CN104277982B - 一种三环系倍半萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种三环系倍半萜类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物代谢产物技术，具体的说是一种三环系倍半萜类化合物及其制备方法和用途。所述化合物的结构式分别为式I所示的化合物1或化合物2，为5‑6‑6三环系倍半萜类化合物，化合物1、2由青霉属真菌Penicillium bilaiae经发酵制备获得。该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC 9542。经实验表明此类化合物具有抑制农业病害真菌柑橘炭疽病菌活性，可作为农业病害菌抑制剂或杀菌剂。

Description

一种三环系倍半萜类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及微生物代谢产物技术，具体的说是一种三环系倍半萜类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
柑橘炭疽病害菌Colletotrichum gloeosprioides是导致多种水果和蔬菜(如芒果、木瓜、柑橘、苹果和西红柿等)感染炭疽病腐烂的主要农业病原菌。炭疽病严重影响了水果的保藏和运输，对农业造成了严重的经济损失。杀菌剂是用来防治炭疽病的主要手段之一，但随着一些杀菌剂的反复使用，农业病害菌对其抗药性也越来越明显。因此，需要发展更多新的抗农业病害菌的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三环系倍半萜类化合物及其制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种青霉菌株，解磷青霉菌株(Penicillium bilaiae)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC 9542。
一种三环系倍半萜类化合物，结构式分别为式I所示的化合物1或化合物2，具有5-6-6三环系化学结构；
三环系倍半萜类化合物的制备方法，：
1)将解磷青霉Penicillium bilaiae经发酵培养，而后将发酵液用乙酸乙酯萃取3-4次，合并提取液进行浓缩，获得发酵液粗提物及菌丝体；
菌丝体用丙酮-水(80-20)超声破碎提取3-4次，合并提取液后旋蒸除去丙酮，然后用乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液再进行浓缩，获得菌丝体粗提物；
所述解磷青霉(Penicillium bilaiae)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC 9542；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
2)将步骤1)中的发酵液粗提物和菌丝体粗提物合并后，进行减压硅胶柱层析，采用的洗脱液依次是梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至5:1(v/v)的氯仿-甲醇；
3)将步骤2)中以石油醚-乙酸乙酯5:1(v/v)梯度洗脱下的组分以甲醇-水(甲醇-水的比例)作为洗脱液进行反相柱层析，收集甲醇-水50：50(v/v)洗脱得到的组分，经甲醇凝胶柱层析纯化后，再用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化的洗脱液是梯度为100:1至30:1(v/v)的氯仿-甲醇，即得纯化目标化合物1；
4)将步骤2)中以石油醚-乙酸乙酯10:1(v/v)梯度洗脱下的组分以甲醇-水(甲醇-水的比例)作为洗脱液进行反相柱层析，收集甲醇-水40：60(v/v)洗脱得到的组分，经甲醇凝胶柱层析纯化后，再用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化的洗脱液是梯度为150:1至80:1(v/v)的氯仿-丙酮，即得纯化目标化合物2。
一种三环系倍半萜类化合物的应用，所述式I所示的化合物用于制备抑制农业病害真菌的药物。
所述式I所示的化合物用于制备抑制农业病害真菌的抑制剂或杀菌剂。
所述式I所示的化合物用于制备抑制农业病害真菌柑橘炭疽病菌Colletotrichumgloeosprioides的药物。
本发明由解磷青霉(Penicillium bilaiae)制备5-6-6三环系倍半萜类化合物的方法及该类化合物在制备农业病害菌抑制剂或杀菌剂中的用途。
本发明采用最小抑菌浓度(MIC)法测试化合物1和2对10株致病菌：包括3株细菌，分别是金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和藤黄微球菌(M.luteus)，3株海洋弧菌，分别是嗜水气单胞菌(A.hydrophilia)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和哈氏弧菌(V.harveyi.)以及4株农业病害菌，分别是白菜黑斑病菌(A.brassicae)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、柑橘炭疽病菌(C.gloeosprioides)和小麦全蚀病菌(G.graminis)的抗菌活性，试验证明，化合物1和2对柑橘炭疽病菌具有选择性抑制作用。
本发明的5-6-6三环系倍半萜类化合物1和2可用作农业病害菌抑制剂或杀菌剂。同时，化合物1和2可以制成抗农业病害真菌的药物用于炭疽病的治疗。化合物1和2可溶于二甲亚砜或二甲亚砜的含水溶液加以利用。
本发明所具有的优点：
本发明从采自海南东寨港木榄根际土壤中分离获得一株青霉属真菌Penicilliumbilaiae，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC 9542，对其进行发酵培养、化学成分分离、结构鉴定与生物活性研究，发现了两个结构骨架新颖的5-6-6三环系倍半萜类化合物具有很好的抗农业病害真菌柑橘炭疽病菌的活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及抗菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的杀菌剂或药物。
本发明涉及的化合物1和2可通过微生物发酵培养然后从发酵物中分离纯化获得。具体是以从采自海南东寨港木榄根际土壤中分离获得的一株内生真菌解磷青霉(Penicillium bilaiae)，可以通过人工发酵培养经分离纯化获得化合物1和2。经实验表明化合物1和2对农业病害菌柑橘炭疽病菌具有较强的抑制活性,其最小抑制浓度MIC分别为1.0、0.125μg/mL。而相应的阳性对照博莱霉素的MIC为0.25μg/mL。因此，化合物1和2可作为农业病害菌的抑制剂或杀菌剂。
附图说明
图1为本发明实施例提供的青霉属真菌在PDA平板上的生长情况图。
具体实施方式
以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。
在如下的实施例中所指的化合物1和2的化学结构分别是(结构式中的阿拉伯数字式化学结构中的碳原子的标位)：
实施例1
青霉属真菌Penicillium bilaiae，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC9542。该菌株在PDA平板上为青绿色菌丝体，平板背面呈黄色(参见图1)。
实施例2
化合物1和2的发酵生产及分离精制：
1)发酵生产
生产菌的发酵培养：
菌种培养：解磷青霉(Penicillium bilaiae)菌种以琼脂－麦芽膏培养基(琼脂－麦芽膏培养基为麦芽膏15g/L，琼脂20g/L，纯海水1000mL，pH7.4-7.8)，4℃保存。取解磷青霉(Penicillium bilaiae)接种到PDA平板上，在28℃培养箱中培养4天。
在平板上取大小为4cm2的菌丝体放入已灭菌盛有300ml液体培养基(液体培养基为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，水1000mL，pH 6.5)的容量为1000mL的锥形瓶中，静置室温培养30天。
2)浸膏的获得
用纱布将菌丝体和发酵液分离，将发酵液用乙酸乙酯萃取3次合并乙酸乙酯萃取液减压蒸馏得粗浸膏。菌丝体用丙酮-水(丙酮与水体积为80：20)超声破碎提取3次，合并提取液后旋蒸除去丙酮，旋蒸后用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液再进行浓缩，获得菌丝体粗提物；将上述的浸膏和菌丝体粗提物合并。
3)化合物的分离精制
将上述合并的物质(25g)进行减压硅胶柱(200-300目)层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至5:1(v/v)氯仿-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，洗脱流速均为200ml/min。
收集上述石油醚-乙酸乙酯(5:1(v/v))得到的洗脱组分，进行反相硅胶柱层析(以甲醇-水作为洗脱液，流速1.5ml/min)，收集甲醇-水50：50(v/v)洗脱得到的组分，经甲醇凝胶柱层析纯化后(以甲醇作为洗脱液，流速为0.2ml/min)，再用硅胶柱层析纯化，以100:1至30:1(v/v)的氯仿-甲醇洗脱(流速3ml/min)，收集氯仿-甲醇60:1(v/v)洗脱得到的组分即得纯化目标化合物1(7.6mg)。
收集上述石油醚-乙酸乙酯10:1(v/v)得到的洗脱组分，进行反相硅胶柱层析(以甲醇-水作为洗脱液，流速1.5ml/min)，收集甲醇-水40：60(v/v)洗脱得到的组分，经甲醇凝胶柱层析纯化后(以甲醇作为洗脱液，流速为0.2ml/min)，再用硅胶柱层析纯化，以150:1至80:1(v/v)的氯仿-丙酮洗脱(流速3ml/min)，收集氯仿-丙酮120:1(v/v)洗脱得到的组分即得纯化目标化合物2(16.7mg)。
其结构鉴定为如(I)所示，
该化合物具有以下理化和波谱特性：
化合物1，无色片状结晶，熔点170-173℃；比旋光度+73.6(c 0.19,CH3OH)；UV(CH3OH)λmax(logε)203(3.67)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表I；ESI质谱m/z 259[M+Na]+,高分辨ESI质谱m/z 259.1668[M+Na]+，C15H24O2Na+计算值为259.1669。
化合物2，无色片状结晶，熔点137-140℃；比旋光度+19.3(c 1.1,CH3OH)；UV(CH3OH)λmax(logε)202(3.56)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表I；ESI质谱m/z 301[M+Na]+,高分辨ESI质谱m/z 301.1776[M+Na]+，C15H24O2Na+计算值为301.1774。
表I 化合物1和2的核磁共振氢谱和碳谱(500MHz，in CDCl3)数据
a)本表信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HSQC及HMBC图谱解析结果，碳信号的多重度利用DEPT方法确定
实施例3：用最小抑菌浓度法检测式I所示化合物1和2的抗菌活性
选择以下10株病原菌株：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、藤黄微球菌(M.luteus)、嗜水气单胞菌(A.hydrophilia)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi.)、白菜黑斑病菌(A.brassicae)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、柑橘炭疽病菌(C.gloeosprioides)、小麦全蚀病菌(G.graminis)进行抗菌活性测试。
1)抗菌活性测试(MIC法)：
最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，即体外能够抑制细菌或真菌生长的最低药物浓度。在96微孔板中，通过将不同浓度的药物加入到待测菌的菌悬液中，培养后观察，如果指示菌在某孔内生长，表示该孔的药物浓度不能抑制该菌的生长，该孔内液体浑浊，透光度明显下降。反之，该孔内液体澄清，透光度下降不显著。小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。
2)菌悬液的制备
2.1)细菌：上述供试细菌分别接种于LB培养基上于37℃培养24h后，吸取4mL无菌的0.85％NaCl溶液(8.5g氯化钠定容到1000mL水中)洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下。用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中，然后用0.85％NaCl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5×108CFU/mL)，并进一步用0.85％NaCl溶液稀释至5×105CFU/mL；
0.5麦氏浊度标准：
将0.5mL 0.048mol/L的BaCl2(1.175％w/v BaCl2·2H2O)加到99.5mL0.18mol/L(0.36N)的H2SO4(1％v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。
2.2)真菌：上述供试真菌分别接种于PDA培养基上于28℃培养72h后，吸取4mL无菌0.85％NaCl溶液洗涤培养物，采用与细菌同样的方法，将菌悬液稀释至5×105CFU/mL。
3)样品的配制
分别取1mg左右待测样品(上述所得化合物1或化合物2)和阳性对照(细菌用氯霉素，真菌用两性霉素B或博莱霉素)，溶解于100μL左右DMSO中，充分混匀后，使其最终浓度为2560μg/mL，吸取50μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50μL DMSO，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，总共得到11组浓度依次减半的样品溶液(2560,1280,640,320,160,80,40,20,10,5,2.5μg/mL)。
4)空白对照：选择溶解待测样品的纯溶剂作为空白对照。
5)MIC测定流程
5.1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加样品溶液，每孔5μL，第12孔不加样品作为生长对照。
5.2)将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经液体培养基(细菌和海洋弧菌用LB(不含琼脂)培养基，真菌用PDA(不含琼脂)培养基(为避免长细菌，加入200mg/ml的氯霉素))稀释1000后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至第11孔的样品终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于37℃(细菌)和28℃(真菌和海洋弧菌)培养箱中，细菌培养24h，真菌培养72h。
5.3)在600nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。(注意：当阴性对照孔内指示菌明显生长实验才有意义；当实验出现单一的跳孔时，应记录抑制菌株生长的最高药物浓度；如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。)
实验结果为化合物1和2分别对农业病害菌柑橘炭疽病菌具有较强的抑制活性，其中化合物1的MIC值为1.0μg/mL，化合物2的MIC值为0.125μg/mL，对其他测试病原菌均未表现出抑制活性。
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对农业病害菌柑橘炭疽病菌具有较强的选择性抑制作用，它们可用于制备抗农业病害真菌的药物或农业杀菌剂。

Claims (4)

1.一种青霉菌株，其特征在于：青霉菌株(Penicillium bilaiae)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC No.9542。
2.一种三环系倍半萜类化合物，其特征在于：结构式分别为式I所示的化合物1或化合物2，具有5-6-6三环系化学结构；
3.一种权利要求2所述的三环系倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于：
1)将青霉(Penicillium bilaiae)经发酵培养，而后将发酵液用乙酸乙酯萃取3-4次，合并提取液进行浓缩，获得发酵液粗提物及菌丝体；
菌丝体用丙酮-水80:20超声破碎提取3-4次，合并提取液后旋蒸除去丙酮，然后用乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液再进行浓缩，获得菌丝体粗提物；
所述青霉(Penicillium bilaiae)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏号为：CGMCC No.9542；
2)将步骤1)中的发酵液粗提物和菌丝体粗提物合并后，进行减压硅胶柱层析，采用的洗脱液依次是梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至5:1(v/v)的氯仿-甲醇；
3)将步骤2)中以石油醚-乙酸乙酯5:1(v/v)梯度洗脱下的组分以甲醇-水作为洗脱液进行反相柱层析，收集甲醇-水50：50(v/v)洗脱得到的组分，经甲醇凝胶柱层析纯化后，再用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化的洗脱液是梯度为100:1至30:1(v/v)的氯仿-甲醇，即得纯化目标化合物1；
4)将步骤2)中以石油醚-乙酸乙酯10:1(v/v)梯度洗脱下的组分以甲醇-水作为洗脱液进行反相柱层析，收集甲醇-水40：60(v/v)洗脱得到的组分，经甲醇凝胶柱层析纯化后，再用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化的洗脱液是梯度为150:1至80:1(v/v)的氯仿-丙酮，即得纯化目标化合物2。
4.一种按权利要求2所述的三环系倍半萜类化合物的应用，其特征在于：
所述式I所示的化合物用于制备抑制农业病害真菌柑橘炭疽病菌(Colletotrichumgloeosprioides)的药物。
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