KR101563054B1

KR101563054B1 - 미생물의 현장 배양장치 및 이를 이용한 미생물 분리방법

Info

Publication number: KR101563054B1
Application number: KR1020130106936A
Authority: KR
Inventors: 안태석; 정다운; 한재민
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-10-23
Also published as: KR20150028421A

Abstract

본 발명은 현장에서 미생물을 배양하고 분리함으로써 일반적인 배양방법에서는 분리할 수 없는 난배양성 미생물 등을 분리할 수 있는 배양장치와 그를 이용한 미생물 분리방법에 관한 것이다.
본 발명의 미생물 배양장치는,
원추 형상의 팁(tip)으로 구성되되,
원추 하단 끝 부위에는 지름 0.2~0.8mm의 구멍이 있고,
원추 내부 하단에는 지름 50~250㎛ 글래스 비드(glass bead)로 이루어진 층이 존재하며,
글래스 비드 층의 상부에는 배지를 포함하는 한천 층이 존재하고,
원추 상단은 방수 접착제로 봉해져 있는 것을 특징으로 한다.

Description

미생물의 현장 배양장치 및 이를 이용한 미생물 분리방법{The device for in situ cultivation of microorganism and a method for isolation of microorganisms using the same}

본 발명은 새로운 미생물 배양 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 현장에서 미생물을 배양하고 분리함으로써 일반적인 배양방법에서 분리할 수 없는 난배양성 미생물 및, 보다 다양한 미생물을 분리할 수 있는 배양장치와 그를 이용한 미생물 분리방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 종래 실험실 환경에서 배양할 수 없었던 미생물을 배양할 수 있다.

미생물의 특성을 파악하여 환경에서의 역할과 생태학적 기능을 이해하고, 더 나아가서 이들을 산업적으로 활용하기 위해서는 다양한 환경으로부터 미생물을 분리, 배양하는 것이 필수적이다. 하지만 지금까지 사용하고 있는 미생물 분리 기술은 시료를, 한천을 포함하는 고체배지에 평판 도말하는 방법으로서, 이러한 실험실 배양 방법을 통해 분리할 수 있는 미생물은 환경에 존재하는 전체 미생물 중 1% 정도에 불과하고 대부분의 미생물은 현재의 방법으로 분리할 수 없다(Keller et al., 2004).

환경에 존재하는 미생물이 실험실에서 진행되는 일반적인 배양방법에 의해 분리되지 않는 것에는 다음과 같은 이유들이 있다.

첫째, 미생물을 배양하는 배지에 의한 영향이다. 일반적으로 실험실에서 널리 사용되는 배지는 빠른 배양과 분리를 위해 고농도의 영양분을 포함하는 배지를 사용하는데 이것은 빈영양 상태의 실제 환경과 다른 상태를 제공함으로 인해 특정 소수의 미생물만 분리되는 부작용을 유발할 수 있다(Aagot et al., 2001).

둘째, 성장이 빠른 미생물들이 그렇지 않은 미생물의 배양에 영향을 줄 수 있다. 일반적으로 고체 배지에서 콜로니를 형성하며 빠르게 성장하는 미생물은 타감작용(allelopathy)으로 인해 늦게 성장하는 미생물의 배양을 억제할 수 있다(Watve et al., 2006). 또한 생물막(biofilm)을 형성하며 넒은 범위로 자라는 미생물은 배지에서 우점하면서 다른 미생물들의 성장을 억제하거나 혹은 눈에 안 띄게 방해하여 다른 미생물의 분리를 불가능하게 할 수도 있다.

셋째, 실험실에서 이루어지는 일반적인 배양은 일반적으로 1주일 내에 이루어지는데 이러한 짧은 배양 기간은 성장이 느린 미생물의 분리 기회를 놓치게 할 수 있다.

넷째, 실험실에서 이루어지는 일반적인 배양방법의 조건은 실제 환경과 전혀 다르기 때문에 환경에 존재하던 미생물이 배양되지 않을 수 있다. 미생물이 배양되는 데 큰 영향을 주는 온도, pH, 습도, 공기 조성, 염분도 및 햇빛 등의 환경 요소가 현장 조건과 다름으로 인해 미생물 배양에 영향을 줄 수 있는 것이다(Kaeberlein et al., 2002). 또한 기본적인 환경요소 외에도 생물끼리 주고받는 신호물질, 대사물질, 영양분 등의 환경에 존재하는 화학물질은 미생물의 성장에 큰 영향을 주는 것으로 밝혀졌다(Bollmann et al., 2007). 따라서 이러한 배양에 영향을 주는 여러 가지 요인들이 전혀 다른 실험실 배양에서는 실제 환경에 존재하는 여러 미생물이 배양되지 않을 수 있다.

이러한 일반적인 실험실 배양의 여러 문제점들을 해결하기 위해서 다양한 미생물 배양 방법의 개발이 이루어지고 있다. 고농도 배지의 문제점을 해결하기 위한 빈영양 배지 사용 방법 (Janssen et al., 2002), 빠르게 성장하는 미생물에 의한 타감작용을 억제하기 위한 싱글 셀(single cell) 배양 방법(Connon and Giovannoni, 2002), 느리게 성장하는 미생물을 분리하기 위한 배양 기간 증대 방법(Davis et al., 2005) 및 배양성을 증진할 수 있는 첨가물질을 추가하는 방법(Bruns et al., 2002) 등이 개발되어 환경에 존재하는 미생물의 배양률을 향상시켰다.

하지만 이러한 방법들은 위에서 언급한 실험실 배양의 문제점 중 하나를 해결하여 가설을 증명하는 것을 목적으로 한 이론적인 방법으로 그 기술을 구체적으로 상용화하여 일반적으로 사용하기에는 무리가 있다.

새롭게 개발되고 있는 배양 방법 중 현장배양 방법(in situ cultivation)은 실험실 배양 방법의 문제점을 다양한 각도에서 해결한 가장 상용화하기 쉬운 기술 중 하나이다. 가장 대표적인 방법으로 diffusion chamber가 있는데(Bollmann et al., 2007), 배양 장치를 현장에 설치하여 미생물이 성장하는 데 큰 영향을 줄 수 있는 현장의 환경요인을 제공해주고 여러 화합물질을 미생물 배양 중에 자유롭게 교환할 수 있게 함으로써 난배양성 미생물과 좀 더 다양한 미생물의 배양을 유도하는 방법이다.

이 배양 방법은 저농도의 영양분만 장치에 공급해주고, 현장의 영양분과 장치 내의 영양분이 자유롭게 교환할 수 있게 되어 있으므로 고농도 영양분 공급에 의한 특정 미생물이 우점하는 현상을 막을 수 있다. 또한 고영양분에서 빠르게 성장하는 미생물에 의한 타감작용을 최소화할 수 있다. 현장에서 배양하는 기간은 최소 2주에서 최대 5주 정도로, 느리게 성장하는 미생물을 배양하기에도 문제가 없다. 게다가 현장 배양을 통해 실험실 배양 방법에서 제공할 수 없는 여러 가지 환경요인이 자연스럽게 공급된다. 따라서 실험실 배양의 문제점을 다양한 각도에서 해결한 방법이라 할 수 있다.

하지만 지금까지의 현장 배양 장치들은 미생물을 분리하고자 하는 환경에 올려놓고 배양하는 방식으로 그 대상이 토양, 저질토 등 평평한 것에 한정되어 있다. 또한 대상 환경의 미생물 수를 현미경으로 파악하여 장치에 넣은 후 현장에서 배양하는 방식으로 제작 및 운반이 매우 까다롭고 미생물 전문가만 운영할 수 있다는 단점이 있다.

따라서 현장 배양 방법의 장점을 갖고 있으면서 대량생산이 가능하고 광범위한 환경을 대상으로 할 수 있으며 누구나 운영할 수 있는 미생물 배양 장치의 개발이 필요하다. 특히 우리나라는 새로운 미생물 배양 방법의 개발이 전무한 상태로 국내의 미생물 자원을 확보하고 다양한 미생물을 분리하여 상업적으로 활용하기 위해서는 새로운 배양 방법의 개발이 강하게 요구되는 상황이다.

따라서 본 발명은 난배양성 미생물과 보다 다양한 미생물을 분리할 수 있는 새로운 현장 배양 장치의 제작 방법 및 그 장치를 이용한 배양 및 분리방법을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 새로운 배양 장치, In situ cultivation by tip(이하 I-tip)의 제작방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 배양 장치를 사용하여 미생물 배양하는 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 미생물의 배양장치는,

원추 형상의 팁(tip)으로 구성되되,

원추 하단 끝 부위에는 지름 0.2~0.8mm의 구멍이 있고,

원추 내부 하단에는 지름 50~250㎛ 글래스 비드(glass bead)로 이루어진 층이 존재하며,

글래스 비드 층의 상부에는 배지를 포함하는 한천 층이 존재하고,

원추 상단은 방수 접착제로 봉해져 있는 것을 특징으로 한다.

이때 상기 원추 형상의 팁(tip)은 20~200㎕의 부피인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 배양장치를 이용한 미생물의 분리방법으로서,

상기 배양장치를 배양하고자 하는 대상에 꽂는 단계;

필요한 조건으로 필요한 기간만큼 배양하는 단계;

대상으로부터 배양장치를 분리한 후, 배양장치의 글래스 비드 층 상부 경계면 위로 2~3 mm 부분을 잘라내는 단계;

잘라낸 부분을 vortex 후 상등액을 채취하여 고체배지에 재배양하는 단계; 및

콜로니를 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

I-tip의 기본원리는 배양장치가 미생물을 분리하고자 하는 대상으로 파고들어가 설치되어 현장 배양(in situ cultivation)을 하는 것이다. 따라서 기본적인 in situ 배양 개념은 diffusion chamber(Bollmann et al., 2007)와 같지만 뾰족한 끝을 갖고 있는 장비의 특성에 의해 실제 배양에서 적용되는 원리는 매우 독창적이다. 이러한 특징은 호수, 저질토, 토양과 같은 환경뿐만 아니라 식물, 어패류 등과 매우 광범위한 대상에서 현장 배양을 가능할 수 있게 한다.

자동 pipet에 사용되는 원추 형상의 팁(tip)을 I-tip의 본체로 사용한다. 뾰족한 tip의 끝 부분은 0.2~0.8mm 지름의 작은 구멍이 하나 또는 여러 개 있는데 이 부분이 미생물을 분리하고자 하는 대상과 장치를 이어주는 입구가 된다. 이어지는 하부 층은 50~250μm 지름 크기의 매우 작은 다수의 glass bead로 구성되어 있는데, 이것들은 공극을 형성하여 필터와 같은 역할을 하게 되며, 입구로 들어온 미생물이 장치 안으로 배양되어 올라올 수 있는 통로가 된다. 이 glass bead 층은 대상으로부터 미생물 및 배양에 영향을 주는 화학물질들이 장치 내로 유입되는 통로일 뿐만 아니라 적절한 수의 미생물만 유입되게 조절하는 제어기능을 갖는다.

한천을 포함하는 배지를 채워 glass bead가 존재하는 하층에 스며들게 하고 또한 배지로만 이루어진 상부 층을 형성하면, 각각의 팁은 현장에서 미생물을 배양할 수 있는 하나의 chamber가 된다. 대상에 설치된 I-tip은 자동적으로 적절한 수의 미생물을 장치 내로 유입시켜 별도의 작업이 필요하지 않다. 또한 대상 안에 존재하는 미생물뿐 아니라 영양분, 대사물질, 신호물질 등과 같은 화학물질이 입구와 glass bead로 이루어진 통로를 통해 장치 안으로 유입되어 미생물 배양에 영향을 준다.

원추 상단은 방수 접착제를 이용하여 밀봉해 주어 공기나 물의 유입에 의한 미생물 오염을 방지한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 본 발명의 I-tip 배양 장치를 사용하여 미생물을 분리하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 미생물 배양 방법은 10~20개의 I-tip을 미생물을 분리하고자 하는 대상에 적용할 수 있다. 본 발명의 I-tip 배양 장치는 뾰족한 끝을 갖고 있어 다양한 대상에 삽입할 수 있다. 대상에 설치하여 미생물을 배양하므로 환경의 온도, 습도, pH 등의 여러 요인과 영양분, 대사물질, 신호물질 등의 화학물질을 제공하여 일반적인 실험실 배양의 경우보다 다양한 미생물과 난배양성 미생물의 배양이 가능해진다.

배양 방법(사용 방법)을 보면, I-tip을 대상의 다양한 부위에 꽂아 넣고 3~4일에 한 번씩 대상과 I-tip의 상태를 확인해 준다. 대상이 토양, 저질토와 같은 환경이면 멸균된 물을 적절히 공급하여 대상과 I-tip 장치가 마르는 것을 방지한다. 대상이 생물체일 경우 최대한 생존조건을 제공하여 대상체가 미생물을 배양하는 기간 동안 생존할 수 있도록 한다. 배양 온도에 따라 2~5주 현장 배양을 실시하고(온도가 낮을 경우 배양기간을 더 길게 잡는다) I-tip 장치를 대상에서 회수한다. 멸균된 칼이나 가위를 이용하여 I-tip의 glass bead 층 상부 경계면 위로 2~3mm 부분을 절개하여 증류수가 들어있는 적당한 크기의 용기에 넣는다. 용기를 30분 동안 shaker나 vortex 등을 이용하여 심하게 흔들어 준 후 1분간 정체시켜 한천 조각을 침전시킨다. 상등액을 채취하여 0~10^-3으로 연속적으로 희석한 후 배지와 한천을 포함하는 고체배지에 평판도말하여 1~2주간 재배양한다. 배양 후 형태와 크기가 다른 콜로니를 선별하여 순수 분리한다.

본 발명의 I-tip 배양 장치는 현장배양을 적용하므로 일반적인 실험실 배양보다 다양한 미생물과 난배양성 미생물을 분리할 수 있다. 그리고 뾰족한 끝을 갖고 있어 여러 가지 환경이나 생물체 등 다양한 대상에 적용할 수 있다. 또한 이전 현장 배양과 달리, 미생물을 계수하여 인위적으로 넣어 주는 방식이 아닌 대상으로부터 자연스럽게 유입시키는 트랩(trap) 방식으로 제작과 적용방법이 매우 간단하여 누구나 미생물 배양을 효율적으로 실시할 수 있다.

미생물은 어떤 극한 환경 조건에서도 생존 가능하며, 물질 분해 능력은 물론 우수한 생리대사 능력과 생리활성물질 생산 능력을 지니고 있어, 이러한 미생물의 능력이 의약품, 물질분해, 식물 성장 촉진제, 식품 산업 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 따라서 본 발명품을 다양한 미생물을 원하는 모든 산업 분야에 적용할 수 있다. 국내에서도 폐수처리장, 음식물 쓰레기 처리기 등 다양하고 활성이 높은 미생물을 필요로 하는 분야는 많지만 체계화된 공급처는 없는 실정이다. 또한 적절한 미생물을 얻기 위해 수요자가 원하는 시료에서 미생물을 분리해야 하는 경우도 많다. 따라서 본 발명은 여러 산업 분야에서 미생물을 직접 분리하기 원하는 수요자가 사용할 수 있는 배양 장치로 그 가치가 매우 높다고 할 수 있다.

더욱이 본 발명의 장치는 원추형상의 팁을 본체로 사용하므로 제조 역시 용이하다.

도 1은 I-tip의 개념도이다.
도 2는 I-tip을 파로호의 호수물에 적용한 것을 촬영한 사진이다.
도 3은 I-tip을 파로호의 저질토에 적용한 것을 촬영한 사진이다.
도 4는 I-tip을 파로호의 인공식물섬 매트에 적용한 것을 촬영한 사진이다.
도 5는 I-tip을 바이칼 스펀지에 적용한 것을 촬영한 사진이다.
도 6은 I-tip을 파로호 저질토에 적용한 후, 장치 내의 세균을 2000배 투과 확대하여 촬영한 사진이다.
도 7은 I-tip을 파로호 인공식물섬 매트에 적용한 후, 장치 내의 세균을 10000배 투과 확대하여 촬영한 사진이다.
도 8은 I-tip을 바이칼 스펀지에 적용한 후, 장치 내의 세균을 10000배 투과 확대하여 촬영한 사진이다.
도 9는 I-tip을 바이칼 스펀지에 적용한 후, 장치 내의 세균과 효모를 4000배 투과 확대하여 촬영한 사진이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐으로 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

I-tip 장치의 제작

I-tip의 제작을 다음의 순서로 진행하였다.

산 세척이 된 glass bead를 yellow tip(company)에 0.007~0.009 g 넣어주었다. Bead의 크기는 60~106, 150~212 μm 지름 크기인 두 종류를 각각 사용하였다(Sigma-aldrich, No G4649, G1145, USA). 그 위로 0.7%(wt/v) 한천과 함께 끓인 배지를 100 μL 첨가한 후, 팁 전체를 고온, 고압 멸균기에서 멸균해 주었다.

배지가 식은 후 방수 접착제(3M, USA)로 상부를 막아 공기나 물에 유입에 의한 오염을 방지하였다(도 1). 파로호 시료를 위하여 Nutrient broth, R2A, 1/10으로 희석한 R2A 배지를 사용하였고, 러시아 스펀지 시료를 위하여 Actinomycete, R2A 배지를 사용하였다.

I-tip 장치를 이용한 현장배양

다양한 대상에서의 I-tip 적용 가능성을 확인하기 위해 정체된 환경인 (1) 파로호의 호수물, 저질토 및 호수에 설치된 인공식물섬과 (2) 생물체인 바이칼 호수의 2종의 스펀지에 적용하였다.

실험예 1: 파로호의 호수물, 저질토 및 인공식물섬에 적용

I-tip을 이용하여 강원도 화천시에 위치한 파로호의 호수물, 저질토, 인공식물섬 매트로부터 미생물을 분리하였다(도 2, 3, 4).

호수물과 저질토는 채취하여 냉장상태로 실험실로 옮긴 후 가로 13 cm, 세로 19 cm, 높이 6 cm 크기의 멸균된 플라스틱 박스에 각각 넣었다. 호수물이 들어있는 박스에는 yellow tip을 꽂을 수 있는 틀을 설치한 후 20여개의 I-tip이 수면에 1 cm 정도 잠기게 설치하였고 저질토에는 20여개의 I-tip을 골고루 꽂아 고정하였다. 용기의 뚜껑을 닫아 현장온도로 맞춘 배양기에 넣어준 후 3주 동안 배양을 실시하였다.

3~4일에 한 번씩 시료와 I-tip의 상태를 확인해 주었고 저질토 시료에는 완전히 마르는 것을 방지하기 위해 멸균된 증류수를 공급해 주었다.

3주 후, 대상으로부터 I-tip을 분리한 후, 재배양을 위해 I-tip의 glass bead층 상부 2~3 mm 크기의 부분을 멸균한 칼로 채취하였다. 채취한 부분을 1 mL 멸균 증류수에 넣은 후 30분 동안 vortex하고, 1분간 정체시켜 한천 조각을 침전시켰다. 상등액을 채취하여 연속적으로 희석한 후 고체배지에 평판 도말하여 재배양하였다. 배양 후 형태와 크기가 다른 콜로니(colony)를 선별하여 순수 분리하였다.

I-tip 배양의 효과를 비교하기 위하여 일반적인 실험실 배양을 동시에 진행하였다. 호수물 시료의 경우 0~10^-3으로 연속적으로 희석한 것을 배양에 사용하였다. 저질토와 인공식물섬 매트의 경우 시료 1 g을 멸균 증류수 10 mL에 넣은 후 30분 동안 votex 한 것을 10^-2~10^-5으로 연속적으로 희석한 것을 배양에 사용하였다. 이것들을 위에서 언급한 배지에 0.1 mL씩 평판 도말하여 I-tip 배양과 같은 온도로 같은 기간 동안 배양하였다.

실험예 2: 바이칼 호수 민물 스펀지에 적용

I-tip을 이용하여 바이칼 호수의 스펀지로부터 미생물을 배양하기 위하여 바이칼 호수에 위치한 바이칼 수족관을 이용하였다.

스펀지가 들어있는 수조로 바이칼 호수물이 계속적으로 공급되고 수온이 자동적으로 제어되었다. 배양을 위해 3~5개 정도의 바이칼 sponge, Baicalospongia sp.와 Lubomirskia baicalensis를 가로 30 cm, 세로 50 cm, 높이 40 cm 의 수조에 각각 넣은 후 준비한 I-tip을 한 종당 20개씩 다양한 부위에 꽂아 넣고 2일에 한 번씩 sponge와 I-tip의 상태를 확인하였다(도 5).

4주 후, I-tip을 회수하여 냉장상태로 실험실로 옮겼다. 재배양을 위해 I-tip의 glass bead층 상부 2~3 mm 크기의 부분을 멸균한 칼로 채취하였다. 채취한 부분을 1 mL 멸균 증류수에 넣은 후 30분 동안 vortex하고, 1분간 정체시켜 한천 조각을 침전시켰다. 상등액을 채취하여 연속적으로 희석한 후 고체배지에 평판 도말하여 재배양하였다. 배양 후 형태와 크기가 다른 colony를 선별하여 순수 분리하였다.

I-tip 배양의 효과를 비교하기 위하여 일반적인 실험실 배양을 동시에 진행하였다. 채취한 스펀지 20 g을 멸균 비닐용기에 넣은 후 stomacher blender(Seward, England)를 이용해 균질화하였다. 이 용액을 10^-2~10^-5으로 연속적으로 희석한 후 위에서 언급한 배지에 0.1 mL씩 평판 도말하여 I-tip 배양과 같은 온도로 같은 기간 동안 배양하였다.

전자현미경을 이용한 배양 후 I-tip 내에 존재하는 미생물 관찰

I-tip을 이용하여 미생물을 배양한 후, 장치 내에 미생물이 존재하는 것을 확인하기 위하여 투과전자 현미경(TEM)을 이용하여 I-tip 내부의 미생물을 관찰하였다. 러시아 스펀지와 파로호의 호수물, 저질토, 인공식물섬 매트에 적용하였던 I-tip의 상부를 멸균한 칼로 제거한 후 멸균된 루프(loop)를 이용하여 내부 물질을 상부로부터 약 5 mm 깊이에서 채취하였다. 채취한 물질을 슬라이드 글라스에 고르게 펼친 후 한국기초과학지원연구원에 현미경 관찰을 의뢰하였다.

투과전자 현미경(모델)으로 촬영하여 그 결과를 비교하였다(도 6~9). 현장배양 후 I-tip 내부에 세균, 효모 등 다양한 미생물이 존재함을 확인하였다.

분리한 미생물의 동정

분리한 미생물의 염기서열 분석을 MACROGEN(Korea)에 의뢰하였다. 그 결과를 EzTaxon-e database(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net, Korea)에 수록된 염기 서열들과의 유사도를 비교 분석하여 유전적 거리가 가장 가까운 종(closest species)를 찾았다.

실험예 1의 미생물 분리 결과

파로호 호수물, 저질토, 인공식물섬 매트로부터, 일반적인 실험실 배양과 I-tip 배양을 이용하여 분리한 미생물의 종 다양성 결과는 다음의 표 1과 같다.

표 안의 숫자는 분리한 미생물 종의 수를 나타내며 괄호 안의 수는 이전에 보고된 종과의 유사도가 96% 이하로 신종으로 분류되는 있는 미생물의 수이다.

표 1에서 볼 수 있듯이 I-tip을 이용하여 미생물을 배양할 경우 다양한 대상으로 부터 일반적인 실험실 배양보다 2배 이상의 다양한 미생물 종을 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한 일반적인 배양에서는 분리되지 않았던 신종으로 분류되는 난배양성 미생물을 I-tip 배양 장치를 통해 분류할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2의 미생물 분리 결과

러시아 바이칼 호수에 서식하는 스펀지 2종으로부터 일반적인 실험실 배양과 I-tip 배양을 이용하여 분리한 미생물들의 동정결과를 비교하였다.

일반적인 실험실 배양 방법으로 분리한 미생물들의 동정결과는 표 2와 같다.

I-tip 배양 장치를 이용하여 분리한 미생물들의 동정결과는 표 3과 같다.

[표 3]

바이칼 스펀지로부터 일반적인 실험실 배양 방법으로 총 4개의 taxonomic group에 속하는 17종의 미생물을 분리하였으며, I-tip 배양 방법으로 총 8개의 taxonomic group에 속하는 40종의 미생물을 분리하였다. 일반적인 배양방법과 비교해 볼 때, I-tip 배양 방법을 통해 taxonomic group이나 종 수준에서 모두 2배 이상의 다양한 미생물을 얻을 수 있는 것을 확인할 수 있다.

Actinobacteria 그룹은 방선균이 속한 문으로 방선균은 항균능력을 보유하고 있어 의약품 개발 등 상업적 개발 잠재력이 매우 높은 미생물이다. 스펀지에는 그러한 방선균이 많이 존재하는 것으로 알려져 있고, 따라서 스펀지에서 미생물을 분리하는 가장 큰 이유 중 하나이다. 이번 실험에서 일반적인 배양 방법을 통해서는 actinobacteria 그룹이 전혀 분리되지 않았지만 I-tip 배양을 통해서는 다수의 actinobacteria 그룹에 속한 세균종들을 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 I-tip 배양이 일반적인 실험실 배양과 비교했을 때 상업적인 활용 가능성이 높은 미생물을 분리할 수 있는 가능성이 훨씬 높다는 것을 나타낸다.

Claims

원추 형상의 팁(tip)으로 구성되되,
원추 하단 끝 부위에는 지름 0.2~0.8mm의 구멍이 있고,
원추 내부 하단에는 지름 50~250㎛ 글래스 비드(glass bead)로 이루어진 층이 존재하며,
글래스 비드 층의 상부에는 배지를 포함하는 한천 층이 존재하고,
원추 상단은 방수 접착제로 봉해져 있는 것을 특징으로 하는,
미생물의 배양장치.
제1항에 있어서,
원추 형상의 팁(tip)은 20~200㎕의 부피인 것을 특징으로 하는
미생물의 배양장치.
제1항 또는 제2항의 배양장치를 배양하고자 하는 대상에 꽂는 단계;
필요한 조건으로 필요한 기간만큼 배양하는 단계;
대상으로부터 배양장치를 분리한 후, 배양장치의 글래스 비드 층 상부 경계면 위로 2~3 mm 부분을 잘라내는 단계;
잘라낸 부분을 vortex 후 상등액을 채취하여 고체배지에 재배양하는 단계; 및
콜로니를 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는,
미생물의 분리방법.