CN112899168B - 4r-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用 - Google Patents

4r-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了4R‑氨基戊酸、4‑氨基戊酸和/或4‑氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用，属于裸藻培养技术领域。本发明利用4R‑氨基戊酸、4‑氨基戊酸和/或4‑氨基丁酸与裸藻培养促进裸藻中叶绿素含量增加，实现裸藻叶绿素产能物质的高效产出及可持续培养，进而能够促进目前裸藻培养产能机制的研究进展，解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈问题。

Description

4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶 绿素含量中的应用
技术领域
本发明涉及裸藻培养技术领域，尤其涉及4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用。
背景技术
裸藻(Euglena gracilis)也叫“眼虫”，5亿年前就已经开始在地球上繁衍，它种类繁多分布广泛，是一类淡水生活的单细胞生物，因其具有动植物双重特性，且细胞外面没有细胞壁而得名。与其它的藻类细胞相比，裸藻细胞因其没有细胞壁，所以它的营养有着很高的可吸收率，是一种非常有潜力的食品营养添加剂和生物原料。大部分裸藻不仅含有人体需要的丰富必需多不饱和脂肪酸PUFA、维生素C、维生素E以及蛋白质和抗氧化成分，如β-胡萝卜素外，还含有裸藻特有的产物--副淀粉(Paramylon，Pm)。叶绿素，是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。但是目前裸藻养殖中存在裸藻中叶绿素含量低的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用。
优选的，4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸通过添加到裸藻培养基中来提高裸藻中叶绿素含量。
优选的，所述应用包括以下步骤：
1)对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液；
2)将4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸、待培养藻液和裸藻专用培养基混合，进行培养，得到含裸藻的藻液；
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基，还包括10～80g/L的葡萄糖。
优选的，步骤2)中，每1.5L混合液包括待培养藻液100～800mL、4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸1～60g和余量的裸藻专用培养基。
优选的，步骤2)中所述培养的光照强度为70～200μmol/m2s1。
优选的，步骤1)中所述离心的转速为3000～8000rpm；所述离心的时间为3～20min。
本发明提供了4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用。本发明利用4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸与裸藻培养促进裸藻中叶绿素含量增加，实现裸藻叶绿素产能物质的高效产出及可持续培养，进而能够促进目前裸藻培养产能机制的研究进展，解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈问题。
附图说明
图1为实施例1和对比例1的培养体系中裸藻叶绿素含量变化；
图2为实施例2和对比例2的培养体系中裸藻叶绿素含量变化。
具体实施方式
本发明提供了4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用。4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸添加到裸藻培养基中来提高裸藻中叶绿素含量。在本发明中，4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和4-氨基丁酸的共同活性特征结构是包括碳链、氨基和羧基。
在本发明中，所述4R-氨基戊酸的分子结构式如式I所示；在本发明中，所述化学式如式购自于生物工程(上海)股份有限公司。
Figure BDA0002936916800000031
在本发明中，所述4-氨基丁酸的化学结构式II所示；所述4-氨基丁酸购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
Figure BDA0002936916800000032
在本发明中，所述4-氨基戊酸的化学结构式Ⅲ所示；所述4-氨基戊酸购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
Figure BDA0002936916800000033
在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：
1)对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液；
2)将4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸、待培养藻液和裸藻专用培养基混合，进行培养，得到含裸藻的藻液；
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基，还包括10～80g/L的葡萄糖。
本发明首先对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液。
在本发明中，在所述放大培养之前优选的还包括对所述裸藻进行活化培养，得到裸藻活化培养液；所述活化培养采用的培养基优选为裸藻常用培养基；所述活化培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为26℃；所述活化培养的时间优选为7～9d，更优选的以将裸藻培养至对数期(OD750＝3)为准；所述活化培养过程中，每隔24h取样测OD750值。在所述活化培养过程中，本发明对光照周期没有特殊要求，无光照条件下、光照：黑暗＝12h:12h条件或全天光照条件均可。若在有光照的条件下，所述光照的光照强度优选为70～200μmol/m2s1；进一步优选为100～150μmol/m2s1。
在得到裸藻活化培养液后，本发明优选的还包括将所述裸藻活化培养液转接至培养基进行放大培养；所述放大培养采用的培养基优选为裸藻常用培养基；所述放大培养的温度优选为20～30℃，进一步优选为23℃；所述放大培养的光照强度优选为70～200μmol/m2s1，进一步优选为100μmol/m2s1；所述放大培养优选的于光照培养箱中进行；所述放大培养的时间优选的以裸藻达到生长对数期为准；所述扩大培养的次数优选为2次；所述放大培养过程中，优选的每天对培养瓶进行摇动；所述摇动的方式优选为人工摇动；所述摇动的次数优选为2～10次/d，以避免藻体沉底。在本发明中，扩大培养是为了让藻种进行生长繁殖，经过对数期增长，藻种量快速增加。
本发明所述活化培养和光照培养的过程均按照标准的微生物学实验方法，在超净工作台的无菌条件下进行，以避免藻种被污染。
在本发明中，所述离心的转速优选为3000～8000rpm，进一步优选为5000rpm；所述离心的时间优选为3～20min，进一步优选为5min。在本发明中，所述葡萄糖的作用是提供碳源。
在本发明中，所述裸藻专用培养基中葡萄糖的浓度优选为15g/L。
在本发明中，所述裸藻常用培养基的配方如表1所示。
表1裸藻常用培养基配方
Figure BDA0002936916800000041
Figure BDA0002936916800000051
所述Microelementa的配方参见表2。
表2 Microelementa的配方
Figure BDA0002936916800000052
bVitamin B1：准确称量0.05g Vitamin B1，溶于100mL去离子水，过滤除菌，存于4℃冰箱。
cVitamin B12：准确称量0.05g Vitamin B12，溶于1L去离子水，过滤除菌，存于4℃冰箱。
得到待培养藻液后，本发明将4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸、待培养藻液和裸藻专用培养基混合，进行培养，得到含裸藻的藻液。
在本发明中，每1.5L混合液优选的包括待培养藻液100～800mL、4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸1～60g和余量的裸藻专用培养基，进一步优选的每1.5L混合液包括待培养藻液200mL、4R-氨基戊酸、4-氨基戊酸和/或4-氨基丁酸2～10g和余量的裸藻专用培养基。在本发明中，所述培养的光照强度优选为70～200μmol/m2s1，进一步优选为100μmol/m2s1；所述培养过程中优选的保持持续光照；所述培养优选的于光照培养箱中进行；所述培养的时间优选为5～7d，进一步优选为6d；所述培养的温度优选为20～25℃，进一步优选为23℃。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、藻种来源
本发明所使用的藻种：裸藻(Euglena.gracilis)CCAP 1224/5Z，购买于CultureCollection ofAlgae andProtozoa。
2、培养基组成
裸藻常用培养基配方参见表1。Microelementa的配方参见表2。裸藻专用培养基为裸藻常用培养基再加15g/L葡萄糖。
3、藻种培养方法
挑取裸藻保种平板的裸藻放入50mL灭菌裸藻常用培养基的150mL三角锥形瓶进行活化，待其培养至对数期，转移至1L新鲜裸藻常用培养基溶液中继续扩培，放置于光照培养箱，23±1℃培养，光照强度为100±5μmol/m2s1，持续光照。整个操作过程均按照标准的微生物学实验方法，在超净工作台的无菌条件下进行，以避免藻种被污染。培养过程中采用人工摇动，每天摇2～3次，避免藻体沉底。培养直至裸藻生长对数期，再进行转接到3个含有1L新鲜裸藻常用培养液中扩培，待生长至对数期，即可转接出去进行放大培养。
4、裸藻和4R-氨基戊酸培养技术
1)藻液预处理
将培养至饱和期(OD750约3)的裸藻藻液进行收集，5000rpm离心5min，藻沉淀用裸藻专用培养基洗涤三次后，加入裸藻专用培养基定容至OD750为3，取200mL转移至2L灭菌的锥形瓶中；
2)加入4R-氨基戊酸培养
200mL藻液加入2g 4R-氨基戊酸，然后用裸藻专用培养基定容至1.5L，置于光照培养箱中，光照强度为100±5μmol/m2s1，持续光照。第3天与第9天取样检测裸藻的生理指标(叶绿素)，每组三个生物学平行实验。
对比例1
除省略4R-氨基戊酸外，其余内容和实施例1相同。
实施例2
除将实施例1中4R-氨基戊酸替换为4-氨基丁酸外，其余和实施例1相同。
对比例2
除省略4-氨基丁酸外，其余内容和实施例2相同。
测定实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的藻液中的裸藻叶绿素含量
(1)从每个实验培养样品中取三组平行样，每组1mL纤细裸藻液放置于1.5mL离心管中；
(2)将样品置于在离心机，转速8000rpm/min，离心5min，除去上清回收藻细胞；
(3)向样品离心管中加入1mL的100％甲醇,充分混匀放置萃取30min；
(4)再次离心收集上清，采用分光光度计(UVmini-1240)分别在665nm(A665)和650nm(A650)测定提取物的吸光度；
(5)以甲醇为空白样，测同样波长时的吸光度值。
计算公式：总叶绿素浓度(μg/mL)＝4*A665+25.5*A650。
实施例1和对比例1的比较结果参见图1，结果显示：对比例1与加入4R-氨基戊酸的裸藻培养体系(实施例1)随着培养时间的增加，各体系的裸藻叶绿素含量均不断提升，且后者的叶绿素含量远远大于前者。第9天时，加入了4R-氨基戊酸培养的裸藻体系中，叶绿素含量达到了最大值70.07μg/mL，相较于对比例1的38.5μg/mL提高了82％。本发明利用4R-氨基戊酸促进裸藻叶绿素产能增加，促进目前培养产能机制的研究进展，解决裸藻大规模培养所面临的瓶颈。
实施例2和对比例2的比较结果参见图2，结果显示：对比例2与实施例2的裸藻培养体系随着培养时间的增加，各体系的裸藻叶绿素含量均不断提升，且后者的叶绿素含量远远大于前者。第9天时，加入了4-氨基丁酸培养的实施例2的裸藻体系中，叶绿素含量达到了最大值60.5μg/mL，相较于对比例2的38.5μg/mL提高了57.14％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.4R-氨基戊酸在提高裸藻中叶绿素含量中的应用；
所述应用包括以下步骤：
1)对裸藻进行放大培养，至藻液的OD750值达到1.0～4.5，得到富集藻液，对所述富集藻液进行离心，收集沉淀，采用裸藻专用培养基和所述沉淀混合至混合液的OD750值为1.0～4.5，得到待培养藻液；
2)将4R-氨基戊酸、待培养藻液和裸藻专用培养基混合，进行培养，得到含裸藻的藻液；所述培养的时间为5～7d；
所述裸藻专用培养基以裸藻常用培养基为基础培养基，还包括10～80g/L的葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)中，每1.5L混合液包括待培养藻液100～800mL、4R-氨基戊酸1～60g和余量的裸藻专用培养基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述培养的光照强度为70～200μmol/m2s1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述离心的转速为3000～8000rpm；所述离心的时间为3～20min。
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