CN112725187A - 一种简单高效的单胞藻分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，本发明通过在光学显微镜下，用血球计数板准确测定待分离纯化藻液的单胞藻细胞密度，再用消毒的沙滤海水将藻液稀释至单胞藻细胞密度为20～30cells/mL，根据待分离纯化藻液中杂藻细胞和敌害生物的数量，吸取1～3滴经稀释的藻液滴入装有单胞藻培养液的玻璃试管中，在光照充足且没有阳光直射的地方培养10～15天，经过镜检，筛选得到纯化的、无杂藻细胞和敌害生物的单胞藻。本发明的方法操作简单，对操作人员的专业度要求极低，适用场所广泛，既适合条件良好的实验室又适合条件简陋的养殖场，且分离纯化成功率达到100％，可保证单胞藻纯种培养、长期保存。
Description
技术领域
本发明涉及单胞藻养殖领域，具体地，涉及一种简单高效的单胞藻分离纯化方法。
背景技术
作为饵料的单胞藻在经济养殖品种种苗培育中得到广泛应用，但单胞藻保种及接种过程中经常发生杂藻细胞或敌害生物污染的现象，导致单胞藻不能正常生长和死亡，因此，需要对藻种进行分离纯化以保证单种培养和正常生长繁殖，才可适用于扩大规模的生产性培养。
传统的单胞藻分离纯化方法主要是水滴法和平板分离法。水滴法中，用毛细吸管吸取稀释后的藻液，在载波片上分散地滴4～5个微水滴，再在显微镜下镜检每个微水滴中单胞藻细胞、敌害生物和杂藻细胞的情况，将有单胞藻细胞、无敌害生物和杂藻细胞的微水滴用微吸管吸取并移入到装有培养液的试管中培养，但水滴法存在以下三点不足：(1)为了保证每个水滴中只有一个细胞，藻液要先进行适当稀释，稀释的程度需要根据微水滴中藻细胞数量不断调整，操作繁琐，过程较长；(2)由于该方法中水分易蒸发，微水滴盐度剧烈升高，导致单胞藻细胞易收缩变形甚至死亡，降低了成功率；(3)不能保证微水滴中的单胞藻细胞被微吸管准确吸取，可能还残留在载玻片上，进一步降低了成功率。基于此，专利CN107384794A对水滴法进行了进一步改进，将每滴水样单独滴在一个可直接放入培养试管中的小规格承载片上，经镜检挑选后，将选中的所述承载片直接放入所述培养试管中进行培养，该专利的方法弥补了上述第三点不足，但仍存在前两点不足。此外，单胞藻的另一种分离纯化方法——平板分离法中，用接种环蘸取藻液轻轻在含有单胞藻营养盐的琼脂培养基上划线，使藻细胞在线上连续稀释，单个单胞藻细胞生长繁殖成单胞藻细胞群落后，置于试管中培养，然而平板的制备过程比较麻烦，且琼脂培养基中的水分易在长达10～15天的分离纯化过程中蒸发变干，导致单胞藻细胞收缩变形甚至死亡。
可见，现有的单胞藻分离纯化方法成功率极低，而且仅能在良好的实验室条件下进行，难以在条件简陋的养殖场开展，分离纯化后的单胞藻也难以长期保存，因此，开发一种操作简单，纯化成功率高，适用场所广泛的单胞藻分离纯化方法对于单胞藻养殖领域具有相当的必要性。
发明内容
本发明旨在克服现有单胞藻分离纯化方法的不足，提供一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，本发明的方法操作简单，对操作人员的专业度要求极低，适用场所广泛，既适合条件良好的实验室又适合条件简陋的养殖场，且分离纯化成功率达到100％，可保证单胞藻纯种培养、长期保存。
因此，本发明的第一个目的是提供一种简单高效的单胞藻分离纯化方法。
本发明的另一目的是提供上述方法在分离纯化海水单胞藻方面的应用。
为实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：
本发明提供了一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，包括以下步骤：
S1.培养液配制：在沙滤海水中加入硝酸钠、磷酸二氢钾、硅酸钠、柠檬酸铁，使其浓度分别为30×10-6～50×10-6mg/L、3×10-6～5×10-6mg/L、1×10-6～2×10-6mg/L、0.1×10-6～0.2×10-6mg/L，制成培养液；
S2.试管分装：将步骤S1所述培养液倒入洁净的玻璃试管中，所述培养液的体积为试管容积的1/4～1/3，试管置于金属试管架上；
S3.高温消毒：将步骤S2所述金属试管架和试管一起置于大铝锅内蒸煮消毒10～15min，冷却至室温24小时后即可使用；
S4.藻液稀释：在光学显微镜下，用血球计数板准确测定待分离纯化藻液的单胞藻细胞密度，用经煮沸消毒并冷却至室温的沙滤海水将藻液稀释至单胞藻细胞密度为20～30cells/mL；
S5.藻细胞分离：在晴天的上午8～10点，用经煮沸消毒的吸管吸取1～3滴稀释后的藻液并滴入步骤S3所述试管中，再盖上经高温蒸煮消毒的塑料试管帽；
S6.藻细胞培养：将步骤S5所述试管置于光照充足且没有阳光直射的地方静置培养1～5天，再震摇培养10天，所述震摇培养为每天上午8～10点、下午3～5点各震摇一次试管；
S7.镜检筛选：用经消毒的玻璃吸管或一次性无菌塑料吸管吸取单胞藻细胞生长旺盛的试管中的藻液，滴在洁净的载玻片上，在光学显微镜下镜检筛选出单胞藻细胞活力好且无杂藻细胞和敌害生物的试管；
S8.二次分离纯化：取步骤S7筛选后的试管，重复步骤S1～S6对藻液进行再次分离纯化；
S9.纯化藻种的选择：用经消毒的玻璃吸管或一次性无菌塑料吸管吸取单胞藻细胞生长旺盛的试管中的藻液，滴在洁净的载玻片上，在光学显微镜下镜检筛选，得到纯化的、无杂藻细胞和敌害生物的单胞藻。
优选地，所述单胞藻为海水单胞藻。
进一步优选地，所述海水单胞藻包括金藻、扁藻、角毛藻、盐藻或小球藻。
优选地，步骤S2所述试管的数量大于20支。
进一步优选地，步骤S2所述试管的数量大于50支。
当步骤S4所述待分离纯化藻液中的杂藻细胞和敌害生物的数量和种类较少时，步骤S2所述试管的数量大于20支；当步骤S4所述待分离纯化藻液中的杂藻细胞和敌害生物的数量或种类较多时，步骤S2所述试管的数量大于50支。
当步骤S4所述待分离纯化藻液中的杂藻细胞和敌害生物的数量或种类较多时，步骤S5所述试管中滴加1滴稀释后的藻液；当步骤S4所述待分离纯化藻液中的杂藻细胞和敌害生物的数量和种类较少时，步骤S5所述试管中滴加2或3滴稀释后的藻液。
优选地，步骤S6所述震摇的时间为20～30s。
本发明还请求保护上述方法在分离纯化海水单胞藻方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的方法操作简单，对操作人员的专业度要求极低，适用场所广泛，既适合条件良好的实验室又适合条件简陋的养殖场，且分离纯化成功率达到100％，可保证单胞藻纯种培养和长期保存。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种简单高效的金藻分离纯化方法
S1.培养液配制：在300mL沙滤海水中加入硝酸钠、磷酸二氢钾、硅酸钠、柠檬酸铁，使其浓度分别为30×10-6mg/L、5×10-6mg/L、1×10-6mg/L、0.2×10-6mg/L，制成培养液；
S2.试管分装：将步骤S1所述培养液分别倒入20支洁净的试管中，所述培养液的体积为试管容积的1/4～1/3，试管置于金属试管架上；
S3.高温消毒：将步骤S2所述金属试管架和试管一起置于大铝锅内蒸煮消毒10min，冷却至室温24小时后即可使用；
S4.藻液稀释：在光学显微镜下，用血球计数板准确测定待分离纯化藻液中的金藻细胞密度，用经煮沸消毒并冷却至室温的沙滤海水将藻液稀释至金藻细胞密度为20cells/mL；
S5.金藻细胞分离：在晴天的上午8～10点，用经煮沸消毒的吸管吸取1～3滴稀释后的藻液并滴入步骤S2所述试管中，再盖上经高温蒸煮消毒的塑料试管帽；
S6.金藻细胞培养：将步骤S5所述试管置于光照充足且没有阳光直射的地方静置培养1天，再震摇培养10天，所述震摇培养为每天上午8～10点、下午3～5点各震摇一次试管，每次震摇20～30s；
S7.镜检筛选：用经消毒的玻璃吸管或一次性无菌塑料吸管吸取金藻细胞生长旺盛的试管中的藻液，滴在洁净的载玻片上，在光学显微镜下镜检筛选出金藻细胞活力好且无敌害生物和杂藻细胞的试管；
S8.二次分离纯化：取步骤S7筛选后的试管，重复步骤S1～S6对藻液进行分离纯化；
S9.纯化藻种的选择：用经消毒的玻璃吸管或一次性无菌塑料吸管吸取金藻细胞生长旺盛的试管中的藻液，滴在洁净的载玻片上，在光学显微镜下镜检筛选，得到纯化的、无敌害生物和杂藻细胞的金藻。
实施例2一种简单高效的金藻分离纯化方法
同实施例1的方案，区别在于，步骤S1中硝酸钠、磷酸二氢钾、硅酸钠、柠檬酸铁的浓度分别为50×10-6mg/L、3×10-6mg/L、2×10-6mg/L、0.1×10-6mg/L。
实施例3一种简单高效的金藻分离纯化方法
同实施例1的方案，区别在于，步骤S4中将藻液稀释至金藻细胞密度为30cells/mL。
按照上述实施例1～3的单胞藻分离纯化方法，最终均能得到纯化的、无敌害生物和杂藻细胞的单胞藻藻种。
此外，发明人还进行了多年的金藻、扁藻、角毛藻、盐藻、小球藻等常用单胞藻的藻种保存，期间每2个月进行一次分离纯化操作，每次操作仅耗时1～2h，分离纯化成功率达到100％，有效保证了单胞藻的纯种培养和长期保存。期间发明人也多次以水滴法和平板分离法作为对比实验，每次操作均需要3～4h，且水滴法仅有1次取得成功，平板分离法从未成功。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种简单高效的单胞藻分离纯化方法，包括如下步骤：
S1.培养液配制：在沙滤海水中加入硝酸钠、磷酸二氢钾、硅酸钠、柠檬酸铁，使其浓度分别为30×10-6～50×10-6mg/L、3×10-6～5×10-6mg/L、1×10-6～2×10-6mg/L、0.1×10-6～0.2×10-6mg/L，制成培养液；
S2.试管分装：将步骤S1所述培养液倒入洁净的玻璃试管中，所述培养液的体积为试管容积的1/4～1/3，试管置于金属试管架上；
S3.高温消毒：将步骤S2所述金属试管架和试管一起置于大铝锅内蒸煮消毒10～15min，冷却至室温24小时后即可使用；
S4.藻液稀释：在光学显微镜下，用血球计数板准确测定待分离纯化藻液的单胞藻细胞密度，用经煮沸消毒并冷却至室温的沙滤海水将藻液稀释至单胞藻细胞密度为20～30cells/mL；
S5.藻细胞分离：在晴天的上午8～10点，用经煮沸消毒的吸管吸取1～3滴稀释后的藻液并滴入步骤S3所述试管中，再盖上经高温蒸煮消毒的塑料试管帽；
S6.藻细胞培养：将步骤S5所述试管置于光照充足且没有阳光直射的地方静置培养1～5天，再震摇培养10天，所述震摇培养为每天上午8～10点、下午3～5点各震摇一次试管；
S7.镜检筛选：用经消毒的玻璃吸管或一次性无菌塑料吸管吸取单胞藻细胞生长旺盛的试管中的藻液，滴在洁净的载玻片上，在光学显微镜下镜检筛选出单胞藻细胞活力好且无杂藻细胞和敌害生物的试管；
S8.二次分离纯化：取步骤S7筛选后的试管，重复步骤S1～S6对藻液进行再次分离纯化；
S9.纯化藻种的选择：用经消毒的玻璃吸管或一次性无菌塑料吸管吸取单胞藻细胞生长旺盛的试管中的藻液，滴在洁净的载玻片上，在光学显微镜下镜检筛选，得到纯化的、无杂藻细胞和敌害生物的单胞藻。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述单胞藻为海水单胞藻。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述海水单胞藻包括金藻、扁藻、角毛藻、盐藻或小球藻。
4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤S2所述试管的数量大于20支。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2所述试管的数量大于50支。
6.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤S6所述震摇的时间为20～30s。
7.权利要求1～6任一所述方法在分离纯化海水单胞藻方面的应用。
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