CN112877216A - 一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法，属于裸藻纯化技术领域。本发明将含有裸藻细胞的待纯化水样置于光照条件下培养，收集趋光富集的裸藻，离心，收集沉淀；所述光照在待纯化水样的藻液面的侧面施加，所述光照的光线与所述待纯化水样的藻液面的水平夹角≤60°。将富集的裸藻先进行平板滴点纯化，裸藻会较快生长起来，具有种间优势，待其长出来后再进行划线法纯化，能够提高无菌裸藻的纯化效率。
Description
技术领域
本发明涉及裸藻纯化技术领域，尤其涉及一种在琼脂平板上纯化裸藻的 方法。
背景技术
裸藻同时具有动物与植物两种特性。裸藻是研究内共生、叶绿体发育和光合 作用的最佳实验材料。同时裸藻具有很高的商业价值。裸藻含有丰富营养成分： 维生素、矿物营养物、氨基酸、不饱和脂肪酸、叶绿素、黄体素、玉米黄质等59 种人体每天必需的营养元素，均是维持健康所不可缺少的营养素；其中最重要的 裸藻多糖成分是裸藻属的特有成分。裸藻能抑制嘌呤吸收，利用天然的裸藻治疗 痛风也已实现，在喜食海鲜的日本已经获得发明专利，见日本森永制药专利号 4305785。
在春夏之交，裸藻在鱼塘水面可以爆发式生长，容易形成绿色或铁锈红 色的水华。要想得到更多的裸藻种，这就需要对野外裸藻进行分离纯化。近 年来，有较多的研究者发表了关于藻类纯化的文章及专利，根据藻种不同的 生长特性进行纯化。在裸藻纯化方面，比如专利CN108277163A公开了一种 分离纯化裸藻藻种的方法，专利CN107686814A公开了一种平板固体培养基 分离纯化裸藻藻种的方法，这两个专利均描述了将野外裸藻进行富集纯化的 方法，然而这种方法只能做到根据裸藻的耐酸、向光性及抗生素耐受性进行富集纯化，无法获得完全无菌的藻种。现有技术的方法对裸藻进行富集后， 样品中仍含有较多的细菌，传统的方法是使用抗生素平板划线法对裸藻进行 纯化，但这种方法对裸藻的纯度要求较高，在实际操作中难以实现，经常出 现细菌先长出来覆盖了裸藻的生长，难以获得单个裸藻藻落。另外，专利 CN 108277163 A公开了一种分离纯化裸藻藻种的方法，该专利公开了将试 管下部用不透光材料遮盖，上部照射3000lx的光强30min，使裸藻趋光向试 管上部富集，这种方法对光强的要求较高，要求必须是完全适合裸藻生长的 光强，裸藻才会在上部聚集；另外裸藻向上游动过程需要自身提供动力，对 裸藻的活性要求较高，如果裸藻活性不强，无法向上游动，这一方案的在实 际操作中难以实现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法，通过提高平 板上的单位面积的裸藻密度来对裸藻进行分离纯化，提高裸藻纯度，本发明 的方法还具有取样简单的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法，包括以下步骤：
1)将含有裸藻细胞的待纯化水样置于光照条件下培养，收集趋光富集 的裸藻，离心，收集沉淀；所述光照在待纯化水样的藻液面的侧面施加，所 述光照的光线与所述待纯化水样的藻液面的水平夹角≤60°；所述光照的光 照强度为3000～30000lx；
2)采用EM液体培养基对所述沉淀进行清洗，得到待纯化藻液；所述 EM液体培养基还包括氯化钠；所述EM液体培养基中氯化钠的质量浓度为 0.5％～1.5％；所述EM液体培养基的pH值为3～5；
3)采用EM平板培养基对所述待纯化藻液进行滴点纯化，待平板上长 出裸藻藻落，挑取所述裸藻藻落转接EM平板培养基进行平板划线纯化，至 平板上长出无菌的裸藻藻落，完成纯化；所述EM平板培养基的pH值为 3.5～5。
优选的，步骤1)中所述光照的光照强度为8000～20000lx。
优选的，步骤1)中所述离心的转速为2000～4000rpm，所述离心的时间 为0.5～1.5min。
优选的，所述待纯化水样为野外采集获得；所述野外采集的方法包括以 下步骤：取水面裸藻和裸藻下层的水样，对所述水样进行无菌抽滤，收集滤 液，得到无菌下层水样；将水面裸藻用无菌下层水样清洗2～3次，得到清洗 液，对所述清洗液进行离心，收集沉淀后重悬于无菌下层水样中，得到待纯 化水样。
优选的，每次清洗采用的无菌下层水样和水面裸藻的体积比为 (500～1000)：(1～5)。
优选的，步骤2)中所述EM液体培养基替换为所述无菌下层水样。
优选的，步骤2)中所述清洗的次数为2～3次。
优选的，步骤3)中所述EM平板培养基中琼脂的浓度为1.5～2g/100mL。
本发明的有益效果：本发明提供了一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法， 本发明将含有裸藻细胞的待纯化水样置于3000～30000lx的光强下，所述光照 在待纯化水样的藻液面的侧面施加，所述光照的光线与所述待纯化水样的藻 液面的水平夹角≤60°；所述光照的光照强度为3000～30000lx；本发明利用 裸藻向光游动的特点来将裸藻和其他的杂藻和部分细菌分离，起到富集裸藻 的目的。在本发明中，光从藻液面的侧面施加，藻液面两侧形成光强差，裸 藻就会向着光强的方向聚集，本发明对光强要求不高，藻液面形成光强差即可，裸藻侧向游动便于操作。本发明将富集的裸藻先进行平板滴点纯化，裸 藻会较快生长起来，具有种间优势，待其长出来后再进行划线法纯化，能够 提高无菌裸藻的纯化效率。
附图说明
图1为野外裸藻爆发；
图2为裸藻趋光富集及其示意图，其中A为实物图，B为示意图，B中 1表示裸藻趋光富集，2表示侧面灯管，3表示与所述待纯化水样的藻液面的 水平夹角≤60°的光线，4表示藻液；
图3为富集裸藻原液镜检结果；
图4为实施例1中滴点纯化结果；
图5为实施例1中滴点纯化法后平板划线纯化结果；
图6为对比例1中平板划线纯化结果；
图7为对比例2中涂布纯化结果；
图8为实施例1中滴点纯化法后平板纯化结果；对比例3中平行于液面 的光的裸藻富集结果。
图9为实施例1中最终纯化出无菌裸藻藻落。
具体实施方式
本发明提供了一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法，包括以下步骤：
1)将含有裸藻细胞的待纯化水样置于光照条件下培养，收集趋光富集 的裸藻，离心，收集沉淀；所述光照在待纯化水样的藻液面的侧面施加，所 述光照的光线与所述待纯化水样的藻液面的水平夹角≤60°；所述光照的光 照强度为3000～30000lx；
2)采用EM液体培养基对所述沉淀进行清洗，得到待纯化藻液；所述 EM液体培养基还包括氯化钠；所述EM液体培养基中氯化钠的质量浓度为 0.5％～1.5％；所述EM液体培养基的pH值为3～5；
3)采用EM平板培养基对所述待纯化藻液进行滴点纯化，待平板上长 出裸藻藻落，挑取所述裸藻藻落转接EM平板培养基进行平板划线纯化，至 平板上长出无菌的裸藻藻落，完成纯化；所述EM平板培养基的pH值为 3.5～5。
本发明首先将将含有裸藻细胞的待纯化水样置于光照条件下培养，收集 趋光富集的裸藻，离心，收集沉淀；所述光照在待纯化水样的藻液面的侧面 施加，所述光照的光线与所述待纯化水样的藻液面的水平夹角≤60°，藻液 面一侧的光强强于另一侧，两侧形成光强差。在本发明中，所述光照的光照 强度优选为8000～20000lx，进一步优选为10000～15000lx。在本发明中，所 述培养的时间优选为1～1.5d。在本发明中，所述离心的转速优选为 2000～4000rpm，进一步优选为3000rpm，所述离心的时间优选为0.5～1.5min。
在本发明中，限定所述光照在待纯化水样的藻液面的侧面施加，所述光 照的光线与所述待纯化水样的藻液面的水平夹角≤60，光从藻液面的侧面施 加，藻液面两侧形成光强差，裸藻就会向着光强的方向聚集，本发明对对光 强要求不高，藻液面形成光强差即可，裸藻侧向游动便于操作。
在本发明中，所述待纯化的待纯化水样为野外采集获得；所述野外采集 的方法包括以下步骤：取水面裸藻和裸藻下层的水样，对所述水样进行无菌 抽滤，收集滤液，得到无菌下层水样；将水面裸藻用无菌下层水样清洗2～3 次，得到清洗液，对所述清洗液进行离心，收集沉淀后重悬于无菌下层水样 中，得到待纯化水样。在本发明中，每次清洗采用的无菌下层水样和水面裸 藻的体积比优选为(500～1000)：(1～5)，进一步优选为800：(2～3)；所述重悬采用的无菌下层水样的体积和水面裸藻的质量的比例优选为 10mL：(1～5)mg，进一步优选为10mL：(2～3)mg。
得到沉淀后，本发明采用EM液体培养基对所述沉淀进行清洗，得到待 纯化藻液；所述EM液体培养基还包括氯化钠；所述EM液体培养基中氯化 钠的质量浓度为0.5％～1.5％；所述EM液体培养基的pH值为3～5；pH值为 3～5的条件下可以抑制菌生长而不影响裸藻生长。
在本发明中，所述EM液体培养基的配方如表1所示。
表1 EM液体培养基配方
所述Microelem enta的配方参见表2。
表2 Microelem enta的配方
bVitamin B1：准确称量0.05g Vitamin B1，溶于100mL去离子水，过滤 除菌，存于4℃冰箱。
cVitamin B12：准确称量0.05g Vitamin B12，溶于1L去离子水，过滤 除菌，存于4℃冰箱。
在本发明中，所述EM液体培养基中氯化钠的质量浓度优选为1％；所 述氯化钠的作用是维持裸藻细胞的渗透压和杀菌。
在本发明中，所述EM液体培养基替换为无菌下层水样。
在本发明中，所述液体培养基的pH值优选为3.8～4.5。
在本发明中，所述清洗的方式优选为将所述沉淀重悬于EM液体培养基， 得到重悬液，对所述重悬液离心，再次收集沉淀；所述清洗的次数优选为2～3 次。在本发明中，所述离心的转速优选为2000～4000rpm，进一步优选为 3000rpm，所述离心的时间优选为0.5～1.5min。
得到待纯化藻液后，本发明采用EM平板培养基对所述待纯化藻液进行滴点 纯化，待平板上长出裸藻藻落，挑取所述裸藻藻落转接EM平板培养基进行 平板划线纯化，至平板上长出无菌的裸藻藻落，完成纯化；所述EM平板培 养基的pH值为3.5～5。在本发明中，所述EM平板培养基是在EM液体培养 基的基础上加入琼脂；所述琼脂的浓度优选为1.5～2g/100mL。在本发明中， 所述EM平板培养基的pH值优选为3.8～4.4。在本发明中，所述滴点纯化的 次数优选为2～3次，以平板上裸藻和菌的数量比大于9：1为准。
在本发明中，滴点纯化能够浓缩裸藻细胞，增大裸藻细胞与细菌的竞争 能力，增大了藻/菌的比例。
在本发明中，所述EM平板培养基琼脂的浓度分别优选为 1.5～2g/100mL。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整 地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、义乌佛堂裸藻野外爆发时(如图1所示)，水面会有一层油膜含较 高浓度的裸藻，刮取表面油膜1～5mL，再取下层水样0.5～1L，将1mL收集 的上层油膜用经过无菌抽滤的下层水样清洗2～3遍，3000rpm，30s离心并且 用10mL进行重悬，放在3000lx的光强下培养1天，光是侧面施加，平行于 藻液面，裸藻侧向游动富集(如图2所示)；
2、将趋光富集的裸藻收集，3000rpm，1min，收集沉淀；根据观察的裸 藻的生长情况，及时重复1～2步的操作。直至裸藻富集到在显微镜下90％为 裸藻时，进行下一步平板纯化(如图3所示)。
3、用质量浓度为1g/100mL的氯化钠水溶液清洗2遍所述沉淀，当沉淀 中细胞浓度>106个/mL时，将清洗后的沉淀用100μl pH值为3.5的EM液体 培养基重悬；
4、取上述初步纯化的裸藻20μL，用含1.5g/100mL琼脂的pH值为3.5 的EM平板培养基滴点纯化，如图4所示，第一次时藻会在中间长出藻落， 细菌在周边。
5、7天后，观察平板上长出裸藻藻落。挑取所述裸藻藻落转接至pH值 为5的EM平板培养基进行平板划线纯化，如图5所示。
6、7天后，平板上长出裸藻藻落，重新挑取藻落进行平板划线纯化，重 复3次后获得完全无菌藻落(如图9所示)。
对比例1
除将步骤4中的滴点纯化替换为平板划线纯化之外，其余同实施例1。 如图6所示，菌比藻多，完全覆盖了藻的生长。
对比例2
除将步骤4中的滴点纯化替换为涂布纯化之外，其余同实施例1。(如 图7所示，菌完全覆盖了藻的生长。)
对比例3
将步骤1中裸藻富集的光改为裸藻液面正上方，光线与裸藻液面垂直。 (如图8所示，裸藻难以趋光富集)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种在琼脂平板上纯化裸藻的方法，包括以下步骤：
1)将含有裸藻细胞的待纯化水样置于光照条件下培养，收集趋光富集的裸藻，离心，收集沉淀；所述光照在待纯化水样的藻液面的侧面施加，所述光照的光线与所述待纯化水样的藻液面的水平夹角≤60°；所述光照的光照强度为3000～30000lx；
2)采用EM液体培养基对所述沉淀进行清洗，得到待纯化藻液；所述EM液体培养基还包括氯化钠；所述EM液体培养基中氯化钠的质量浓度为0.5％～1.5％；所述EM液体培养基的pH值为3～5；
3)采用EM平板培养基对所述待纯化藻液进行滴点纯化，待平板上长出裸藻藻落，挑取所述裸藻藻落转接EM平板培养基进行平板划线纯化，至平板上长出无菌的裸藻藻落，完成纯化；所述EM平板培养基的pH值为3.5～5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述光照的光照强度为8000～20000lx。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述离心的转速为2000～4000rpm，所述离心的时间为0.5～1.5min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待纯化水样为野外采集获得；所述野外采集的方法包括以下步骤：取水面裸藻和裸藻下层的水样，对所述水样进行无菌抽滤，收集滤液，得到无菌下层水样；将水面裸藻用无菌下层水样清洗2～3次，得到清洗液，对所述清洗液进行离心，收集沉淀后重悬于无菌下层水样中，得到待纯化水样。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每次清洗采用的无菌下层水样和水面裸藻的体积比为(500～1000)：(1～5)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述EM液体培养基替换为所述无菌下层水样。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述清洗的次数为2～3次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述EM平板培养基中琼脂的浓度为1.5～2g/100mL。
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