CN108277163A - 一种分离纯化裸藻藻种的方法 - Google Patents

一种分离纯化裸藻藻种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离纯化裸藻藻种的方法，其通过选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，加入一定量合适裸藻生长的无机培养基，然后调节藻液的pH至3‑4，3000‑30000lx的光强下培养2‑7d；然后，将藻液进行稀释，放入特定容器中，在培养装置的某部分施加2000‑5000lx的光照一定时间，在照光部分吸取一定量的藻液，接入培养孔板中培养。通过这种方式，在短时间内得到纯度较高的藻种，缩短生长周期，提高大规模生长的成功几率。

Description

一种分离纯化裸藻藻种的方法
技术领域
本发明涉及微藻藻种纯化技术领域，尤其涉及一种分离纯化裸藻藻种的方法。
背景技术
裸藻生活在淡水中，常在湖泊河沟形成绿色水华，尤其是有机质比较丰富的水域较为常见，在水面形成一层绿色的水膜，并随外界的光照等情况变化而形成或散开。裸藻无细胞壁，有一根长鞭毛，通过鞭毛和细胞扭动进行运动，胞内有叶绿体，可依靠光合作用进行自养，同时也可以利用有机物(如葡萄糖、谷氨酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸和乙醇)营异养，在自然界中通常是同时进行光养和异养。裸藻体型呈长棒状，宽度一般为10-20μm，长度可达100μm；具有眼点一个，对光照较为敏感(趋光性/避光性)；裸藻的体型也会随着外界光照等情况改变，如在深夜会变成圆球状；其繁殖方式为无性纵裂分裂。
裸藻是一种介于动、植物两者之间的中间型生物，具有动、植物的蛋白质组成，是良好的饵料生物；2013年，我国批准裸藻为新的食品原料，这使得裸藻具有很好的市场前景。
培养时，不管是利用光生物反应器进行自养培养还是利用发酵罐进行异养培养，都要求裸藻比较“纯”。目前报道的藻种藻种纯化方法主要有显微镜挑取藻细胞和藻液添加抗生素除菌，前者操作复杂，对操作人员的技术要求较高，需要一定的藻类分类经验，同时单个藻细胞的培养难度较大，不易成活；后者在藻液中直接加入抗生素，虽然能够有效的抑制藻液中杂菌，但是无法完全除菌还会影响藻类生长甚至诱导突变。因此，开发一种适用于裸藻藻种的快速、有效获得裸藻纯种的方法显得十分必要。
与现有技术相比，本发明提供了一种高效、简易分离纯化裸藻藻种的方法，从而获得无细菌污染的裸藻藻种，起到降低藻种维护成本和快速获得批量藻种的目的。
发明内容
有鉴于裸藻藻种筛选时间长及传代过程及规模培养过程中极易染菌的问题，本发明利用酸化、光诱导等措施，提供了一种成本低廉、操作简易的藻种纯化程序，从而达到快速获得裸藻纯种、适应规模化裸藻生产的目的。
为实现上述目的，本发明提供了一种分离纯化裸藻藻种的方法，包括以下步骤：
A、选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，接入按配好的营养盐得到的无菌培养基后，用酸调节pH值至酸性范围，在调好的光强条件下培养；
B、步骤A得到的藻液经收集后进行稀释，然后转入新的灭菌培养装置中，；
C、将培养装置的部分区域按给定量的光强施加照射；
D、取部分藻液，稀释后，接种在培养孔板中进行培养；
E、将培养孔板中的藻株进行镜检和菌类检测，即可挑选出纯种藻株。
进一步地，步骤A中的营养盐包含的成分为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L。
更进一步地，步骤A采用的酸为包括硫酸、盐酸、硝酸或磷酸的无机酸，配置成1M浓度。
更进一步地，步骤A中调节藻液的pH值范围为3-4。
更进一步地，步骤A中培养采用的光强为2000-30000lx，在调好的光强条件下，以及在静置处理或者通入空气或混合气体的条件下，培养2-7d。
进一步地，步骤B中，对藻液用无菌水或生理盐水将藻细胞浓度稀释成10-103个/mL，培养装置选用无菌试管或大培养皿。
进一步地，步骤C中，将培养装置的一部分用不透光材料遮盖，另外一部分施加2000-30000lx的光强；光强处理时间为15min-2h。
进一步地，步骤D中，采用无菌培养基进行稀释，其中的营养盐组成同步骤A；藻液浓度稀释成10-103个/mL；从照光部位取液体50-300μl，接种于无菌培养孔板中。
根据如上所述的分离纯化裸藻藻种的方法，本发明还提供了一个优选方案，具体包括以下步骤：
A、选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，加入营养盐，其配方为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，接入无菌培养基后，用酸调节pH值至3.5，在2000-5000lx光强条件下，静置，通入空气，混合空气培养3d；
B、步骤A得到的藻液，经收集后进行稀释，将藻细胞浓度稀释成10-102个/mL，随后培养，采用100mL试管，；
C、将试管下部用不透光材料遮盖，上部照射2000-5000lx的光强15-30min；
D、取50-100μL藻液，稀释后，接种在培养孔板中进行培养，培养条件为：光照度300-3000lx，温度22-25℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养2-5d；
E、将培养孔板中的藻株进行镜检和菌类检测，即可挑选出纯种藻株。
更优选地，本发明提供的优选方案，具体包括以下步骤：
A、选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，加入营养盐，其配方为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，接入无菌培养基后，用1M的HCl调节pH值至3.5，在3000lx光强条件下，通入含有CO2 5％的混合气体培养3d，培养温度为25±2；℃
B、步骤A得到的藻液，经收集后进行稀释，将藻细胞浓度稀释成10-102个/mL，随后培养，培养装置采用100mL试管；
C、将试管下部用不透光材料遮盖，上部照射3000lx的光强30min；
D、取100μL藻液，稀释后，接种在培养孔板中进行培养，培养条件为：光照度2500lx，温度25℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养3d；
E、将培养孔板中的藻株进行镜检和菌类检测，即可挑选出纯种藻株。
本发明所带来的有益技术效果为：
本发明利用裸藻细胞体积较大、对酸度有较好的耐受性(可耐受pH为3左右)、具有眼点和鞭毛，具有趋光性(避光性)等特点，利用酸化条件筛选、趋光性筛选等综合措施，在1-2周左右的时间内得到纯度较高的藻种，远比平板划线等措施所需的2-3个月的时间要短；筛选过程中不使用抗生素，不会诱化藻种突变，便于维持藻种性状稳定。
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
实施例1
自然水样。在野外取样，某水域中裸藻细胞大量生长，为优势种群。从该水域中取样500mL。
(1)回到实验室，将水样加入无菌三角瓶，接入营养盐，配方为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；用1M的HCl调节上述藻液pH为3.5，3000lx的光强，12h/d光照，通入含CO25％的混合气体(0.3vvm)进行培养，培养温度为25±2℃，培养时间为3d。
(2)取样镜检并初步估算藻细胞浓度，按照估算的浓度，用无菌水将藻液浓度稀释到10-100个/mL，将藻液转入无菌试管中。
(3)试管上半部从侧面施加3000lx的光照约30min。
(4)从试管有光部分取样，96孔板中每孔加入100μL的藻液，在光强约2500lx，温度25±2℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养3d。
(5)镜检，发现，96孔板中几乎都为单一的裸藻细胞，菌类检测结果显示，大多数的培养孔中无杂菌。
(6)挑选纯种藻接入50mL三角瓶中静置培养。
上述实验室内操作，(1)-(6)接藻处理过程都在超净工作台内进行。
通过上述步骤，我们从野外采集的水样中分离得到了纯种的裸藻藻株，总共用时约1周。
实施例2：
自然水样。在野外取样，某水域中有裸藻细胞，裸藻细胞、某些绿藻和硅藻同为优势藻株。从该水域中取样500mL。
(1)回到实验室，将水样加入无菌三角瓶，接入营养盐：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；用1M的HCl调节上述藻液pH为3.5，3000lx的光强，12h/d光照，通入含CO25％的混合气体(0.3vvm)进行培养，培养温度为25±2℃，培养时间为3d。取样镜检发现，仍然有较多的绿藻和硅藻，裸藻细胞基本成为了优势藻种(50％左右)，为了试验方便，调节藻液pH为3，继续培养3d，此时发现主要藻种为裸藻。
(2)取样镜检并初步估算藻细胞浓度，按照估算的浓度，用无菌水将藻液浓度稀释到10-100个/mL，将藻液转入无菌试管中。
(3)试管上半部从侧面施加3000lx的光照约30min。
(4)从试管有光部分取样，96孔板中每孔加入100μL的藻液，在光强约2500lx，温度25±2℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养3d。
(5)镜检，发现，96孔板中几乎都为单一的裸藻细胞，菌类检测结果显示，大多数的培养孔中无杂菌。
(6)挑选纯种藻接入50mL三角瓶中静置培养。
通过上述步骤，我们从野外采集的水样中分离除了纯种的裸藻藻株，总共用时约9d。
实施例3：
自然水样。在野外取样，某水域中有裸藻细胞，但优势藻种为绿藻和硅藻。从该水域中取样500mL。
(1)回到实验室，将水样加入无菌三角瓶，接入营养盐：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；用1M的HCl调节上述藻液pH为3.5，3000lx的光强，12h/d光照，通入含CO25％的混合气体(0.3vvm)进行培养，培养温度为25±2℃，培养时间为3d。取样镜检发现，仍然有较多的绿藻和硅藻，裸藻细胞基本成为了优势藻种(30％左右)，为了试验方便，调节藻液pH为3，继续培养4d，此时发现主要藻种为裸藻。
(2)取样镜检并初步估算藻细胞浓度，按照估算的浓度，用无菌水将藻液浓度稀释到10-100个/mL。
(3)试管上半部从侧面施加3000lx的光照约30min。
(4)从试管有光部分取样，96孔板中每孔加入100μL的藻液，在光强约2500lx，温度25±2℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养3d。
(5)镜检，发现，96孔板中几乎都为单一的裸藻细胞，菌类检测结果显示，大多数的培养孔中无杂菌。
(6)挑选纯种藻接入50mL三角瓶中静置培养。
通过上述步骤，我们从野外采集的水样中分离纯化了裸藻藻株，总共用时约10d。
实施例4：
本藻株来自于本公司自己保存的裸藻藻株。镜检显示，该藻株为单一藻株；菌类检测结果表明，该藻有细菌污染。
(1)直接将该藻样接入三角瓶中，接入营养盐：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L；用1M的HCl调节上述藻液pH为3.5，3000lx的光强，12h/d光照，通入含CO2 5％的混合气体(0.3vvm)进行培养，培养温度为25±2，℃培养时间为3d。
(2)取样镜检并初步估算藻细胞浓度，按照估算的浓度，用无菌水将藻液浓度稀释到10-100个/mL。
(3)试管上半部从侧面施加3000lx的光照约30min。
(4)从试管有光部分取样，96孔板中每孔加入100μL的藻液，在光强约2500lx，温度25±2，℃光暗比L:D＝12h:12h，培养3d。
(5)镜检，发现，96孔板中几乎都为单一的裸藻细胞，菌类检测结果显示，大多数的培养空中无杂菌。
(6)挑选纯种藻接入50mL三角瓶中静置培养。
通过上述步骤，我们将试验室有细菌污染的裸藻藻株进行了纯化，总共用时约6d。
与现有技术相比，本发明提供了一种高效、简易分离纯化裸藻藻种的方法，从而获得无细菌污染的裸藻藻种，起到降低藻种维护成本、快速获得批量藻种以及规模化裸藻生产的目的；在1-2周左右的时间内得到纯度较高的藻种，远比平板划线等措施所需的2-3个月的时间要短；筛选过程中不使用抗生素，不会诱化藻种突变，便于维持藻种性状稳定。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，接入按配好的营养盐得到的无菌培养基后，用酸调节pH值至酸性范围，在调好的光强条件下培养；
B、步骤A得到的藻液经收集后进行稀释，然后转入新的灭菌培养装置中；
C、将培养装置的部分区域按给定量的光强施加照射；
D、取部分藻液，稀释后，接种在培养孔板中进行培养；
E、将培养孔板中的藻株进行镜检和菌类检测，即可挑选出纯种藻株。
2.如权利要求1所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤A中的营养盐包含的成分为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB12 0.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L。
3.如权利要求2所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤A采用的酸为包括硫酸、盐酸、硝酸或磷酸的无机酸，配置成1M浓度。
4.如权利要求3所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤A中调节藻液的pH值范围为3-4。
5.如权利要求4所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤A中培养采用的光强为2000-30000lx，在调好的光强条件下，以及在静置处理或者通入空气或混合气体的条件下，培养2-7d。
6.如权利要求1所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤B中，对藻液用无菌水或生理盐水将藻细胞浓度稀释成10-103个/mL，培养装置选用无菌试管或大培养皿。
7.如权利要求1所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤C中，将培养装置的一部分用不透光材料遮盖，另外一部分施加2000-30000lx的光强；光强处理时间为15min-2h。
8.如权利要求1所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，步骤D中，采用无菌培养基进行稀释，其中的营养盐组成同步骤A；藻液浓度稀释成10-103个/mL；从照光部位取液体50-300μl，接种于无菌培养孔板中。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，加入营养盐，其配方为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，接入无菌培养基后，用酸调节pH值至3.5，在2000-5000lx光强条件下，以及在静置处理或者通入空气或混合气体的条件下，培养3d；
B、步骤A得到的藻液，经收集后进行稀释，将藻细胞浓度稀释成10-102个/mL，随后培养，培养装置采用100mL试管；
C、将试管下部用不透光材料遮盖，上部照射2000-5000lx的光强15-30min；
D、取50-100μL藻液，稀释后，接种在培养孔板中进行培养，培养条件为：光照度300-3000lx，温度22-25℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养2-5d；
E、将培养孔板中的藻株进行镜检和菌类检测，即可挑选出纯种藻株。
10.如权利要求9所述的分离纯化裸藻藻种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、选取含有裸藻细胞的水样或含有杂菌的裸藻藻液，加入营养盐，其配方为：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸钠1g/L，VB1 10μg/L，VB120.1μg/L，氯化铁0.588mg/L，氯化锰0.108mg/L，硫酸锌0.078mg/L，氯化钴0.012mg/L，钼酸钠0.0075mg/L，接入无菌培养基后，用1M的HCl调节pH值至3.5，在3000lx光强条件下，通入含有CO2 5％的混合气体培养3d，培养温度为25±2；℃
B、步骤A得到的藻液，经收集后进行稀释，将藻细胞浓度稀释成10-102个/mL，随后培养，培养装置采用100mL试管；
C、将试管下部用不透光材料遮盖，上部照射3000lx的光强30min；
D、取100μL藻液，稀释后，接种在培养孔板中进行培养，培养条件为：光照度2500lx，温度25℃，光暗比L:D＝12h:12h，培养3d；
E、将培养孔板中的藻株进行镜检和菌类检测，即可挑选出纯种藻株。
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