CN102643751A

CN102643751A - 一种快速分离纯化小球藻的方法

Info

Publication number: CN102643751A
Application number: CN2012101227314A
Authority: CN
Inventors: 张亚雷; 周雪飞; 苏鸿洋; 孙振; 钟云娜; 闫刚
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN102643751B

Abstract

本发明提供了一种固体培养基分离小球藻的方法，包括培养基配方的配制和具体操作方法，属生物技术领域。利用此培养基，在模拟自然光照下分离纯化小球藻，短时间内得到大量纯化的小球藻。其中，涂布分离时间5-7天，划线分离所用时间为2-4天。本发明的优点在于：所用时间短、操作简单、分离效果好、所得藻浓度高，适用于从自然水体中或受菌污染的小球藻分离纯化。

Description

一种快速分离纯化小球藻的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速分离纯化小球藻的方法。

背景技术

众所周知，自然生态系统中的微生物往往是多个种群组成的复杂共生体系，同时，实验室内小球藻培养过程中也因染菌成为菌藻共生体系。藻种分离和纯化是指从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需微藻个体从菌藻共生体系中分离出来，而获得纯种培养，即在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养，这是进行科学研究不可缺少的技术。同样，利用小球藻进行生理生态、生物工程、生命科学、医学药物以及环境污染治理等研究，小球藻的分离纯化是必须首先解决的问题。

目前，具体用于微藻分离纯化的方法有：样品系列稀释分离法、微吸管分离法、水滴分离法和固体培养基分离法。具体介绍如下。

（1）样品系列稀释分离法：取一定量混杂有其他生物、含有目标微藻的水样，用培养液稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞，分别加入到20只装有1/4容量培养液的试管，摇匀培养，镜检检查。此法操作简便，设备简单，适合于各种藻的分离，特别是从天然水域中初步分离各种藻，但该法盲目性强，要真正达到分离纯化的时间长。

（2）微吸管分离法：先制作口径极细的玻璃微细管，取稀释适度的藻液水样置浅凹载玻片上，在显微镜下仔细地用微吸管虹吸吸出要分离的藻体，放入另一浅凹载片上，镜检是否达到纯分离的目的，然后移入经灭菌的培养液中培养，镜检检查。该分离法的特点是易找到特定的种类，所用的设备也较简单。但操作过程繁琐，对实验操作要求很高，往往吸取一个单细胞需要几次至十几次才能成功。适于分离个体较大或丝状的藻类，如螺旋藻、骨条藻等，较小的藻类用此方法很困难。分离时间长，操作过程中还有细菌污染的可能。

（3）水滴分离法：用微吸管吸取经稀释适度的藻液，间隔一定距离滴到消毒过的载玻片上，显微镜下若一个水滴中只有一个藻细胞（无其他生物混杂），即用移液管吸取培养液将水滴冲入装有灭菌过的培养液试管或小三角瓶中，摇匀培养。此法简便易行，适宜于分离己在培养液中占优势藻类，比如分离受少量生物污染的微藻。但操作时同样要求细致、认真，分离时间长，操作过程中还有细菌污染的可能。

（4）固体培养基分离法（喷雾法、涂布法、划线法）

固体培养基分离法有喷雾法、涂布法和划线法等。该类方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。其中，稀释平板分离法：依次取5个1.5ml灭菌后离心管，每个加入0.9ml灭菌后培养液，吸取0.1ml待分离的藻液加入第一个离心管中，摇均后，再吸取0.1ml藻液倒入第一个平板中，用涂布棒涂抹均匀后，正置放好，再从第一个离心管中吸取0.1ml藻液转入第二个离心管中，依此操作继续进行。涂抹好的平板放置一段时间后放入光照培养箱中倒置培养；平板喷雾法：将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中，把藻液均匀喷射在培养基平面上，形成薄层水珠，光照下培养；平板划线法：将接种环升入藻液中，然后在平板上划线，先平行划线后垂直划线，再在光照培养箱中继续培养。以上方法一般在培养2~3周后，平板上会长出互相隔离的、绿色或者黄色的凸圆形藻类菌落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有经过灭菌的培养液试管或小三角烧瓶中，进行培养。固体培养基分离法优点是操作简单，适用于绝大部分藻种的分离，且效果最好，很容易得到单一的纯种藻类菌落。缺点是工作量十分大，且培养的时间太长，平均1~2个月才有可能得到纯种藻类。中途易受污染，特别是存在霉菌生长时，则影响纯化分离。适合于分离污染杂菌的微藻，特别是绿藻，但不适合分离喜欢群体生活的藻类细胞。

综上所述，每种方法各有优势和适用范围。当进行小球藻分离纯化时：由于小球藻个体小，微吸管分离法操作难度很大，并存在染菌的可能；样品系列稀释分离法由于目的性不强，分离过程漫长，且不一定保证能分离到所需的单种；水滴分离法操作简单，对于只是受菌污染的小球藻分离较为适用，但分离过程漫长，并存在细菌污染的可能。可见，以上小球藻分离纯化的方法要么是工作量十分大，培养时间漫长，中途易受污染；要么是操作困难，难以实现。平板固体分离法虽操作简单，较易达到分离单种的目的，适用于小球藻的分离，但由于所用的培养基一般为无机物培养基，小球藻生长缓慢，培养时间漫长，工作量大，当感染有霉菌时，分离纯化更困难。可见，目前用于分离纯化小球藻的培养基限制了平板固体分离法的应用。由于小球藻具有异养和混养特性，当培养基中存在葡萄糖、乙酸盐、蛋白胨等有机物时，小球藻可实现快速增长。因此，通过在固体培养基中加入有机物，则可能大大的促进小球藻的生长速率，从而较好地发挥固体培养基分离法的长处，实现小球藻快速分离和纯化的目的。如何针对小球藻生长特性，通过固体培养基的创新，发明适于快速、简易分离纯化小球藻的方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速分离纯化小球藻的方法。

为实现上述目的，本发明者确认分离纯化小球藻的适宜方法为平板分离，并进一步提供了一种快速、简易分离纯化小球藻的方法，能够在较短时间内、较小工作量下得到较高浓度小球藻。

本发明提出的一种快速分离纯化小球藻的方法，具体步骤如下：

（1）制作固体培养基

固体培养基配方：

Ⅰ液：碳源：Glucose_·H₂O 5000~30000 mg，无机氮源：尿素 372~2100mg、KNO₃1250~5000 mg或酵母粉3000~11000mg中任一种，无机盐：KH₂PO₄100~2000 mg, MgSO_4·7H₂O 200~2000 mg, Na_2·EDTA 50~500 mg, H₃BO₃ 11.4~114.2 mg, CaCl_2·2H₂O 11.1~111 mg, FeSO_4·7H₂O 5.0~49.8 mg, ZnSO_4·7H₂O 8.8~88.2 mg, 微量元素：MnCl_2·4H₂O 1.4~14.2 mg, MoO₃ 0.7~7.1 mg, CuSO_4·5H₂O 1.6~15.7 mg, Co(NO₃)_2·6H₂O 0.5~4.9 mg，水500mL，溶液pH值为6.1~9.0；

Ⅱ液：500ml水中加入16~40 g琼脂，混匀；

固体培养基的制作方法为：分别将Ⅰ液和Ⅱ液经121℃、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min；当灭菌后的Ⅰ液和Ⅱ液冷却至45~50℃时，将Ⅰ液和Ⅱ液混匀，倾入无菌平皿，凝固后存放于冰箱内备用；

（2）藻种的分离纯化

①在水体中采集可能含有目标藻种的水样，并在显微镜下观察藻类及数目。当水样的颜色为绿色时，即可判断微藻为优势种群，可直接进行接种分离，特别是分离受杂菌污染的微藻；当微藻数目不足时进行藻类富集和藻数目扩大培养。

②藻类富集；取40 mL水样，8000 r/min离心10 min，弃去上清液。补加水样至 40 mL离心，重复操作几次，后用SE培养液悬浮并定容至5 mL，混匀, 经筛绢过滤除去大型浮游生物，从而实现目标藻类的富集。

③接种藻数目扩大培养：用三角烧瓶作培养容器，加入SE培养液，SE培养液的加入量为三角烧瓶体积的1/4～1/2，以20% (V/V)以上接种量将富集后的藻类接种到三角烧瓶中，于光照强度2000-4000 lux、光暗比=12:12、温度 25-28℃的光照培养箱中培养1~2周，得到较高浓度的藻液，藻液颜色为绿色。每天应至少摇动一次藻液；

④接种：取5-10个1.5ml离心管，依次编号后分别加入0.9mL SE培养液，首先取0.1mL经扩大培养后的藻液（摇均）加入第一个离心管中，摇匀后从第一管中取0.1mL藻液加入第二个离心管中混匀。随后，依次按10倍的稀释梯度进行同样操作，以确保藻液稀释至目标微藻浓度为10~100个/mL；从最后3个梯度的离心管中取0.1mL藻液涂布接种到步骤(1)所得的固体培养基上。

⑤培养：接种后的平板倒置于光照培养箱，培养时间为4~5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形。8~10 d后，藻落直径则可长到4.8－5.2mm，可用接种环挑取单个藻类斑点在新平板上进行划线纯化，3~4d后可从划线平板通过接种环转移藻落至三角烧瓶培养基中培养。平板培养过程中，应注意观察细菌及霉菌等菌落斑点与藻类斑点的生长状况，如果前者生长过快，将覆盖藻落，则需及时挑取藻类；反之，则可让藻落斑点增长后再挑取。

⑥纯种检验：平板培养过程中，可在显微镜下定期观察藻落生长情况。挑取的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养，一天后可吸取样品于显微镜下观察，如发现是同一藻种，则基本分离成功。为确保菌藻分离成功，可将三角烧瓶中的藻液涂布到装有适合于细菌生长的通用固体培养基的平板上，在28~37℃的生化培养箱中培养24~48 h，如无细菌生长则表明菌藻分离成功。

以上所有的实验用品都经过高温灭菌（121 ℃、20 min）和紫外灭菌（>20min）后冷却待用。

本发明中，光照培养箱的光强2000-4000 lux、光暗比为12:12、温度控制在25-28℃。

与一般的固体培养基分离小球藻法相比，本发明的有益效果是：

（1）解决了制作分离纯化小球藻固体培养基时，加入有机物不易凝固的难题。

（2）解决了一般无机固体培养基分离纯化小球藻不理想的问题，小球藻非常适合在本发明的固体培养基上快速生长，通过试验，可在短时间内形成直径大的单克隆藻落，即本方法可在霉菌及其他细菌未覆盖小球藻藻落之前就可形成满足分离要求的小球藻藻落，因此，本方法进行菌藻分离效果好，且分离纯化小球藻周期短，非常适于实验室内细菌污染小球藻的快速分离。亦可与物理、化学诱变小球藻基因工作结合，实现快速获得满意的改良藻种。

（3）本发明可实现小球藻藻落的短期大生物量生长，进行划线生长时，一般2~4天即可形成大的藻落，非常有利于后续溶液快速培养，一般在10天左右即可得到较高浓度的纯种小球藻藻液。而其他固体培养基平均1~2个月才有可能得到纯种藻类，分离周期长，还容易受霉菌等其他因素影响。

（4）本发明的优点是分离纯化小球藻操作简易，分离纯化小球藻效果非常好，克服了之前一般固体培养基分离小球藻法工作量十分大的缺点。比毛细管提纯等方法，操作人员更容易掌握。

（5）本发明亦可适用于生产小球藻时藻种纯化需要，可极大缩短生产周期和实现预防细菌污染问题。

（6）本发明还可适用于斜生栅藻及其他可异养微藻的分离纯化，适用面广。

附图说明

图1 为实施例1中利用本发明的固体培养基分离纯化小球藻效果图。其中：（a）为污染了细菌的C.pyrenoidosa藻液分离结果；（b）为污染了细菌的C.sorokiniana藻液分离结果。

图2 为实施例2中正交试验结果对比图。其中：(a)、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）和（h）分别为试验号1号、4号、5号、7号、8号、10号、11号和12号的试验结果图。

图3 为实施例3中不同固体培养基培养不同小球藻效果对比图。其中：(a)、（b）和（c）分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化C. sorokiniana结果图；（d）、（e）和（f）分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化C. pyrenoidosa结果图；（g）、（h）和（i）分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化C. vulgaris结果图；（k）、（l）和（m）分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化斜生栅藻结果图。

图4 为实施例3中不同小球藻在不同固体培养基上划线生长情况图。其中：(a)为C. protothecides分别在SE固体培养基、BG固体培养基和KS固体培养基上划线生长情况；(b)为C. pyrenoidosa分别在SE固体培养基、BG固体培养基和KS固体培养基上划线生长情况；(c)为C. sorokiniana分别在SE固体培养基、BG固体培养基和KS固体培养基上划线生长情况；(c)为斜生栅藻在KS固体培养基上划线生长情况。

具体实施方式

本发明涉及分离纯化小球藻的固体培养基制作方法，该方法包括：固体培养基的配方及制作方法。

在本发明所述的培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对培养基分离纯化小球藻结果有很大的影响。例如，作为无机氮源可以为KNO₃、尿素或酵母粉，其中KNO₃的范围为0.5~3g/L，尿素的范围为0.4~2.1 g/L，作为有机氮源的酵母粉可在3~11g/L之间；作为碳源的葡萄糖可在5~30g/L之间；作为磷源的KH₂PO₄ 可在0.1~2g/L之间。因此，这些组分的用量不应受实施例的限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还应加入少量无机盐，例如硫酸镁、碳酸钙、铁离子等以及少量微量元素如Mn、Zn、B、M、Cu、Co等。在本发明中较佳的微量元素组分宜选自MnCl₂、MoO₃、CuSO_4·5H₂O、Co(NO₃)_2·6H₂O。

所述培养基基本上由以下组分组成：Glucose_·H₂O 5000~30000 mg, 尿素 /KNO₃1250~5000 mg，KH₂PO₄100~2000 mg, MgSO_4·7H₂O 200~2000 mg, Na_2·EDTA 50~500 mg, H₃BO₃ 11.4~114.2 mg, CaCL_2·2H₂O 11.1~111 mg, FeSO_4·7H₂O 5.0~49.8 mg, ZnSO_4·7H₂O 8.8~88.2 mg, MnCl_2·4H₂O 1.4~14.2 mg, MoO₃ 0.7~7.1 mg, CuSO_4·5H₂O 1.6~15.7 mg, Co(NO₃)_2·6H₂O 0.5~4.9 mg，水500mL，溶液pH值 6.1~9.0；Ⅱ液：500ml水中加入16~40 g琼脂，混匀。

在一个更佳的方案中，所述培养基的组成为：500ml蒸馏水中分别加入以下物质，碳源：Glucose_·H₂O 1000 mg。氮源：KNO₃ 1250 mg。无机盐：KH₂PO₄ 1000 mg，MgSO_4·7H₂O 1000 mg，Na_2-EDTA 100 mg，H₃BO₃ 114.2 mg，CaCl_2·2H₂O 111 mg，FeSO_4·7H₂O 49.8 mg，ZnSO_4·7H₂O 88.2 mg。微量元素：MnCl_2·4H₂O 14.2 mg，MoO₃ 7.1 mg，CuSO_4·5H₂O 15.7 mg，Co(NO₃)_2·6H₂O 4.9 mg。pH值调为6.5；Ⅱ液：将琼脂加入500ml琼脂 1%水中，混匀。分别将Ⅰ液和Ⅱ液经121℃、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min。当培养基溶液冷却至45~50℃，将Ⅰ液和Ⅱ液混匀，倾入无菌平皿，凝固后存放于冰箱内备用。

下面将通过实施例进一步阐明本发明。然而，本领域技术人员应当明白，本发明并不局限于这些实施例中的具体数值和手段。

实施例1：

（1）分离小球藻有机固体培养基制作

配制Ⅰ液：配制固体培养基。营养成分：500ml蒸馏水中分别加入以下物质，碳源：Glucose_·H₂O 1000 mg。氮源：KNO₃ 1250 mg。无机盐：KH₂PO₄ 1000 mg，MgSO_4·7H₂O 1000 mg，Na_2-EDTA 100 mg，H₃BO₃ 114.2 mg，CaCl_2·2H₂O 111 mg，FeSO_4·7H₂O 49.8 mg，ZnSO_4·7H₂O 88.2 mg。微量元素：MnCl_2·4H₂O 14.2 mg，MoO₃ 7.1 mg，CuSO_4·5H₂O 15.7 mg，Co(NO₃)_2·6H₂O 4.9 mg。pH值调为6.5；Ⅱ液：将琼脂加入500ml琼脂 1%水中，混匀。

固体培养基的制作方法为：分别将Ⅰ液和Ⅱ液经121℃、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min；当灭菌后的Ⅰ液和Ⅱ液冷却至45~50℃时，将Ⅰ液和Ⅱ液混匀，倾入无菌平皿，紫外灯下冷却凝固后备用。

（2）污染细菌的藻种分离纯化

本试验用于分离纯化的小球藻均受到霉菌和杆菌等细菌的污染，采用本发明固体培养基及分离方法进行菌藻分离。操作如下：①接种：取5-7个经过灭菌的1.5ml离心管，每个加入0.9ml SE培养液，将待分离的污染细菌的藻液摇均后，吸取0.1ml藻液加入第一个离心管中，摇均后，再吸取0.1ml经过扩大培养后的藻液加入第二个离心管中，即将经过扩大培养后的藻液依次稀释成 10^?1、10^?2、10^?3、10^?4、10^?5、10^?6和10^?7倍, 取后3个梯度涂布到已凝固的固体培养基上；②培养：接种后的平板倒置于光照培养箱（光强2000-4000 lux、光暗比=12:12、温度25-28℃），培养时间为4~5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形。8~10 d后，藻落直径则可长到3.0~5.2mm。③纯种检验：平板培养过程中，可在显微镜下定期观察藻落生长情况。挑取②的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养7天，重复以上操作步骤①接种和②培养，得到如图1所示的单藻落，经显微镜镜检和细菌培养观察，菌藻分离成功。可见，本发明方法可实现污染细菌的小球藻快速分离纯化。

实施例2：分离小球藻的有机固体培养基优化制作

如表1设计正交实验，控制各因素对应培养基配方中药品种类和用量，其中 Glucose_·H₂O 10000mg/L, 其他营养成分为：MgSO_4·7H₂O1000mg/L,H₃BO₃ 114.2, CaCl_2·2H₂O 111mg/L, FeSO_4·7H₂O 49.8mg/L, ZnSO_4·7H₂O 88.2mg/L, MnCl_2·4H₂O 14.2mg/L, MoO₃ 7.1mg/L, CuSO_4·5H₂O 15.7mg/L,Co(NO₃)_2·6H₂O 4.9mg/L。如表1和表2配制不同试验号的Ⅰ液，并调节pH 6.5；Ⅱ液：按表1和表2将琼脂加入500ml琼脂 1%水中，混匀配制不同试验号的Ⅱ液。

固体培养基的制作方法为：分别将Ⅰ液和Ⅱ液经121℃、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min；当灭菌后的Ⅰ液和Ⅱ液冷却至45~50℃时，将对应试验号的Ⅰ液和Ⅱ液混匀，倾入无菌平皿，紫外灯下冷却凝固后备用。

表1 正交试验因素及其水平

列号	A	B	C	D	E
						因素	琼脂	其他营养成分	氮源	磷酸二氢钾	Na₂EDTA
水平1	0.8%	10%	尿素	100 mg/L	100 mg/L
						水平2	1%	100%	硝酸钾	1000 mg/L	500 mg/L
水平3	1.5%

表2 正交试验结果分析及方差检验

Figure 2012101227314100002DEST_PATH_IMAGE002

本试验用于验证固体培养基的小球藻为经过分离纯化后的C. pyrenoidosa。试验操作如下：①接种：取5-7个经过灭菌的1.5ml离心管，每个加入0.9ml SE培养液，将待接种的藻液摇均后，吸取0.1ml藻液加入第一个离心管中，摇均后，再吸取0.1ml经过扩大培养后的藻液加入第二个离心管中，即将经过扩大培养后的藻液依次稀释成 10^?1、10^?2、10^?3、10^?4、10^?5、10^?6和10^?7倍, 取后3个梯度涂布到已凝固的固体培养基上；②培养：接种后的平板倒置于光照培养箱（光强2000-4000 lux、光暗比=12:12、温度25-28℃），培养时间为4~5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形。8~10 d后，藻落直径则可长到0~5 mm，试验结果如表2和图2所示。

由表2直观分析和方差分析结果可知，影响指标的主次顺序为：A<B<C<D<E。其最优组合KS固体培养基配方为：A₂B₂C₁D₂E₁，即Glucose_·H₂O 10000mg/L，尿素1250 mg，KH₂PO₄ 1000 mg，Na₂EDTA 100 mg/L，其他营养成分为：MgSO_4·7H₂O1000mg/L，H₃BO₃ 114.2，CaCl_2·2H₂O 111mg/L，FeSO_4·7H₂O 49.8mg/L，ZnSO_4·7H₂O 88.2mg/L，MnCl_2·4H₂O 14.2mg/L,MoO₃ 7.1mg/L，CuSO_4·5H₂O 15.7mg/L,Co(NO₃)_2·6H₂O 4.9mg/L，pH 6.5，琼脂1%。试验结果如图2所示，本发明所形成的的KS固体培养基可实现小球藻的快速生长，从而可满足于污染细菌小球藻纯化或从自然水体中的分离出纯种小球藻。

实施例3

本发明培养基与几种常用固体培养基培养效果对比。

1）不同固体培养基（KS固体培养基、SE固体培养基、BG11固体培养基、BW固体培养基）培养绿藻效果对比。

通过比较不同固体培养基（KS固体培养基、SE固体培养基、BG11固体培养基、BW固体培养基）培养不同小球藻藻种（C. sorokiniana、C. pyrenoidosa、C. vulgaris、C. sacchrarophila）和斜生栅藻生长效果，培养时间为7d的时候，如图3所示。

通过不同小球藻藻种（C. sorokiniana、C. pyrenoidosa、C. vulgaris、C.sacchrarophila）和斜生栅藻在不同固体培养基上的生长试验比较，可以看出，用常规的SE、BG11等固体培养基，所有的小球藻均生长缓慢，在同样的培养时间内7d，肉眼均观察不到平板上藻落的形成和生长（需借助显微镜观察）。而所发明的KS固体培养基很适合不同小球藻及斜生栅藻快速生长，其板上所生长的小球藻藻落直径均大于BD培养基上所生长的对应小球藻藻落直径，通过显微镜观察，所形成的藻落均无细菌生长。因此，ks固体培养基很适合于小球藻的快速分离和纯化。

2）不同小球藻在不同固体培养基上划线生长情况

为研究不同固体培养基上进行平板划线生长性能，分别比较了不同小球藻（C. sorokiniana、C. pyrenoidosa、C. sacchrarophila）和斜生栅藻在不同固体培养基上划线生长的情况，如图所示。其中，在KS固体培养基上通过接种环接种不同小球藻后在光照培养箱中培养2-4天，如图4所示，均可在很短的时间能获得快速生长。而且，很容易满足后续悬浮生长接种量要求，当将其接种到溶液培养基中，可获得较高浓度的藻液（OD值较大，颜色非常明显），可极大的缩短后续溶液培养时间。而在SE、BG11、Basal等的固体培养基上，经过7天的生长如下图所示，生长非常缓慢，从平板上接种到溶液培养基里，颜色非常淡（OD值非常小），肉眼几乎观察不到藻的颜色，后续培养时间很长。可见，本发明固体培养基用于分离纯化小球藻和斜生栅藻优势明显。

Claims

1.一种快速分离纯化小球藻的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）制作固体培养基

固体培养基配方：

Ⅱ液：500ml水中加入16~40 g琼脂，混匀；

（2）藻种的分离纯化

①在水体中采集可能含有目标藻种的水样，并在显微镜下观察藻类及数目；当水样的颜色为绿色时，即可判断微藻为优势种群，直接分离，当微藻数目不足时进行藻类富集和藻数目扩大培养；

②藻类富集；取40 mL水样，8000 r/min离心10 min，弃去上清液；补加水样至 40 mL离心，重复操作几次，后用SE培养液悬浮并定容至5 mL，混匀, 经筛绢过滤除去大型浮游生物，从而实现目标藻类的富集；

③接种藻数目扩大培养：用三角烧瓶作培养容器，加入SE培养液，SE培养液的加入量为三角烧瓶体积的1/4～1/2，以20% (V/V)以上接种量将富集后的藻类接种到三角烧瓶中，于光照强度2000-4000 lux、光暗比=12:12、温度 25-28℃的光照培养箱中培养1~2周，得到较高浓度的藻液，藻液颜色为绿色；每天应至少摇动一次藻液；

④接种：取5-10个1.5ml离心管，依次编号后分别加入0.9mL SE培养液，首先取0.1mL经扩大培养后的藻液摇均加入第一个离心管中，摇匀后从第一管中取0.1mL藻液加入第二个离心管中混匀；随后，依次按10倍的稀释梯度进行同样操作，以确保藻液稀释至目标微藻浓度为10~100个/mL；从最后3个梯度的离心管中取0.1mL藻液涂布接种到步骤(1)所得的固体培养基上；

⑤培养：接种后的平板倒置于光照培养箱，培养时间为4~5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形；8~10 d后，藻落直径则长到4.8－5.2mm，用接种环挑取单个藻类斑点在新平板上进行划线纯化，3~4d可从划线平板通过接种环转移藻落至三角烧瓶培养基中培养；

⑥纯种检验：平板培养过程中，在显微镜下定期观察藻落生长情况；挑取的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养，一天后可吸取样品于显微镜下观察，如发现是同一藻种，则基本分离成功；将三角烧瓶中的藻液涂布到装有适合于细菌生长的通用固体培养基的平板上，在28~37℃的生化培养箱中培养24~48 h，如无细菌生长则表明菌藻分离成功。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于光照培养箱的光强2000-4000 lux、光暗比为12:12、温度控制在25-28℃。