CN100457890C - 一种有效分离多种微藻种质的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从一次野外样品中有效分离多种微藻种质的新方法。通过人为提供的多种培养条件，使采集的野外样品在不同的培养条件下同时培养于微孔组织培养板，微藻群落能够以定向演替的方式交替形成优势种群，从而可以获取多种微藻种质，并利于有效分离单种微藻进行进一步的室内培养。微藻群落的演替条件和群落的演替过程跟踪所进行的场所为微孔组织培养板。

Description

一种有效分离多种微藻种质的新方法

技术领域

本发明涉及一种微藻种质分离方法，它可以从一次性野外原生态采样水体中有效分离多种微藻种质，该方法可以有效地应用到对淡水、海水、半咸水环境中浮游和底栖的微藻种质的获取、单种分离、纯种培养、特征水体微藻群落组成分析、野外种质采集以及环境条件监测。

背景技术

微藻广泛地应用于生物指示剂、作为生物化学和基因工程研究工具、人工养殖动物的饵料、药源生物种类、人类的食物、太空空间站微生态系统种类、环境保护工程等广大的领域中。纯系微藻种质的获取在实验研究和实践应用中具有重要的意义。对某一种微藻的深入认识和研究有赖于该种质纯系培养株的获得；要进行某种质的大量培养以获取某种可观的生物量或天然产物生物量，纯系种株的获得是必不可少的；而在筛选某种目的微藻时，大量的微藻种质资源的获取是必需的。

在进行野外微藻生态学和种群动力学的研究中，常用的是将样品固定的方法进行定量分析，而定性分析的活体样本观测结果常常是处于瞬间状态的微藻种类组成，受观测条件和瞬间水环境条件限制，水体中相当一部分的种类被忽略掉了，而这一部分可能是对无机和生物环境作用具有重要意义的类群；另一方面，野外工作者常常苦于对于某一地区突然出现的新种感到措手不及，希望获得种质的目的常常因为野外培养条件和短期时间的限制而与一种新种失之交臂。

自然水体中微藻种类繁多，并且不同种类的微藻其细胞大小变化很大：在生态学研究范畴中，将小于2μm的浮游生物称为picoplankton，30μm以上的为网采浮游生物，2-30μm之间的称为nanoplankton，通常使用的浮游植物网采方法会丢失相当多的种类，而采水的方法获取的样品在一般的瞬时镜检条件下也很难将水体中所有的种类观察到更不用说能够分离出来。

通常分离微藻的方法：常见的有以试管将水样逐级稀释，待一个月甚至更长的时间后取试管内的水样进行镜检，该方法要求的水体较大、器材样品数多而且水体中藻类组成变化不能及时跟踪，有相当大的盲目性而且获取单种微藻种质的时间间隔长。

另外一种用毛细管分离方法由于是针对单个细胞的分离，不光是对显微操作技术要求较高，主要还是对细胞本身的搅动较大细胞因此很可能不能存活，而且针对的是瞬时采样水体，对水环境中非预期的少量的微小的种类常常忽略。在需要进行多种藻类筛选而希望从某种特征环境水体中获取多种甚至全部微藻种质时，没有一个方便而有效可行的方法，仅仅依靠一时刻的种类组成进行分析和分离显然不够。

微量滴定板是一种在生物和化学研究中广泛应用的塑料制样品容器。典型的微量滴定板有6孔、24孔、96孔、384孔甚至1536孔的标准，通常以2∶3的比例形成一个长方形孔板。6孔、24孔、96孔的微量滴定板也有称作组织培养板的。从我们的实践经验来看，在进行微藻种质获取和分离中，24孔板是最为有利且方便应用的一种，可以在一个板上制造多种条件的多重重复，方便镜检而且水体的体积足够一定量的生物群落在实验条件下较长时间的演替要求。结合孔径较大的6孔培养板，我们几乎可以获取所有大小在几个微米到上百微米的微藻纯系种质。

微藻的室内培养是指在实验室环境条件下人为提供模拟微藻生长所需的环境条件，培养微藻需要在一个适当的容器中为微藻提供适当的介质条件使微藻生活其中。在微藻群落的演替过程中，化学条件和生物条件的改变决定了群落的微藻种类组成从而形成了不同的微藻优势种类的出现。微藻种类除少数属于完全自养型微藻外，大多数都属于混合营养型，除了要求主要的培养条件如光照、CO₂、H₂O、营养盐、微量元素外还需要添加其自身不能合成的因素如维生素等。维持一个自然种群的多种类混合水体空间可以保障一些未知的生物种间关系在群落演替中的作用。不同的微藻种类有不完全一样的营养要求，在瞬时提供各种营养条件差异的基础上，利用微藻群落在时间序列上因变的群落优势特点就有利于观察、分离并纯化一次采样水体的系列微藻种质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有背景技术而提供一种有效分离多种微藻种质的新方法，它能快捷方便、有效可靠地从一个野外水样中获取和分离多个微藻种质，克服了诸多缺陷如现行的微藻野外采集样品中如果没有发现优势种就难以从中分离种质，在采用试管水样逐级稀释过程中，仅分离一个目标种质就需要耗费大量的时间，在采用毛细管分离微藻种质时，由于细胞分捡后密度过低往往难以存活。

本发明提供的技术方案是利用微藻群落演替法在微量组织培养板上从一次性采样样品中获取多种微藻种质方法，并且可以及时跟踪不同培养条件下单个野外水样微生态群落在受到不同环境条件改变后的群落演替过程。

具体来说，这种技术方案包括以下技术步骤：

1.野外样品的采集：选择典型环境条件下的水体如水华或赤潮水体、特征污染水体、清洁水体或热源环境水体等，以浮游植物采水方法获得微藻种质原生态群落；

2.取一定体积的样品镜检除去可见的浮游动物以消除浮游动物的捕食影响；

3.充分摇匀样品水体，等量移取定量水样分别加入洁净的微孔组织培养板的各孔之中，在不同的微孔板上制造相应的目标培养条件，新增培养液和水样以1∶0.5至1∶10的比例接种到微孔板上；

4.将各板放置在设定培养条件的环境中进行培养，定期于倒置显微镜下进行镜检；

5.在特定条件和时间下会有典型的优势种类出现，这是野外采集水样微观自然群落在不同培养条件下出现群落演替的必然结果，此时，利用消毒的毛细管吸取优势种类进一步分离获取纯系种质，这样演替出现的优势群落包括多个微藻种质，它可以是野外采集水样初次镜检时就观察到的主要种类，也可以是在初次镜检时无法观察到的非预期微藻种类。

步骤1中所述的野外采样水体包括多种微藻野外水样环境，可以是淡水、海水或半咸水环境。

步骤3中所述的微孔组织培养板可以是6孔、24孔或96孔的组织培养板，可以将微藻在组织培养板微孔中进行培养和微藻种质的分离。所述的目标培养条件主要是指调节大量营养盐的含量及比例的变化、或者是微量营养物质的含量和比例变化，以及光照、温度等培养条件的改变。大量营养盐是指氮、磷、硅，微量营养物质是指微量元素、维生素等。

步骤4所述的群落演替是指一个环境水样中复杂的微藻群落，可以在培养条件改变后形成优势的群落，从而可以方便地分捡纯化种质。

步骤5所述的预期微藻种质是指野外采集到的样品中直接镜检确认的微藻种类。非预期微藻种质是指在野外采集样品镜检过程中没有发现的微藻种质，这些非预期种质是在改变培养条件以后逐渐发生的新种质，即在野外采集样品初次镜检时没有观察到，但实际上，在经过一些特殊的培养条件能够从孢囊萌发、稀有群落(初次镜检时由于数量很稀少被忽略或根本无法观察到)演变为优势群落。

根据步骤5的结果，由于一个野外采集水体样品在经过多种不同的培养条件培养后，往往在不同的微孔培养板上出现多个不同的优势微藻种类，这些微藻种类都可以进一步通过传统的显微操作技术很方便地挑选得到纯化的微藻种质，进行进一步的培养扩增。由于在一个野外水体样品中，除初次镜检观察到的一些微藻品种外，还有许多初次镜检忽略的微藻种类以微少群落或孢囊形式等存在，但是，这些被忽略的种类往往在特殊的培养条件下和群落演替的时间序列上可以形成优势的群落。因此，多种微藻种质可以是一次性野外采样所得的所有潜在微藻种类。

与现有技术相比，本发明的优点在于：它提供了一种有效获取和分离多种微藻的新方法，该方法可以从一次野外采样水体中通过培养条件的改变在微孔组织培养板上实现群落演替，从而分离出预期微藻种质和瞬时镜检尚不可检出的非预期微藻种质，这种有效分离多种微藻种质的技术核心是在微孔组织培养板上制造多种营养环境与培养条件，使微藻群落发生多种多样的演替过程，然后于倒置显微镜下显微观测跟踪潜在微藻种质在时间和培养条件序列上的群落演替，将序列上处于优势的种类进一步进行纯化分离。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一

1.野外微藻原生态群落样品的获取：2005年6月10日于浙江洞头采集到一个海水水样，海水采集1L，直接装入聚乙烯塑料瓶中。

2.实验室镜检水体中优势的微藻种类为米氏凯伦藻，去除准备应用水体中的浮游动物。

3.不同营养盐条件设置：将部分海水水样以微孔滤膜(0.45微米)抽滤获得海水原水；在经过过滤消毒的天然海水中以添加不同的化学物质及不同比例获得不同的培养用营养盐差异条件12组，各组分别为：海水原水、未加富的消毒海水、分别只添加氮、磷、硅、微量元素、维生素、氮/磷/硅(两种比例)、氮/磷、氮/硅、磷/硅的消毒海水(表1)。

表1培养液差异列表

组别                            培养液含

第一组                海水原水(pH＝8.817，salinity＝25‰)

第二组                消毒海水(pH＝8.353，salinity＝22.5‰)

第三组                消毒海水+10mg/L KNO₃

第四组                消毒海水+10mg/L KH₂PO₄

第五组                消毒海水+Na₂SiO₄(0.002％)

第六组                消毒海水+f/2配方(微量元素)

第七组                消毒海水+f/2配方(维生素)

第八组                消毒海水+f/2配方(N/P)

第九组                消毒海水+f/2配方(N/P)+Na₂SiO₄(0.002％)

第十组                消毒海水+10mg/L KH₂PO₄+Na₂SiO₄(0.002％)

第十一组              消毒海水+10mg/L KNO₃+Na₂SiO₄(0.002％)

第十二组              消毒海水+10mg/L KNO₃+10mg/L KH₂PO₄+Na₂SiO₄(0.002％)

4.分别将不同的培养液以移液枪定量分装到12个24孔组织培养板上，每孔加入培养液的体积为1mL，一组条件接种一个24孔板；

5.将去除浮游动物的原生态水样以移液枪分别加入各24孔培养板的各孔之中，加入水体体积为1ml。水体总体积为2ml。操作过程严格消毒；

6.将分装接种好的12个培养板置于温度为23℃、光照强度为3500-5000lux、D∶L＝12∶12的光照培养箱内进行培养，隔天于Nikon倒置显微镜下观察各板的群落组成变化；

7.结果显示，各组条件下的群落在时间序列上的演替存在一定的差异，多种营养盐混合加入的组其种类演替变化丰富，微藻存活状态良好。总体来说，加入硅酸盐的组会出现明显的硅藻优势期；单种营养盐加入对原生态的群落变化影响不大；原水状态可以在水体中较长时间地维持原生种类。各组中演替出现的优势种类有米氏凯伦藻、具齿原甲藻、锥状斯氏藻、红色裸甲藻、一种小型的裸甲藻、Gyrodinium、骨条藻、舟形藻、菱形藻等。其他的微藻还包括一种球状带刺微型藻类(具体种名待定)、三种未知硅藻和大量的甲藻孢囊。在这次实例研究中，观察到的微藻种质超过30余种，其中包括国内尚未见报道的一种小型裸甲藻微藻种质。

以下以第8和12组为代表来显示群落在前10天里的定性变化(如表2)，可以看出，原始的海水样品中主要的微藻种类为米氏凯伦藻、具齿原甲藻，其次为舟形藻、菱形藻，经过培养之后，到第5天，群落中出现了骨条藻、具齿原甲藻优势，而米氏凯伦藻开始消退，同时出现了多种初次镜检时被忽略的种类；到第10天时，除上述的具齿原甲藻外，出现了一种新的优势种，是一种小型的裸甲藻种类，这是初次镜检时没有观察到的，也没有被国内其他的文献报道所记录。

因此，通过本实例我们成功地分离到了表中所列的几个主要优势种类，可以作为新的纯系种质进行进一步的研究，如果在研究过程中发现具有进一步的医药、食品等经济价值，这些种质可以作为纯系种质进行生物工程生产。

表2以第8和12组为代表显示群落在培养前10天内的定性变化*

曲舟藻	0	1	0	0	0
						中华盒形藻	0	1	0	0	0
圆筛藻	0	1	0	0	0
						小型裸甲藻	0	0	0	5	5

注：表格中的数字代表群落的丰度状态，优势：5，亚优势：4，大量：3，较多：2，出现：1，未出现：0

Claims (9)

1.一种有效分离多种微藻种质的新方法，其特征在于该方法是从野外采样水体中通过培养条件的改变在微孔组织培养板上实现群落演替，从而分离出预期微藻种质和瞬时镜检尚不可检出的非预期微藻种质。

2.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的野外采样水体包括多种微藻野外水生环境。

3.根据权利要求2所述的新方法，其特征在于所述的多种微藻野外水生环境是淡水、海水或半咸水环境。

4.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的微孔组织培养板是6孔、24孔或96孔的组织培养板，新增培养液和水样以1∶0.5至1∶10的比例接种到微孔板上，从而将微藻在组织培养板微孔中进行培养和微藻种质的分离。

5.根据权利要求4所述的新方法，其特征在于所述的培养条件改变是指大量营养盐的含量或比例的变化，或者是微量营养物质的含量或比例变化，或者是光照、温度培养条件的改变，所述的大量营养盐是指氮、磷、硅，微量营养物质是指微量元素、维生素。

6.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的群落演替是指一个环境水样中复杂的微藻群落，可以在培养条件改变后形成优势的群落，从而可以方便地分捡纯化种质。

7.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的预期微藻种质是指野外采集到的样品中直接镜检确认的微藻种类。

8.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的非预期微藻种质是指在野外采集样品镜检过程中没有发现的微藻种质，这些非预期种质是在改变培养条件以后逐渐发生的新种质。

9.根据权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的分离是制造多种营养环境与培养条件，使分装到微孔培养板上的微藻群落发生多种多样的演替过程，然后于倒置显微镜下显微观测跟踪潜在微藻种质在时间和营养条件序列上的群落演替，将序列上处于优势的种类进一步进行纯化分离。