CN110055209B - 一种泰来藻原生质体的制备方法 - Google Patents

一种泰来藻原生质体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种泰来藻原生质体的制备方法，属于植物细胞工程领域。该制备方法包括以下步骤：包括以下步骤：S1：取泰来藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后切成的块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织；S4：将S3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；S5：将S4中得到的过滤液离心，弃上清液，用重悬溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；S6：将S5中得到的沉淀用重悬溶液悬浮，得到泰来藻原生质体。本发明首次建立了泰来藻原生质体的制备方法，该方法获得的泰来藻原生质体产量高、存活率高。

Description

一种泰来藻原生质体的制备方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种泰来藻原生质体的制备方法。
背景技术
海草是一种生活在热带和温带海域浅海中的单子叶大型沉水植物，属于沼生目。它们具有高等植物的一般特征，能够在水中完成生活史。海草的初级生产力很高，是浅海水域生态系统——海草场的重要组成。海草场资源独特，其生态经济价值主要表现在：(1)海草可以加快海水中的悬浮物的沉降、吸收海水中的营养盐和重金属等，进而改善水质；(2)海草通过减缓水流，进而增加水中悬浮物的沉降，达到稳定底质的效果；(3)海草场为众多海洋生物供庇护场所、栖息地、育幼以及觅食场所；(4)海草场能够维持全球碳、氮、磷平衡；(5)海草是提炼碘、铁、钙、氯化钾等物质的廉价原料。
我国的海草分布可分为北方海域海草分布区和南方海域海草分布区。北方海域分布区包括辽宁、河北、天津和山东等省市沿海，约含有3属9种3属9种；南方海域分布区包括海南省、广西壮族自治区、广东省、香港特别行政区、台湾省和福建省沿海，约含有9属15种。海南是中国海草场分布面积最大的省份，占我国海草总面积的64％，海草场主要集中于东部沿岸，如文昌、琼海、陵水、三亚。其中，陵水黎安港以泰来藻作为优势种。近年来，受自然因素和人类活动干扰的影响，我国海草场迅速缩减，许多优质海草资源受到严重破坏、繁殖率降低。
原生质体是植物细胞中除细胞壁以外的被细胞膜包围的“裸露细胞”，能够长成一个完整的植株个体，具有胚性。可应用于构建胞质杂种、克服有性杂交障碍、培育植物新品种。另外，原生质体为植物学研究、作物遗传改良和种质资源保存提供了极为有利的试验材料。目前，已有通过酶解法从海草中分离出原生质体的报道。比如，崔翠菊等人使用浓度为20g/L的纤维素酶和浓度为5g/L果胶酶分离得到大叶藻原生质体(大叶藻原生质体的分离和培养.水产科学,2014,33(8),508-511.)；Baleststri E等人使用1w/v％纤维素酶、0.5w/v％半纤维素酶和1w/v％果胶酶分离得到大洋聚伞藻和海神草(Isolation and cell wallregeneration of protoplasts from Posidonia oceanica and Cymodoceanodosa.Aquatic Botany,2001(70),237–242.)。但是，目前公开的资料中未见有针对泰来藻原生质体制备方面的研究。此外，由于不同海草细胞壁中成分、含量的差异以及诸多因素影响植物原生质体的制备和活力，利用现有方法制备得到的泰来藻原生质体产量不理想、存活率较低。
因此，需要探索一种高效降解泰来藻细胞壁、制备原生质体的方法。
发明内容
针对现有技术中尚无泰来藻原生质体制备方法的问题，本发明提供了一种泰来藻原生质体的制备方法。
本发明提供的泰来藻原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1：取泰来藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；
S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；
S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后切成块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织；
S4：将S3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；
S5：将S4中得到的过滤液离心，弃上清液，用重悬溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；
S6：将S5中得到的沉淀用重悬溶液悬浮，得到泰来藻原生质体。
优选地，所述的步骤S1中暂养的条件为：温度20-25℃、光照强度800-1200lx、光照时间8-12小时/天，暂养的时间为1-3天，培养基包括24.3mg/L NaNO3、3.75mg/L KH2PO4；进一步优选地，所述的暂养条件为：温度22℃、光照强度1000lx、光照时间10小时/天，暂养的时间为2天。
优选地，所述的步骤S2中的预处理液包括：0.1-0.2g/L胰蛋白酶和30-50mmol/LDTT，所述的浸泡时间为2-6小时；进一步优选地，所述的预处理液包括：0.15g/L胰蛋白酶和40mmol/L DTT，所述的浸泡时间为4小时。
优选地，所述的步骤S3中的酶液包括：10-30g/L纤维素酶R-10、3-8g/L离析酶R-10、5-10％(v/v)自制海螺酶和0.2-0.8mol/L山梨醇，pH值为5.0-6.0。
优选地，所述的步骤S3中的酶解条件为23-27℃、100-140rmp摇床进行黑暗酶解6-12小时；进一步优选地，所述的酶解条件为25℃、120rmp恒温摇床进行黑暗酶解10小时。
优选地，所述的步骤S5中的重悬溶液为无菌海水配制的0.5-2.0mol/L葡萄糖溶液；进一步优选地，所述的重悬溶液为1.0mol/L葡萄糖溶液。
优选地，所述的步骤S6中的离心速度为800rmp，离心时间为10min。
以上技术方案均能够实现本发明所述的技术效果，但在一些优选的实施方案中，所达到的技术效果优于其他方案。
例如：当步骤S3中所述酶液中纤维素酶R-10和离析酶R-10的比例为4:1时，其中一个优选的酶液包括：24g/L纤维素酶R-10、6g/L离析酶R-10、6％(v/v)自制海螺酶和0.7mol/L山梨醇，pH值为5.5。。
最优选地，所述酶液包括：20g/L纤维素酶R-10、5g/L离析酶R-10、8％(v/v)自制海螺酶和0.5mol/L山梨醇，pH值为5.5。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明使用预处理液提前处理泰来藻幼叶，针对泰来藻复杂的细胞壁结构，采用胰蛋白酶和DTT组成的预处理液，提高了原生质体制备率，使用本方法制备得到的原生质体产量可达产量最高可达0.95×106个/g、存活率可达60.54％。
(2)本发明使用纤维素酶、离析酶和自制海螺酶对泰来藻进行酶解，并添加山梨醇形成稳定的渗透压，维持原生质体活性。
(3)本发明首次建立了泰来藻原生质体制备方法，该方法简单、有效，制备得到的原生质体得率较高、完整性好，为利用原生质体进行蛋白亚细胞定位、蛋白相互作用、基因表达调控及亚细胞器制备等研究奠定了基础。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本说明书中所述实施例1-4及对比例1-4采用的实验材料、试剂和方法如下：
1.实验材料
泰来藻幼叶。泰来藻(Thalassia hemprichii)，采自海南陵水黎安港，保存于中国海洋大学大型海藻种质资源库。
2.主要试剂的配制
(1)暂养培养基：用无菌海水配制，各组分浓度24.3mg/L NaNO3、3.75mg/L KH2PO4，0.22μm微孔过滤膜除菌后使用。
(2)预处理液：于无菌海水中分别加入胰蛋白酶和DTT，0.22μm微孔过滤膜除菌后使用。
(3)酶液：于无菌海水中分别加入纤维素酶R-10、离析酶R-10、自制海螺酶和山梨醇，pH值为5.0-6.0。
(4)自制海螺酶：选取海螺的消化腺，加入等体积的无菌海水，捣碎后放入4℃静置24h，10000rmp离心取上清即为所得酶液。
(5)重悬溶液为无菌海水配制的0.5-2.0mol/L葡萄糖溶液，0.22μm微孔过滤膜除菌后使用。
3.实验方法
3.1原生质体的制备
以2g泰来藻幼叶为例，具体步骤如下：
S1：取泰来藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；
S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；
S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后，将原材料2切成0.2cm2的小块，加入10mL酶液进行酶解，得到酶解组织；
S4：将S3中得到的酶解组织用200目筛绢进行过滤，得到过滤液；
S5：将S4中得到的过滤液于800rmp离心10min，弃上清液，用重悬溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；
S6：将S5中得到的沉淀用重悬溶液悬浮，得到泰来藻原生质体。
3.2原生质体的检测
用0.1％VBL型荧光增白剂对所得原生质体进行染色5min，于荧光显微镜下观察，激发光波长为370nm紫外光。有细胞壁的细胞由于纤维素的存在会呈现蓝绿色荧光；原生质体由于叶绿体的存在会呈现红色荧光且外围无蓝绿色荧光。
3.3原生质体的产量测定
将收集得到的原生质体用重悬溶液稀释，滴加在血球计数板上，在光学显微镜下观察计数，每个样品重复计数3次，最后计算原生质体的产量。
使用的血球计数板为25x16规格，每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
具体步骤如下：
(1)首先在显微镜下检查计数板上的计数室是否干净，若沾有污物，须用酒精棉轻轻擦洗，用蒸馏水冲净，再用吸水纸吸干；
(2)将盖玻片盖在计数室上面；
(3)取10μL原生质体悬浮液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室，直到充满计数室为止；
(4)计数时要使显微镜载物台保持水平，不能倾斜。分别统计计数室内4个角中格及中央中格(共五个中格)的原生质体数量，然后根据以下公式求出原生质体数含量及产量。
原生质含量(个/mL)＝5个中格内原生质体总数×5×10000×稀释倍数
原生质体产量(个/g)＝原生质含量(个/mL)×稀释后体积(mL)/材料鲜重(g)
(5)计数完毕后，将计数板洗净吸干。
3.4原生质体的活力测定
取10μL原生质体悬浮液，加入1μL 0.5％Evans Blue染色，摇匀放置1min，静置后在荧光显微镜下观察，活的原生质体呈绿色，死细胞呈深蓝色。
原生质体的活力＝(未被染色的原生质体数/原生质体总数)*100％
4.实施例及对比例
表1各步骤中关键点的实施例
Figure BDA0001994187330000061
Figure BDA0001994187330000071
对比例1
与实施例1相比，仅缺少预处理步骤。
对比例2
与实施例1相比，预处理液中仅缺少胰蛋白酶。
对比例3
与实施例1相比，预处理液中仅缺少DTT。
对比例4
与实施例3相比，仅缺少预处理步骤。
对比例5
中国专利CN 101768568 B所述的制备方法。
5.实验结果
泰来藻原生质体产量(个/g) 泰来藻原生质体的活力
实施例1 0.74±0.12×10<sup>6</sup> 51.74±0.75％
对比例1 0.42±0.08×10<sup>6</sup> 40.02±1.01％
对比例2 0.62±0.03×10<sup>6</sup> 45.33±0.75％
对比例3 0.65±0.02×10<sup>6</sup> 47.15±1.0％
实施例2 0.79±0.07×10<sup>6</sup> 52.44±0.49％
实施例3 0.95±0.04×10<sup>6</sup> 60.54±1.21％
对比例4 0.45±0.02×10<sup>6</sup> 42.32±0.98％
实施例4 0.81±0.05×10<sup>6</sup> 57.55±0.67％
对比例5 0.31±0.09×10<sup>6</sup> 27.53±2.22％
综上所述，本制备方法提供的含有胰蛋白酶和DTT的预处理液，提高了原生质体制备率，使用本方法制备得到的泰来藻原生质体产量最高可达0.95×106个/g、存活率可达60.54％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种泰来藻原生质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：选取泰来藻幼叶，用无菌海水清洗后暂养，得到原材料1；
S2：将S1中得到的原材料1放入预处理液中浸泡，得到原材料2；所述的预处理液包括：0.1-0.2g/L胰蛋白酶和30-50mmol/LDTT；所述的浸泡时间为2-6小时；
S3：取出S2中得到的原材料2，吸干水分后切成块，加入酶液进行酶解，得到酶解组织；所述的酶液包括：10-30g/L纤维素酶R-10、3-8g/L离析酶R-10、5-10%(v/v)自制海螺酶和0.2-0.8mol/L山梨醇，pH值为5.0-6.0；所述自制海螺酶制备方法如下：选取海螺的消化腺，加入等体积的无菌海水，捣碎后放入4℃静置24h，10000rpm离心取上清即为所述自制海螺酶；S4：将S3中得到的酶解组织过滤，得到过滤液；
S5：将S4中得到的过滤液离心，弃上清液，用重悬溶液悬浮沉淀，离心，弃上清液，得到沉淀；
S6：将S5中得到的沉淀用重悬溶液悬浮，得到泰来藻原生质体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S1中暂养的条件为：温度20-25℃、光照强度800-1200lx、光照时间8-12小时/天，暂养的时间为1-3天，培养基包括24.3 mg/LNaNO3、3.75 mg/LKH2PO4。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S2中的预处理液包括：0.15g/L胰蛋白酶和40mmol/LDTT；所述的浸泡时间为4小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中的酶液包括：20 g/L纤维素酶R-10、5 g/L离析酶R-10、8%(v/v)自制海螺酶和0.5mol/L山梨醇，pH值为5.5。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中的酶解条件为酶解条件为23-27℃、100-140 rpm摇床进行黑暗酶解6-12小时。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中的酶解条件为25℃、120 rpm恒温摇床进行黑暗酶解10小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S5中的重悬溶液为无菌海水配制的0.5-2.0mol/L葡萄糖溶液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S5中的过滤液离心的速度为800rpm，离心时间为10min。
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