CN107418898A - 一种柱层析快速分离微藻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柱层析快速分离微藻的方法，具体步骤如下：步骤一，采用色谱法分离；步骤二，根据待分离的微藻种类具体特征选取不同的分离固定相；步骤三，用淡水或者海水作为流动相，配合滤纸、层析柱和蠕动泵对微藻进行洗脱分离；步骤四，等量收集洗脱液，用显微镜检验洗脱液的微藻种类和纯度，选取全部是待分离微藻的收集管进行放大培养。本发明根据色谱分离原理和柱层析的方法进行微藻的分离，操作简单，达到快速分离较大量微藻的目的，无需多次培养，工作效率高，完全可以满足放大培养的要求。

Description

一种柱层析快速分离微藻的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种柱层析快速分离微藻的方法。
背景技术
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。微藻在使用时需要将微藻分离，目前广泛使用的微藻分离方法有显微镜检测法和平板划线法。显微镜检测法要求在载玻片上滴加藻液，镜检无其他杂藻，只有待分离藻，用毛细管吸出藻液，或者在显微镜视野内没有杂藻，用毛细管仅吸取视野内待分离的微藻，操作难度极大，同时，获取的微藻量极低，甚至达不到进行放大培养的要求。平板划线法要求单一细胞的待分离藻繁殖生长所得到的藻苔进行培养，用平板划线法得到单一细胞的待分离藻繁殖生长的藻苔，需要多次划线培养，同时，每次培养时间需要7-12天，费时费力，成功率低。这都为人们将微藻分离带来了困扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柱层析快速分离微藻的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种柱层析快速分离微藻的方法，具体步骤如下：
步骤一，采用色谱法分离；
步骤二，根据待分离的微藻种类具体特征选取不同的分离固定相；
步骤三，用海水或者淡水作为流动相，配合滤纸、层析柱和蠕动泵对微藻进行洗脱分离；
步骤四，等量收集洗脱液，用显微镜检验洗脱液的微藻种类和纯度，选取全部是待分离微藻的收集管进行放大培养。
作为本发明进一步的方案：微藻种类具体特征包括微藻的大小、微藻的几何形状以及微藻是否带纤毛。
作为本发明进一步的方案：分离固定相包括硅藻土、石英砂、大孔树脂和聚酰胺粉。
作为本发明进一步的方案：层析柱采用常压层析柱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明根据色谱分离原理和柱层析的方法进行微藻的分离，操作简单，达到快速分离较大量微藻的目的，无需多次培养，工作效率高，完全可以满足放大培养的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1分离出云微藻和海水紫球藻的方法：
步骤一，选取海水微藻混合液100mL，微藻种类包括云微藻、海水紫球藻、球形棕囊藻和中肋骨条藻，待分离目标藻是云微藻和海水紫球藻；
步骤二，云微藻、海水紫球藻、球形棕囊藻和中肋骨条藻的特征见表1
表1
种类 形状 大小 鞭毛或刺
云微藻 球形 直径2.5-5.0μm 无
海水紫球藻 球形 直径5-24μm 无
球形棕囊藻 球形或近球形 直径2.5-7.0μm 有鞭毛
中肋骨条藻 透镜形或圆柱形 直径为6-22μm 有刺
步骤三，选择固定相：几种微藻形状差异不大，但大小与鞭毛有较大差异，选择尺寸排阻色谱原理分离，用200目硅藻土作为固定相；
步骤四，海水微藻混合液处理：将100mL藻液用滤纸过滤，使藻液浓缩至2mL，上样；
步骤五，选择层析柱：选择2.5×30cm的层析柱；
步骤六，选择流动相和蠕动泵流速：流动相用过滤的海水，蠕动泵控制流速为2mL/min，每管收集3mL，洗脱5个层析柱的体积；
步骤七，显微镜检查每管的微藻种类及纯度，选出只有待分离的微藻的那一管，实际镜检第23、24、25管为纯的云微藻，第72管为纯的海水紫球藻；
步骤八，取分离出的纯种微藻加营养液放大培养，达到快速分离微藻的目的。
本发明的工作原理是：本发明利用色谱分离的原理，使用柱层析的方法，根据待分离的微藻种类具体特征选取固定相，用淡水或者海水作为流动相进行洗脱，等量收集洗脱液，镜检洗脱液的微藻种类和纯度，选取全部是待分离微藻的收集管进行放大培养，达到快速分离微藻的目的。色谱分离原理在于尺寸排阻色谱、离子交换色谱、吸附色谱在微藻分离上的应用。使用常压层析柱作为色谱柱填装固定相，固定相的选择是根据待分离微藻的几何形状、大小、是否带纤毛来确定，层析柱的长度和直径根据分离的微藻特征、分离难度和生物量确定，特征差异大、生物量小的选短细柱，反之选粗大柱子。流动相采用淡水或者海水，淡水微藻的分离用0.22微米的膜过滤的，适合该藻存活的淡水作为流动相，海水微藻的分离用0.22微米的膜过滤的，选择适合该藻存活的海水作为流动相，用蠕动泵控制流速进行洗脱。等量收集洗脱液使用部分收集器或计时手动收集方法，确定每管的收集体积进行收集，原则是确保有一个单管为纯的待分离微藻。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种柱层析快速分离微藻的方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤一，采用色谱法分离；
步骤二，根据待分离的微藻种类具体特征选取不同的分离固定相；
步骤三，用淡水或者海水作为流动相，配合滤纸、层析柱和蠕动泵对微藻进行洗脱分离；
步骤四，等量收集洗脱液，用显微镜检验洗脱液的微藻种类和纯度，选取全部是待分离微藻的收集管进行放大培养。
2.根据权利要求1所述的柱层析快速分离微藻的方法，其特征在于，所述微藻种类具体特征包括微藻的大小、微藻的几何形状以及微藻是否带纤毛。
3.根据权利要求1或2所述的柱层析快速分离微藻的方法，其特征在于，所述分离固定相包括硅藻土、石英砂、大孔树脂和聚酰胺粉。
4.根据权利要求1所述的柱层析快速分离微藻的方法，其特征在于，所述层析柱采用常压层析柱。
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CN100457890C (zh) * 2005-09-01 2009-02-04 宁波大学 一种有效分离多种微藻种质的新方法
CN103940801A (zh) * 2014-04-17 2014-07-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法

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