 2.5∼5.5가 채용된다.
그리고, 배양액의 pH를 조정하기 위해서는, 염산과 같은 무기산을 배양액에 첨가해할 수도 있고, 아세트산과 같은 유기산을 배양액에 첨가할 수도 있다. 유기산을 배양액에 첨가함으로써, 미세 조류가 상기 유기산을 유기 영양소로서 이용하여 증식할 수 있는 장점이 있다.
또한, 배양액의 pH를 조정하기 위해서는, 알칼리제를 배양액에 첨가할 수도 있다. 알칼리제로서는, 통상, 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨 등이 사용된다.
상기 배양 공정에 있어서는, 상기 유글레나(Euglena)속 미세 조류에 왁스 에스테르를 생산시키기 위하여, 배양액에 대한 산소의 공급을 억제할 수 있다.
구체적으로는, 상기 배양 공정에 있어서는, 예를 들면, 배양액으로의 폭기를 정지하는 것, 또는 산소를 포함하지 않는 불활성 가스 등을 배양액에 공급하는 것 등에 의해, 혐기 조건 하에서 미세 조류를 배양할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 세포 내에 파라밀론 등의 다당류를 축적한 미세 조류를 혐기 조건 하에서 더 배양함으로써, 유글레나속 미세 조류가 파라밀론을 왁스 에스테르로 변환하고, 상기 지질을 세포 내에 축적할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 왁스 에스테르의 발생을 더욱 촉진할 수 있는 점에서, 혐기 조건 하에서, 또한 광이 조사되지 않은 암 조건 하에서 미세 조류를 배양하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 배양 공정에 있어서는, 상기 유글레나(Euglena)속 미세 조류에 단백질을 생산시키기 위하여, 배양액에 산소를 공급하면서, 질소를 포함하는 무기 영양소, 또는 질소를 포함하는 유기 영양소의 존재 하에서, 미세 조류를 배양할 수 있다.
상기 배양 공정에 있어서는, 상기와 같이 하여 미세 조류를 배양함으로써, 미세 조류를 증식시키면서, 미세 조류에 다당류, 지질, 또는 단백질 등의 유기 화합물을 생산시켜, 미세 조류의 세포 내에 이와 같은 유기 화합물을 축적시킬 수 있다.
또한, 상기 배양 공정에 있어서는, 배양 조건을 적절하게 조정함으로써, 상기한 유기 화합물 이외의 색소, 비타민 C나 비타민 E 등의 비타민류, 단백질, 리놀렌산, 아라키돈산, 다가 불포화 지방산 등의 고도 불포화 지방산이나 포화 지방산 등의 지방산과 같은 유기 화합물도 미세 조류에게 생산시킬 수 있다.
그리고, 이들 유기 화합물이 세포 내에 축적된 미세 조류는, 식품, 의약품, 사료, 화성품, 또는 연료 등 다양한 용도로 사용될 수 있는 바이오매스(biomass)로서 이용할 수 있다.
상기 다당류로서는, 예를 들면, 파라밀론(β-1,3-글루칸)이 있다. 파라밀론은, 글루코오스가 약 700개 결합한 것이다.
상기 지질로서는, 예를 들면, 왁스 에스테르가 있다. 왁스 에스테르는, 고급 지방산과 고급 알코올이 에스테르 결합한 것이며, 왁스 에스테르로서는, 예를 들면, C-14의 지방산과 C-14의 고급 알코올이 에스테르 결합한 것이 있다.
그리고, 본 실시형태의 다당류의 제조 방법에 있어서는, 후술하는 유기 화합물의 제조 방법과 동일한 공정을 행할 수 있다.
이어서, 본 발명의 유기 화합물의 제조 방법의 일실시형태에 대하여 설명한다.
본 실시형태의 유기 화합물의 제조 방법은, 상기한 배양 방법(배양 공정)을 행함으로써, 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유기 화합물로서 제조하는 것이다.
본 실시형태의 유기 화합물의 제조 방법은, 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유기 화합물을 충분히 얻을 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
이 중, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질에 대해서는, 다당류의 제조 방법을 행함으로써, 다당류와 함께 제조될 수 있다.
바람직하게는, 본 실시형태의 유기 화합물의 제조 방법은, 전술한 배양 공정과, 또한 배양 후의 미세 조류의 분량을 높이는 농축 공정과, 농축 공정을 경과한 미세 조류의 수분을 더욱 감소시킴으로써 미세 조류를 건조시키는 건조 공정을 포함한다. 그리고, 상기 유기 화합물의 제조 방법에 있어서는, 농축 공정이나 건조 공정이 반드시 필요한 것은 아니다.
상기 농축 공정은, 예를 들면, 일반적인 농축 장치를 사용함으로써 행할 수 있다.
상기 농축 장치로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 부상(浮上) 농축, 중력 농축, 막 농축, 벨트 농축 등에 의해, 미세 조류의 분량을 높여 농축하는 장치가 있다. 또한, 상기 농축 장치로서는, 미세 조류의 분량을 더욱 높이기 위하여 탈수 장치가 사용될 수 있다.
상기 탈수 장치로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 진공 탈수기, 가압 탈수기(필터 프레스), 벨트 프레스, 스크루 프레스, 원심 농축 탈수기(스크루 디켄터), 또는 다중 원반 탈수기 등이 있다.
상기 농축 공정은, 제조하는 다당류, 지질, 단백질 등의 이용 용도에 따라, 농축 장치만에 의해 행할 수도 있고, 농축 장치 및 탈수 장치의 양쪽에 의해 행할 수도 있다.
상기 건조 공정은, 예를 들면, 농축 공정을 경과한 미세 조류를 가열하는 것, 또는 농축 공정을 경과한 미세 조류를 감압 하에 두는 것 등에 의해 행할 수 있다.
상기 농축 공정을 경과한 미세 조류나, 건조 공정을 경과한 미세 조류는, 세포 내에 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질 중 적어도 1종을 포함할 수 있는 것이므로, 예를 들면, 그대로 식품 등의 용도에서 이용될 수 있다.
또한, 농축 공정을 경과한 미세 조류나, 상기 건조 공정을 경과한 미세 조류가, 필요에 따라, 일반적인 추출 처리를 행해지는 것에 의해, 다당류, 지질, 비타민 C, 비타민 E, 색소, 및 단백질 중 적어도 1종이 유기 화합물로서 미세 조류로부터 취출된다. 취출된 유기 화합물은, 예를 들면, 식품 원료나 연료의 용도로 이용될 수 있다.
상기 추출 처리로서는, 예를 들면, 에탄올이나 헥산 등의 유기용제에 의해 상기한 유기 화합물을 추출하는 추출 처리, 또는 아임계(亞臨界) 상태의 CO2 용매에 의해 상기한 지질 등을 추출하는 추출 처리 등이 채용된다.
상기한 실시형태의 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법은, 상기 예시대로이지만, 본 발명은, 상기 예시의 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 일반적 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법에 있어서 사용되는 각종 태양을, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서, 채용할 수 있다.
즉, 본 발명은, 상기 실시형태로 한정되지 않고, 본 발명이 의도하는 범위 내에 있어서 적절하게 설계 변경되는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 작용 효과도, 상기 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
이번에 개시된 실시형태는, 모든 점에서 예시이며 제한적인 것은 아닌 것으로 생각되어야 한다. 본 발명의 범위는, 상기한 설명에 의해서가 아니라, 특허 청구의 범위에 의해 나타낸다. 또한, 본 발명의 범위에는, 특허 청구의 범위와 균등한 의미 및 범위 내에서의 모든 변경이 포함되는 것이 의도된다.
실시예
다음으로, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
(유글레나속 미세 조류의 채취 및 단리)
나가사키현의 호수와 늪으로부터 채취한 물을 AF-6 배지(후술)에 접종하고, 실온에서 형광등의 광을 조사하면서 2개월간 배양했다.
배양 후의 배지 중에서의 대상 미세 조류를 마이크로 피펫(pipet)에 의해 단리하였다. 단리한 미세 조류를, AF-6 배지에 있어서, 형광등의 광을 조사하면서 실온에서 배양했다.
(유글레나속 미세 조류의 동정)
[염기 서열의 결정]
단리한 미세 조류가 유글레나속에 속하는 종인 것을 확인하기 위하여, 하기의 조작을 행하였다.
즉, 배양한 유글레나속 미세 조류의 18S rRNA 유전자의 염기 서열을 유글레나속 미세 조류 18S rRNA 유전자 전용 프라이머(primer) 세트(Zakrys 등. 2002, Journal of Phycology 38: 1190-1199)를 사용하여, DNA 시퀀서(Beckman Coulter사 제조, 「CEQ8000」)에 의해 결정했다. 결정한 염기 서열을 서열 목록의 서열 번호 1로 나타낸다.
[염기 서열의 비교]
결정한 염기 서열을, BLAST 상동성 검색을 사용하여, GenBank로부터 얻은 기지의 유글레나속 미세 조류의 18S rRNA 유전자의 염기 서열과 비교했다. 또한, 기지의 유글레나속 미세 조류와의 배열 상동성의 일치의 정도를 비교했다. 단리한 유글레나속 미세 조류의 18S rRNA 유전자의 염기 서열과, 기지의 유글레나속 미세 조류의 18S rRNA 유전자의 염기 서열의 비교표를 도 1에 나타내었다.
또한, 분자 계통수 작성 소프트웨어 Mega5 프로그램(Tamura 등. 2011, Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739)을 사용하여, 최우법에 의해 분자 계통수를 작성하였다. 그 계통수를 도 2에 나타낸다.
그 결과, 상기와 같이 단리한 미세 조류가, 유글레나속에 속하는 종(Euglena gracilis Klebs)인 것을 동정했다. 그리고, 도 2에서의 EOD-1주의 Ka, Kb, Na, 및 Nb는, 단리한 미세 조류의 시험 샘플에 부여한 기호이다. 어느 시험 샘플을 사용해도 동일한 결과가 얻어졌다.
[RAPD 해석]
또한, 단리한 유글레나속 미세 조류와, 기지의 유글레나속 미세 조류를 비교하기 위하여, RAPD 해석(Random Amplified Polymorphic DNA)(참고 문헌: Williams 등. (1990) Nucleic Aids Res. 18(22), 6531-6535)에 의해, 단리한 유글레나속 미세 조류의 밴드 패턴과, 국립 환경 연구소 보존주 6주의 밴드 패턴을 얻었다.
RAPD 해석에서의 PCR 조건은, 하기와 같다.
샘플수: 3
프라이머 1: AAATCGGGCTG: RAPD-6 서열 번호 2
효소: Ex Taq(TAKARA사 제조)
반응 버퍼량: 50μL
DNA 템플레이트량: 약 0.5 ng
PCR의 온도 조건: 표 1에 나타낸 바와 같다. 상세하게는, 94℃에서 1분간으로 처리한 후, (94℃ 1분간, 40℃ 45 초간, 72℃ 1분간)×35회의 반복 처리, 그 후 72℃에서 7분간 처리.
영동 조건: 2.5 질량% 아가로스겔, 100 V, 40분
[표 1]
Figure 112015092981065-pct00001
[RAPD 해석에서의 비교 대상주]
Euglena gracilis NIES-47
Euglena gracilis NIES-48
Euglena gracilis NIES-49
Euglena gracilis NIES-253
Euglena gracilis NIES-286
Euglena gracilis NIES-2149
또한, 프라이머를 변경하고, 동일한 방법으로 PCR에 의해 RAPD 해석을 행하였다.
프라이머 2: ATCGGGTCCG: RAPD-4 서열 번호 3
프라이머 3: GCGATCCCCA: RAPD-3 서열 번호 4
그리고, 상기 프라이머 2∼4의 염기 서열은, Mostafa 등. (2011) Molecules 16, 2598-2608에 기재되어 있는 것이다.
상기한 프라이머 1을 사용하여 RAPD 해석을 행한 결과 (밴드 패턴)를 도 3a에 나타낸다. 또한, 상기한 프라이머 2 및 3을 사용하여 RAPD 해석을 행한 결과를 각각 도 3b, 도 3c에 나타낸다. 그리고, 도 3a∼도 3c에서의 EOD-1주의 Ka, Na는, 각각, 도 2에서의 Ka, Na와 대응하고 있다.
RAPD 해석의 결과로부터, 상기와 같이 단리한 유글레나속 미세 조류의 밴드 패턴이, 기지의 유글레나속 미세 조류의 밴드 패턴과 상이한 것을 알았다. 따라서, 상기와 같이 단리한 유글레나속 미세 조류는, 기지의 유글레나속 미세 조류와는 상이한 주인 것으로 판단하였다.
그리고, 상기와 같이 단리한 유글레나속 미세 조류를 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주로 명명했다.
(유글레나속 미세 조류의 배양)
유글레나속 미세 조류를 배양하기 위하여, 하기의 것을 준비하고, 하기의 배양 조건 하에서 배양 공정을 행하였다.
「본 발명의 유글레나속 미세 조류주」:
유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주
(수탁 번호: FERM BP-11530)
(독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터에 기탁됨)
「기지의 유글레나속 미세 조류주」:
유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) NIES-48주
(독립 행정법인 국립 환경 연구소 미생물 계통 보존 시설로부터 입수)
「배양 용기」: 300∼500 mL 플라스크 등, 후술하는 바와 같음
「배양액에 대한 가스의 공급」: 130 rpm의 진탕
(배양액을 진탕함으로써 배양액 중에 공기를 공급함)
「배양 온도」: 28℃
「배양 기간」: 후술하는 바와 같음
「배양액의 pH」: 후술하는 바와 같은
「배양을 위한 배양액 중의 성분」:
표 2, 표 3에 나타낸 조성을 기본 조성으로서 채용하였다.
그리고, 표 2에 나타낸 조성은, 독립 행정법인 국립 환경 연구소 미생물 계통 보존 시설에 의해 개시되어 있는 「AF-6 배지」의 조성에 대하여, 「P IV metals」배지의 조성(독립 행정법인 국립 환경 연구소 미생물 계통 보존 시설에 의해 개시)의 성분을 부가한 것이다. 또한, 배양액에 포함되는 영양소 이외에는, 물이다.
또한, 표 3에 나타낸 조성은, Cramer-Myers 배지의 조성을 바탕으로 한 것이다.
[표 2]
Figure 112015092981065-pct00002
[표 3]
Figure 112015092981065-pct00003
「미세 조류의 배양전의 초기 중량」: 0.78 g/L(건조 중량)
「유기 영양소」: 하기의 것을 배양에 따라 적절하게 변경
·글루코오스
·효모 엑기스(효모 자기 소화물)-
제품명 「Dried Yeast Extract D-3」일본 제약사 제조
·양조주로서의 맥주-시판 중인 맥주(맥아의 사용율이 66.7% 이상)
에탄올 5 용량%
실시예 1∼4, 비교예 1∼4에 있어서는, 암조건 하에서 종속영양 배양을 행하고, 그 이외의 실시예 및 비교예에 있어서는, 광 종속영양 배양을 행하였다. 미세 조류를 광 종속영양 배양할 때의 배양 조건의 상세한 것을 이하에 나타낸다.
「광조사 조건」: 12시간 광조사 후, 12시간 암소(暗所)
「광의 강도」: 광합성 광량자속밀도(PPFD)-약 100㎛ol/m2·s 또는 약 200㎛ol/m2·s
(실시예 1)
500 mL의 사카구치 플라스크에, 표 2에 나타낸 조성물을 200 mL 넣었다. 또한, 글루코오스가 15 g/L의 농도로 되고, 효모 엑기스가 5 g/L의 농도로 되도록, 글루코오스 및 효모 엑기스를 첨가하였다. 또한, 염산의 첨가에 의해 pH를 4.0으로 조정하고, 배양액을 조제하였다.
그리고, 상기한 배양 조건 하에서, 또한 암 조건 하(즉, 종속영양 배양 조건하)에서 플라스크를 진탕시키고, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주를 3일간 배양함으로써, 배양 공정을 행하였다.
(실시예 2∼4)
배양액 중에서의 글루코오스 농도가 각각 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L 농도로 되도록 글루코오스의 양을 변경한 점 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
(비교예 1)
유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주 대신, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) NIES-48주를 5일간에 걸쳐 배양한 점 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
(비교예 2∼4)
배양액 중에서의 글루코오스 농도가 각각 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L 농도로 되도록 글루코오스 양을 변경한 점 이외에는, 비교예 1과 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
각각의 실시예 및 각각의 비교예의 배양 공정을 행한 후의 미세 조류의 건조 중량을 각각 측정하였다. 또한, 첨가한 영양소의 전환율을 하기의 계산식에 의해 구하였다.
전환율(%)=
배양에 의해 증가한 조류의 건조 중량(g/L)/소비된 글루코오스 농도(g/L)
각각의 실시예 및 각각의 비교예에서의 배양 후의 조류의 건조 중량과 전환율의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4로부터 파악될 수 있는 바와 같이, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주는, 기지의 NIES-48주보다 바이오매스 생산량이 높다고 할 수 있다.
(실시예 5)
300 ml의 삼각 플라스크를 사용한 점, 표 2에 나타낸 조성물 50 mL에 대하여, 맥주 유래의 에탄올 농도가 2.5 용량%로 되도록 맥주를 첨가한 배양액을 사용한 점, 효모 엑기스를 배양액에 첨가하지 않은 점, 12시간의 광조사 환경과 12시간의 암 환경을 반복하여 배양한 점, 배양 기간을 7일간으로 한 점 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주를 배양함으로써, 배양 공정을 행하였다. 그리고, 광합성 광량자속밀도(PPFD)를 약 100㎛ol/m2·s로 하였다.
(실시예 6)
상기한 효모 엑기스 농도가 2 g/L로 되도록 효모 엑기스를 배양액에 첨가한 점 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
(비교예 5)
유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주 대신, 유글레나속 미세 조류 NIES-48주를 배양한 점 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
(비교예 6)
상기한 효모 엑기스 농도가 2 g/L로 되도록 효모 엑기스를 배양액에 첨가한 점 이외에는, 비교예 5와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
실시예 5, 6, 비교예 5, 6의 배양 공정을 행하면서, 1, 2, 3, 4, 5, 7일간 배양 후의 미세 조류의 건조 중량을 각각 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5로부터 파악될 수 있는 바와 같이, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주는, 광 종속영양 배양의 조건 하에서 배양되어도, 기지의 NIES-48주에 비해 높은 생산성을 가지는 것을 알 수 있다.
(실시예 7∼12)
표 2에 나타낸 조성물 대신 표 3에 나타낸 조성물을 사용한 점, 배양액의 초기 pH를 각각 pH 5.5, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 8.5, 또는 pH 9.0으로 변경한 점, 배양 기간을 10일간으로 변경한 점 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
실시예 7∼12의 배양 공정을 행하면서, 경시적(經時的)으로 배양 후의 미세 조류의 건조 중량을 각각 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
(실시예 13∼17)
표 2에 나타낸 조성물 대신 표 3에 나타낸 조성물을 사용한 점, 광합성 광량자속밀도(PPFD)를 약 200㎛ol/m2·s로 한 점, 배양액의 초기 pH를 각각 pH 3.5, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0, 또는 pH 5.5로 변경한 점, 배양 기간을 10일간으로 변경한 점 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
(실시예 18, 19)
표 2에 나타낸 조성물 대신 표 3에 나타낸 조성물을 사용한 점, 배양액의 초기 pH를 각각 pH 3.5, 또는 pH 5.5로 각각 변경한 점, 배양 기간을 10일간으로 변경한 점 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
실시예 13∼19의 배양 공정을 행하면서, 경시적으로 배양 후의 미세 조류의 건조 중량을 각각 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
(실시예 20)
배양 기간을 7일간으로 한 점 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주를 배양함으로써, 배양 공정을 행하였다.
그리고, 배양 개시로부터 2일 후까지는, 플라스크를 진탕시키는 것에 의해 호기 조건 하에서의 배양으로 하고, 그 이후는, 진탕을 정지하고, 불활성 가스(질소 가스)를 공급함으로써 혐기 조건 하에서의 배양으로 하였다.
(비교예 7)
유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주 대신, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) NIES-48주를 배양한 점 이외에는, 실시예 20와 동일한 방법으로 배양 공정을 행하였다.
그리고, 배양 개시로부터 4일 후까지는, 플라스크를 진탕시키는 것에 의해 호기 조건 하에서의 배양으로 하고, 그 이후는, 진탕을 정지하고, 불활성 가스(질소 가스)를 공급함으로써 혐기 조건 하에서의 배양으로 하였다.
실시예 20 및 비교예 7의 배양에 의해 발생된 파라밀론 및 지질(왁스 에스테르)의 양을 하루마다 측정하였다.
배양 후의 파라밀론량의 측정은, 하기의 수순으로 행하였다. 즉, 배양 후의 미세 조류와 배양액의 혼합물(40 mL)을 원심관에 넣고, 원심분리했다. 원심분리 후의 침전물에 순수를 가하여 현탁시키고 다시 원심분리하는 조작을 2회 반복하였다. 그리고, 원심분리 후의 침전물에 소량의 순수를 가하여 현탁시키고, 현탁물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여, 배양액의 성분을 제거하였다.
다음으로, 동결건조 후의 미세 조류의 세포를, 칭량한 원심관(블랭크값이 됨)에 400 mg 정도 정확하게 칭량하여 취하였다. 아세톤을 가하여 현탁시키고, 원심분리 후 상징액을 제거하였다. 상징액의 색이 없어질 때까지, 아세톤에 의한 세정 조작을 5회 정도 반복하였다. 이와 같이 하여, 미세 조류가 생산한 색소 성분을 제거하였다.
이어서, 도데실 황산나트륨 용액을 사용하여, 파라밀론 이외의 성분을 제거하는 조작을 행하였다. 즉, 색소 성분을 제거한 후의 잔분(殘分)에, 1% 도데실 황산나트륨(SDS) 용액을 20 mL 가하여, 현탁시킨 후, 100℃에서 10분간 가열하였다. 그리고, 원심분리한 후 상징액을 제거하였다. 이와 같은 조작을 2회 반복한 후, SDS 용액 대신 순수를 사용하여 동일한 조작을 3회 반복하여, SDS를 세정 제거하였다.
마지막으로, 105℃의 건조기 내에 원심관마다 넣어서 수분을 제거하고, 파라밀론이 들어간 원심관의 무게를 측정하였다. 그리고, 상기한 블랭크값의 차이로부터, 파라밀론량을 구하였다.
한편, 배양 후의 왁스 에스테르량의 측정은, BLIGHT-DYER법에 의해 행하였다.
실시예 20 및 비교예 7의 배양에 있어서, 경시적으로 파라밀론의 양을 측정한 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타낸다. 또한, 경시적으로 지질(왁스 에스테르)의 양을 측정한 결과를 도 9a 및 도 9b에 나타낸다.
도 8a 및 도 8b로부터 파악되는 바와 같이, 종래의 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) NIES-48주와 비교하여, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주는, 파라밀론의 생산 속도가 NIES-48주보다 빠르다. 또한, EOD-1주는, 세포당 파라밀론 함유량이 약 55% 이상이며, NIES-48주보다 많다.
또한, 도 9a 및 도 9b로부터 파악되는 바와 같이, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주는, 지질(왁스 에스테르)의 발생 속도가 보다 빠르며, 세포당 왁스 에스테르 함유량이, 보다 단기간에 높아진다.
또한, 하기의 표 4 및 표 5에 나타낸 조성의 배지에서, 하기의 배양 조건하에서양 공정을 행하였다.
(실시예 21)
미세 조류로서의 상기한 EOD-1주를 광 종속영양 배양에 의해 2일간 배양했다.
(비교예 8)
미세 조류로서의 상기한 NIES-48주를 광 종속영양 배양에 의해 2일간 배양했다.
배지로서는, Hutner의 배지를 변형한 것(이하 「Modified Hutner 배지」라고 도 함)에 글루코오스를 30 g/L 첨가한 배지를 채용하였다. 구체적인 조성은, 표 4에 나타낸 바와 같으며, 또한, 액체에 포함되는 영양소 이외에는, 물이다. 표 4에서의 미량 금속 함유 용액으로서는, 하기 표 5의 조성을 가지는 미량 금속 함유 용액을 사용하였다. 미량 금속 성분 이외에는 물이다.
배양 방법의 상세한 것은, 하기와 같다.
「배양액」: 염산에 의해 pH를 4.0으로 조정
「배양 용기」: 500 mL 사카구치 플라스크
「배양 전의 투입」: 배양액 200 mL와 배양 전 미세 조류를 사카구치 플라스크에 수용
(초기 바이오매스량을 맞추기 위해, EOD-1주에서는 합계 220 mL, NIES-48주에서는 합계 236 mL)
「배양 시의 온도」: 28℃
「배양 시의 명암 조건」: 차광한 암 조건에서 배양
「배양 시의 호기 조건」: 진탕기에 사카구치 플라스크를 세팅하고, 130 rpm의 왕복 진탕으로 운전함으로써 배양액 중에 공기를 공급
[표 4]
Figure 112015092981065-pct00004
[표 5]
Figure 112015092981065-pct00005
배양 2일 후의 조의 건조 중량(바이오매스 생산량)과, 글루코오스의 전환율을, 상기와 동일하게 하여 산출하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure 112015092981065-pct00006
표 6으로부터 파악되는 바와 같이, 종래의 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) NIES-48주와 비교하여, 유글레나속 미세 조류(Euglena gracilis) EOD-1주는, 바이오매스 생산 능력이 보다 우수하고, 또한 보다 우수한 글루코오스 전환율을 가진다.
[산업상 이용가능성]
본 발명의 미세 조류, 본 발명의 다당류의 제조 방법, 및 본 발명의 유기 화합물의 제조 방법은, 파라밀론 등의 다당류, 왁스 에스테르 등의 지질, 단백질 등의 유기 화합물을 배양에 의해 얻기 위해 바람직하게 사용된다.
얻어진 유기 화합물은, 미세 조류의 세포 내에 축적된 채로, 또는 추출 처리 등에 의해 취출함으로써, 건강식품, 의약품, 사료, 화성품, 또는 연료 등의 용도에서 이용할 수 있다. 구체적으로는, 배양에 의해 미세 조류의 세포 내에 축적된 유기 화합물로서의 지질은, 예를 들면, 세포 내로부터 취출되어 연료의 원료로서 바람직하게 사용된다.
기탁기관명 : 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물 기탁 센터
수탁번호 : NITEFERMBP-11530
수탁일자 : 20130628
SEQUENCE LISTING <110> University of Tsukuba Kobelco Eco-Solutions Co,.LTD. <120> EUGLENA SPP. MICROALGAE, POLYSACCHARIDE MANUFACTURING METHOD, AND ORGANIC COMPOUND MANUFACTURING METHOD <130> FPP-4864 <150> JP 2013-067558 <151> 2013-03-27 <160> 4 <210> 1 <211> 1960 <212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 1 gtgtgctcgg tccacctgca aggaccccat tggacatcca ccaaaacctt gtggctaata 60 cacgttcgac ccagtcagcc atgcaacact cggcagggat cctgtcttcg gacagtccct 120 tcaccggtgg tggcggatgt atgcccagct gatacaaaga ccagcggccg caaggccagt 180 gtgttggcat ggttgactca ggctggccct ccgtggccgc tgtgctggtg gatttcgtgc 240 atgcctcgtg tatgccccac ttgatcgcaa gagcttctga cctatcagct tgactgtggt 300 gtatcggacc acagtggcct tgacgggtaa cggagaatca gggttcgatt ccggagaggg 360 agcctgagag acggctacca ctaccaaggt gggcagcagg cacgcaaatt gccccatgca 420 aagacagtct gtgaggcagc gacgaacagt agcaaccccg tcggccttac gtgccgatgg 480 ggcttggaat ggacgctatc caaagacagc cgtgagtatc aaccggaggg caagtctggt 540 gccagcagct gcggtaattc cagctccgag ggcgtatact aacattgctg ctgttaaaac 600 acttgtagtc tgcctacggg ctgcaggtct gctgggtggc cggtttgttg tttctctggc 660 cagggaagga cctcggttcg accctgtgtt gggctgcaac ggctggactc aacccccagt 720 ggtacgtccc tgcgcccacc tttcagtcga tggtgagatc tgctcctgcc aaaagtctgc 780 ttcattgcag gccaaagcgg tttatgcctc ccgcactggc aacggacacc aacaggggac 840 ccagcctcga gctgggtagt ctacctctgg tccaccaccg gagcccaccg tcttcgacac 900 cctggaaaac tcagtgtgct caaagcatcc ccgcgacggc tgaatgtcca tccatggaat 960 gtcaaggcat cgaccaagtg tggcattgga gttgtgctgg ccttggggcc cactctggac 1020 aacctggtgg tgtgttcctg caggatcaac aggatcgttg ccctgcctgg ccttcgggtc 1080 tcgtcaggct tcgtcccctg tccctgcagc ttgcacccat cgatcgtaag tgatgggact 1140 gttcggggtg aaagatacgg gagcgccaga ggtgaaattc ttagatcgct gccagatcca 1200 ctgcagcgaa ggcgttctgc aagtgcacgt ccgtcgatca agaatgagag ttcggggagc 1260 aaagatgatc agacaccgtc gtagtccggc cactgtaaac gatgccggcc aggccttggc 1320 agagcaagaa tccgagactc tgtcagggcc actcctccca caacgagaaa tccacagcct 1380 gtgggttcag gggggagtac tgtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaatggca 1440 ccacaaggcg tggagtatgc ggcttaattt gactcaacgc ggggaatgtt accaggtcag 1500 gacgcaactg ggattgacag attgagagct ctttcttgat cttgtggacg gtggtgcatg 1560 gccgctcctg attggtggag tgatttgtct ggttgattcc gataacgagt gagacatctg 1620 cctcccacta gcctggggct cgcatttggt agggttcggc tgctcggtgg cagccccctg 1680 gcaacagggg gagatgtacc ggtgcatgct cccgagagcc tccagttcag cttctctgag 1740 gtgctgtgtc cgccacaaag ggcacgcatg ctagagccaa cagcaggtct gtgatgctcc 1800 cagatgtcct gggccgcacg cgcactacat tgtcacagtg aaggtgtcga catgcccact 1860 ccggtgggcc ctggcctgaa gaggctggga aatcctgcaa gcctgtgacg tactggggat 1920 agatggttgc aactgtctgc cttgaacgtg gaatgcctag 1960 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A sequence for primer1 <400> 2 aaatcgggct g 11 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A sequence for primer2 <400> 3 atcgggtccg 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A sequence for primer3 <400> 4 gcgatcccca 10

Claims (7)

  1. 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) EOD-1주(수탁 번호 FERM BP-11530)인, 파라밀론(paramylon) 및 왁스 에스테르 중 적어도 1종의 생산능을 가지는 유글레나속 미세 조류(algae).
  2. 제1항에 기재된 유글레나속 미세 조류를 다당류 생산 생물로서 배양함으로써 파라밀론을 제조하는, 파라밀론의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배양에서 사용되는 배양액이, 글루코오스를 15∼30 g/L 포함하는, 파라밀론의 제조 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 배양에서 사용되는 배양액이, 효모 분해물을 포함하는, 파라밀론의 제조 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 배양에서 사용되는 배양액이, AF6 배지의 조성을 가지는, 파라밀론의 제조 방법.
  6. 제1항에 기재된 유글레나속 미세 조류를 배양함으로써, 파라밀론 및 왁스 에스테르 중 적어도 1종의 유기 화합물을 제조하는, 유기 화합물의 제조 방법.
  7. 삭제
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