CN111548982A - 从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法，霉菌污染的海带配子体克隆粉碎、过滤后置于培养皿中，弱光环境下培养，使配子体丝状体附着于培养皿底部；采用微吸管分离法，在显微镜下将细胞状态好且无菌丝附着的单个细胞段，用微吸管吸取分离至灭菌的盖玻片上，然后进行一次镜检以确保盖玻片上所分离的细胞段无菌丝污染；经过二次培养后将克隆粒转移到灭菌培养皿中，进行二次镜检得到无菌配子体。采用本发明的方法，只要得到一个无污染的细胞段，分离即成功，就是一个配子体克隆系的保存成功。

Description

从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法
技术领域
本发明涉及从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法。
背景技术
海带是我国养殖的重要经济海藻之一，养殖产量连续多年位居世界首位。保护好海带种质资源是海带养殖业健康持续发展的基础。海带具有明显的世代交替生活史，一生包括孢子体世代和配子体世代。20世纪70年代海带配子体无性繁殖系（克隆）培育成功。配子体在一定条件下可进行无性繁殖形成克隆，由于海带配子体克隆具有遗传基础纯一、可长期保存、发育全能性特点，便于杂交，所以配子体克隆不单成为海带种质保存对象，并且在海带育种、育苗、生理及遗传学研究中均发挥重大作用。保存无污染的海带配子体克隆意义重大。
在海带配子体克隆保存过程中，难免有空气中霉菌孢子的污染，霉菌孢子落在液体培养基或克隆体上后，发芽生长并产生菌丝，菌丝互相交织而成菌丝体，缠绕海带配子体克隆或深入克隆团内，影响种质的保存及配子体的生长，并且由于霉菌孢子极易散播，在更换培养液过程中，容易造成其他克隆系的污染，给种质库种质的保存留下极大隐患，如果为了避免污染其他克隆系而丢掉污染的克隆系，会导致海带优良种质的流失，给海带种业带来不可挽回的损失，影响海带良种生产。
保存的克隆系一旦出现霉菌污染，可通过添加有效抗生素抑制霉菌菌丝生长，但无法达到完全去除的效果，并且抗生素使用浓度过大或者长期使用，对配子体细胞有直接影响，严重导致配子体死亡，浓度太低，药物发挥不了作用，因此，对海带种质保存而言，霉菌的存在永远是个潜在的威胁。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法，分离并获取无污染配子体作为长期保存对象。
本发明的技术方案如下：
从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法，其特征在于按照以下步骤获取无菌配子体：
（1）、配子体克隆材料的选取：海带种质库选取霉菌污染的配子体克隆；
（2）、配子体克隆材料的粉碎：将选用的配子体克隆材料，采用超声波细胞粉碎机进行粉碎得到配子体藻液；
（3）、配子体细胞段附着与培养：配子体藻液经过滤后置于培养皿中，在160倍镜下每个视野含有3-5个细胞段，培养皿放置在温度8-10℃，光强100-200Lux条件下，静置培养3-5天，使配子体丝状体附着于培养皿底部；
（4）、配子体丝状体镜下分离：采用微吸管分离法，在显微镜下，将细胞状态好且无菌丝附着的单个细胞段，用微吸管吸取分离至灭菌的盖玻片上，然后进行一次镜检以确保盖玻片上所分离的细胞段无菌丝污染；
（5）、二次培养：将盖玻片移至灭菌的盛有培养液的试管里并封口后放置在温度10-12℃、光强1000-1500Lux、光时24h条件下进行培养，直至试管里分离的配子体细胞段长至1-1.5mm大小克隆粒；
（6）、二次镜检：将克隆粒剥离试管内壁，将克隆粒连同培养液一起倒入培养皿中，用移液器将克隆粒吸出并移入另一个灭菌培养皿中，在显微镜下全面观察，无菌丝即得到无菌配子体，将无菌克隆粒用移液器移入试管，加培养液作为保存种质进行长久保存。
步骤（2）所述配子体克隆材料的粉碎：粉碎程度：粉碎成含有2-5个细胞的细胞段。
步骤（3）所述过滤指：经300目筛绢双层过滤。
本发明的优点：本发明在材料处理及培养过程中，从始至终未使用抗生素，避免了抗生素在配子体细胞中的残留，以及长期使用对配子体造成不良影响。本发明最大优点是只要得到一个无污染的细胞段，分离即成功，就是一个配子体克隆系的保存成功，因为配子体克隆每个细胞遗传基础一致，每个细胞均能进行无性繁殖并具有发育全能性。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。
（1）、配子体克隆材料的选取：海带种质库选取霉菌污染的海带配子体克隆。
（2）、配子体克隆材料的粉碎：将选用的配子体克隆材料，采用超声波细胞粉碎机进行粉碎。
（3）、配子体细胞段附着：经超声波细胞粉碎机粉碎的配子体藻液经300目筛绢双层过滤至直径为90mm的灭菌培养皿中，在160倍镜下，以每个视野含有3-5个细胞段为宜，培养皿放置在温度8-10℃、光强100-200Lux条件下静置培养3-5天，使配子体丝状体附着于培养皿底部。
（4）、配子体丝状体镜下分离：在消毒的超净工作台间，采用微吸管分离法，在显微镜下，选取细胞状态好、无菌丝附着的单个细胞段，用灭菌的微吸管分离至灭菌的被切割成5mm*5mm大小的盖玻片上。进一步镜检，保证是无污染的配子体细胞段，将盖玻片小片移至灭菌的盛有培养液的试管里，试管用灭菌的脱脂棉封口。
（5）、二次培养：将试管放置在温度10-12℃，光强1000-1500Lux、光时24h条件下进行培养。
（6）、二次镜检：当试管里分离的配子体细胞段长至肉眼可见1-1.5mm大小克隆粒时，在消毒的超净台间，用灭菌的玻璃棒将克隆粒剥离试管内壁，克隆粒连同培养液一起倒入灭菌的培养皿中，用移液器将克隆粒吸出并移入另一个培养皿中，在显微镜下全面观察，无菌丝即得到无菌配子体，将无菌克隆粒用移液器移入试管，加培养液作为保存种质进行长久保存。

Claims (3)

1.从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法，其特征在于按照以下步骤获取无菌配子体：
（1）、配子体克隆材料的选取：海带种质库选取霉菌污染的海带配子体克隆；
（2）、配子体克隆材料的粉碎：将选用的配子体克隆材料，采用超声波细胞粉碎机进行粉碎得到配子体藻液；
（3）、配子体细胞段附着与培养：配子体藻液经过滤后置于培养皿中，在160倍镜下每个视野含有3-5个细胞段，培养皿放置在温度8-10℃，光强100-200Lux条件下，静置培养3-5天，使配子体丝状体附着于培养皿底部；
（4）、配子体丝状体镜下分离：采用微吸管分离法，在显微镜下，将细胞状态好且无菌丝附着的单个细胞段，用微吸管吸取分离至灭菌的盖玻片上，然后进行一次镜检以确保盖玻片上所分离的细胞段无菌丝污染；
（5）、二次培养：将盖玻片移至灭菌的盛有培养液的试管里并封口后放置在温度10-12℃、光强1000-1500Lux、光时24h条件下进行培养，直至试管里分离的配子体细胞段长至1-1.5mm大小克隆粒；
（6）、二次镜检：将克隆粒剥离试管内壁，将克隆粒连同培养液一起倒入培养皿中，用移液器将克隆粒吸出并移入另一个灭菌培养皿中，在显微镜下全面观察，无菌丝即得到无菌配子体，将无菌克隆粒用移液器移入试管，加培养液作为保存种质进行长久保存。
2.如权利要求1所述的从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法，其特征在于步骤（2）所述配子体克隆材料的粉碎：粉碎程度：粉碎成含有2-5个细胞的细胞段。
3.如权利要求1所述的从污染霉菌的海带配子体克隆中获取无菌配子体的方法，其特征在于步骤（3）所述过滤指：经300目筛绢双层过滤。
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