CN108728363A

CN108728363A - 一种裸藻培养基

Info

Publication number: CN108728363A
Application number: CN201710241539.XA
Authority: CN
Inventors: 陆嘉欣; 杨磊; 王江新
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2018-11-02

Abstract

本发明公开了一种裸藻突变株、获得方法及其培养基，所述裸藻突变株，其保藏号为CCAP 1224/5Z。本发明通过化学试剂亚硝基胍（NTG）处理纤细裸藻野生型，使其发生不定向变异，进行扩大培养，采用定向筛选方法筛选出生长速度快以及高脂肪酸含量的突变裸藻藻株，其藻种中心编号为CCAP（英国藻类和原生动物保藏中心）1224/5Z。通过化学试剂亚硝基胍（NTG）诱变育种技术结合定向筛选方法筛选出高生产速率和脂肪酸含量高的裸藻突变株。

Description

一种裸藻培养基

技术领域

本发明属于裸藻培养领域，尤其是涉及一种高生产速率和高脂肪酸产量的纤细裸藻的培养基。

背景技术

近年来，全球面临着化石能源的日益枯竭，人们开始寻求新的替代能源。生物柴油是唯一可能大规模替代石油燃料的能源，因此受到了广泛的重视，与石油柴油相比，生物柴油具有不污染环境、可再生等特点。其中，微藻生物柴油是一种具有较大发展潜力的生物质能源，与传统的生物柴油相比，微藻生物柴油具有更多的优势，例如，易于培养、不占用耕地、产油率高、繁殖速度快等。

随着人类社会能源枯竭的压力和环境恶化问题日益突出，利用微藻生产生物柴油及其他相关产品，逐渐替代化石能源将是可持续发展的必然要求。

目前微藻生物柴油在国内外取得了很大进展，但是仍然面临很多挑战，如生产成本高和脂肪酸产量较低等，这些问题成为微藻生物柴油进一步规模化生产的瓶颈。因此，寻找生产效率高和脂肪酸产量高的微藻，能有效提高产量，降低成本，为工业化大生产提供有力的支持，有较高的经济意义；另一方面，微藻规模化培养后油脂含量不稳定，如何选育一种可以持续稳定油脂含量的微藻新藻株，能够解决生物燃料原料不足的问题，这正是现在亟待解决的问题。

纤细裸藻Euglena gracilis，裸藻属（又称眼虫藻属），是一种单细胞藻类，具有动植物双重性，也叫“眼虫”。纤细裸藻兼具自养和异养两种营养方式，生长迅速。裸藻没有细胞壁，具有相当高的生物活性物质，其所含的营养物质有着很高的可利用性，具有很好的市场前景，寻找其生长快速和高脂肪酸产量藻株有助于微藻生物的发展，是解决微藻生物柴油的重要举措。

发明内容

本发明针对现有藻株规模化培养后油脂含量不稳定的情况，提供了一种生长快速和高产脂肪酸量的裸藻突变株的培养基。

A）亚硝基胍的诱变处理：

取细胞数达到1.0×10⁵~1.0×10⁶个/ml的野生型纤细裸藻，用终浓度为 0.5~0.8mg/ml 的亚硝基胍溶液中，在30-35℃条件下处理0.5-1h；

B）裸藻突变藻株的分离及扩培：

将处理过后的裸藻藻液梯度稀释至10³~10⁴，取样均匀涂布于固体PolyA培养基平板上，将平板置于光照培养箱内培养7-15天后得到单藻落，再将单藻落挑取进行扩大培养；

C）突变藻株的生长特性分析：

对扩大培养所得的纤细裸藻突变株在Heter液体培养基中进行培养，取藻液进行计数，绘制生长曲线。

对突变藻株脂肪酸含量测定

培养9天之后即可测其脂肪酸含量，称取冷冻干燥后的裸藻藻粉5mg，加入C19：0内标工作液、NaOH-CH3OH溶液处理1h，接着75℃皂化后，加入HCl-CH3OH溶液和HCL再75℃使其充分甲脂化后利用正己烷进行萃取，而后离心令其分层吸取上层于色谱小瓶内并置于通风厨内吹干后加入二氯甲烷溶解脂肪酸甲脂，最后采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对其脂肪酸甲酯组分进行定量分析。

所述PolyA培养基组分及含量为

Heter液体培养基的组分及含量为

所述Metals 60A的组分及含量为

本发明对野生型纤细裸藻采用NTG进行化学诱变，获得突变藻株单藻落后对其进行光合异养培养，以生长速率为指标进行初步筛选，获得较野生藻株生长速率更快、性能较为稳定的突变藻株A4、A11。由图2可见，突变株A4、A11培养到平台期（第9天），其细胞数分别达到1.30×107、1.26×107，相对野生型WT分别提高了23.8%、20%。由表3、表4可见，在对培养9天藻细胞进行脂肪酸分析发现，突变株A4、A11较野生型WT的饱和脂肪酸C12:0、C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C18:0含量提高35% ~50%，不饱和脂肪酸含量提高更为突出，其中，C16:1提高66%~67%；C18:2，A4提高较为显著，为101.15%；C20:4和C20:5，A11提高量较为显著，分别为104.31%和89.26%；C22:6，A4和A11提高量都非常显著，分别为180.14%和275.75%；而C22:1，在野生型藻株内无检测到，而在突变藻株A4、A11内检测到的含量分别为42.436ug/mg和34.587ug/mg。

附图说明

图1 NTG诱变处理的纤细裸藻突变株的平板筛选结果示意图

图2 野生型纤细裸藻（WT）与突变藻株A4、A11生长情况对比示意图

图3 Heter培养基培养下突变株A4、A11相对野生型藻株WT单位脂肪酸含量对比示意图

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，可以是本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明采用的野生型纤细裸藻从CCAP（CultureCollection of Algae and Protozoa）购得。

实例一：纤细裸藻（Euglena gracilis）通过亚硝基胍（NTG）诱变育种和突变株的获得

1）根据表1配方进行PolyA培养基配制

表1 本发明中培养用的PolyA培养基

本发明中固体PolyA培养基由乙酸钠2g、胰蛋白胨1g、酵母提取物1g，琼脂粉10g，加水至1L而成。

2）PBS溶液的配制方法

本发明PBS溶液均为0.2mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液：由0.2mol/L Na₂HPO₄ 61mL 与0.2mol/L NaH₂PO₄ 39mL 混合而成。

3）本发明所述的0.8mg/ml的亚硝基胍（NTG）溶液的配制方法

由0.2M PBS(pH7.0) 1.6ml与4.0mg/ml NTG 混合而成。

根据表2配方进行Heter液体培养基配制

表2 本发明中培养用的Heter液体培养基

a）准确称量0.084g六水硫酸亚铁安，溶于 10ml 去离子水，现配现用。

b）“Metals 60A”配方

c）维生素B₁：准确称量0.1g Vitamin B₁，溶于100mL 去离子水，过滤除菌，存于4℃冰箱。

d）维生素B₁₂：准确称量0.02gVitamin B₁₂，溶于1000mL去离子水，取得到的溶液1mL 稀释至100mL，过滤除菌，存于4℃冰箱。

1.亚硝基胍（NTG）诱变

将纤细裸藻混合到PolyA液体培养基中，常规培养后使其细胞数达到1.0×10⁵个/ml以上，取2ml藻液5000rmp，5min 离心收集藻体，用PBS洗涤两遍，然后加入终浓度为0.8mg/ml的亚硝基胍溶液中，35℃处理1h；

2.裸藻突变藻株的分离

将上述诱变处理后的裸藻藻液用PBS洗涤3次，再用PolyA培养基重悬成悬液，浓度梯度稀释至细胞数为10⁴后，取400μl均匀涂布于固体PolyA培养基平板上，将平板置于光照培养箱内培养7-15天后得到单藻落，光照条件为：光照65±5μmol/m²s¹，24h光照，温度25±1℃。平板置于光照培养箱内培养15天后得到的单藻落如图1所示。

3. 突变藻的扩培

将经过步骤2平板上所得的单藻落挑取于12孔板中的PolyA培养液中进行小体积活化，活化体系为4ml，活化时间为2-4天，然后再以1:10的体积比直接转接到PolyA培养液中进行再次活化，活化体系为30ml，活化时间为2-4天，最后将活化的突变藻株藻液再以1:10的体积比接种到Heter异养培养液内，利用培养瓶进行培养。在此步骤中，条件均为光照65±5μmol/m²s¹，24h光照，温度25±1℃。

实例二：野生型纤细裸藻（WT）和突变藻株A4、A11的比较

1.生长速率的比较

所得的纤细裸藻突变株A4、A11在Heter液体培养基中进行培养3-4天，以1:10的体积比接种到新的Heter液体培养基中，使得接种后的细胞数为2.0×105个/ml，每组做三个平行样，每天取1ml藻液进行血球计数板计数，绘制生长曲线，。在此步骤中，条件均为光照65±5μmol/m²s¹，24h光照，温度25±1℃。野生型纤细裸藻（WT）与突变藻株A4、A11生长情况对比如图2所示。

2.脂肪酸含量的比较

1）脂肪酸的提取

利用培养瓶对藻株进行进行培养，培养9天之后达到生长平台期，此时期藻内脂肪酸积累量达到最高，即可测定培养瓶中藻株的脂肪酸量。

在培养瓶中取藻液5-10ml冷冻干燥成藻粉后，称取5mg于螺纹带盖玻璃离心管中，加入50μl C19：0 内标工作液、1ml 2M NaOH-CH3OH溶液，在转速为110rpm的摇床上放置1h；在75℃水浴锅中皂化15min，冷却后加入1mL 4M HCl-CH3OH溶液，并加入0.5mL HCL（38%）使PH＜2，再放到75℃水浴锅中15min，使其充分甲酯化；取出待冷却后加入1mL正己烷，涡旋震荡10s两次，使其萃取完全；转速为3500rpm离心2min促进分层，吸取上层清液至色谱小瓶中，放置到通风厨约5小时；溶剂挥发完全可见油脂贴在瓶壁上，加入500μL二氯甲烷充分溶解得到的脂肪酸甲酯。

2）脂肪酸分析

按照上面方法进行提取后，使用Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析（运行参数为：进样口温度为 250℃；载气为高纯 He（纯度高于 99.999%），恒压模式；进样体积为 1μL，分流比为 10:1；柱温箱升温程度如下： 70℃保持 4min，以 25℃ /min速率升温至 195℃，再以 3℃ /min 速率升温至 205℃，然后以 8℃ /min 速率升温至230℃，保持 1min；传输线温度为 250℃；溶剂延迟为 3min；质谱检测模式为全扫描模式，质量数 (m/z)检测范围为 50-550；电离方式为 EI(70eV)离子源温度为 230℃，四极杆温度为 150℃），通过保留时间和特征离子对脂肪酸甲酯进行定性，用内标法通过计算峰面积对各脂肪酸甲酯组分进行定量。

分析方法：采用agilent数据分析分析软件（data analysis）对GCMS的色谱图进行定性分析。其中色谱峰的识别是通过在NIST 数据库（National Institute of Standardand Technology library，NIST，2011，Gaithersburg，MD）中检索比对完成的。通过加入的内标出峰面积对各成分进行换算，并按照匹配度对化合物进行筛选，最后再以细胞数目对数据进行标准化，得到最终数据，其脂肪酸组分含量如下表3。

表3 Heter培养基培养下突变株A4、A11及野生型藻株WT单位脂肪酸含量（ug/mg）

“/”代表没有检测到该成分。

表4 Heter培养基培养下突变株A4、A11相对野生型藻株WT单位脂肪酸含量的提高产量

Heter培养基培养下突变株A4、A11相对野生型藻株WT单位脂肪酸含量对比如图3所示。

利用化学试剂对藻株进行诱变会引起复制过程中的 DNA 突变，从而产生多种生物学性状的变化。

本发明对野生型纤细裸藻采用NTG进行化学诱变，获得突变藻株单藻落后对其进行光合异养培养，以生长速率为指标进行初步筛选，获得较野生藻株生长速率更快、性能较为稳定的突变藻株A4、A11。由图3可见，突变株A4、A11培养到平台期（第9天），其细胞数分别达到1.30×10⁷、1.26×10⁷，相对野生型WT分别提高了23.8%、20%。由表3、表4可见，在对培养9天藻细胞进行脂肪酸分析发现，突变株A4、A11较野生型WT的饱和脂肪酸C12:0、C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C18:0含量提高35% ~50%，不饱和脂肪酸含量提高更为突出，其中，C16:1提高66% ~67%；C18:2，A4提高较为显著，为101.15%；C20:4和C20:5，A11提高量较为显著，分别为104.31%和89.26%；C22:6，A4和A11提高量都非常显著，分别为180.14%和275.75%；而C22:1，在野生型藻株内无检测到，而在突变藻株A4、A11内检测到的含量分别为42.436ug/mg和34.587ug/mg。

Claims

1.一种裸藻培养基，其特征是：包括

PolyA培养基

以及

Heter液体培养基

所述Heter液体培养基中Metals 60A的组分及含量为：

。