CN116986976B - 一种哈茨烷二萜类化合物、钩状木霉菌发酵液提取物、农药、及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农药技术领域，具体涉及一种哈茨烷二萜类化合物、钩状木霉菌发酵液提取物、农药、及其制备方法和用途。本发明提供了一种从钩状木霉菌中提取分离的哈茨烷二萜类化合物以及含有该化合物的提取物，本发明的化合物及提取物对多种农业病害真菌具有良好的抑制效果。因而，它们可用于抑制农业病害真菌，提高植物抗病性。本发明的技术方案有利于钩状木霉菌推广和高效利用，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农药技术领域，具体涉及一种哈茨烷二萜类化合物、钩状木霉菌发酵液提取物、农药、及其制备方法和用途。
背景技术
木霉属（Trichoderma spp.）真菌被广泛用于植物病害生物防治，其生物防治机制多样。抗生作用是木霉属真菌的主要生防机制之一，研究表明，木霉菌产生的次生代谢产物不仅能够直接抑制病原菌的生长，还能够触发植物防御系统或促进植物营养生长从而提高植物抗病性。
钩状木霉菌（Trichoderma hamatum)为子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceae)，木霉属(Trichodermasp.)真菌。目前，对于钩状木霉菌的次生代谢产物还缺乏全面的研究。因而，对于钩状木霉菌用于植物病害生物防治的活性成分尚不确定。这不利于钩状木霉菌广泛和高效的应用。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供一种哈茨烷二萜类化合物及其制备方法和用途，目的在于提供钩状木霉菌的次生代谢产物中的活性成分及其用途。
式I所示化合物，或其立体异构体，或其晶型，或其盐，或其衍生物：
式I。
本发明还提供一种钩状木霉菌发酵液提取物，所述钩状木霉菌发酵液提取物中包括上述化合物。
优选的，所述钩状木霉菌为Trichoderma hamatum。
本发明还提供上述化合物，或其立体异构体，或其晶型，或其盐，或其衍生物，或上述钩状木霉菌发酵液提取物用于提高植物抗病性的用途。
本发明还提供上述化合物，或其立体异构体，或其晶型，或其盐，或其衍生物，或上述钩状木霉菌发酵液提取物用于抑制农业病害真菌的用途。
优选的，所述农业病害真菌包括如下真菌中的至少一种：小麦赤霉、辣椒疫霉、油菜菌核、黄瓜灰霉、水稻纹枯、玉米茎基腐、草莓炭疽、花生褐斑。
本发明还提供一种用于提高植物抗病性的农药，它是以上述化合物，或其立体异构体，或其晶型，或其盐，或其衍生物，或上述钩状木霉菌发酵液提取物作为活性成分制成的。
本发明还提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，从钩状木霉菌的发酵液中提取乙酸乙酯部位提取物；
步骤2，采用柱层析对所述乙酸乙酯部位提取物进行粗分，所述柱层析中采用体积比30：1~1：1的石油醚-丙酮作为流动相，分离得到8个组分，依次记为Fr.1~Fr.8；
步骤3，取Fr.3经轴向压缩柱洗脱，洗脱液为体积分数50~100%的甲醇水溶液，得到6个组分，依次记为Fr.3-1~ Fr.3-6；
步骤4，取Fr.3-4采用凝胶柱洗脱，洗脱液为甲醇，得到5个组分，依次记为Fr.3-4-1~ Fr.3-4-5；
步骤5，取Fr.3-4-3纯化，即得。
优选的，所述钩状木霉菌为Trichoderma hamatum。
优选的，所述乙酸乙酯部位提取物的制备方法为：分离钩状木霉菌的发酵液，用乙酸乙酯浸泡，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，即得。
本发明从钩状木霉菌次生代谢产物中分离得到一个新化合物（式I所示化合物），通过对核磁共振（NMR）、电喷雾质谱（ESIMS）和圆二色谱（CD）等光谱数据的综合分析，确定了化合物的绝对构型。其对油菜菌核、黄瓜灰霉等真菌具有显著的抑制活性，对玉米茎基腐、草莓炭疽等真菌具有良好的抑制活性。因而，该化合物或含有该化合物的提取物可用于提高植物抗病性。本发明的技术方案有利于钩状木霉菌推广和高效利用，具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为式I化合物的ESI-MS表征结果；
图2为式I化合物的UV光谱表征结果；
图3为式I化合物的IR光谱表征结果；
图4为式I化合物的1H NMR表征结果；
图5为式I化合物的13C NMR表征结果；
图6为式I化合物的1H-1H COSY表征结果；
图7为式I化合物的HSQC谱表征结果；
图8为式I化合物的HMBC谱表征结果；
图9为式I化合物的NOESY谱表征结果；
图10为圆二色谱的计算和实验表征结果。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品，具体的：
一、试剂
真菌2号培养基：麦芽糖20 g；味精10 g；葡萄糖10 g；酵母膏3 g；玉米浆1 g；甘露醇20 g；KH2PO40.5 g；MgSO4 .7H2O 0.3 g；CaCO320 g；5-氮杂胞苷10 mg；蒸馏水1 L；
氘代甲醇（阿达玛斯试剂有限公司）；氘代氯仿（阿达玛斯贝塔（上海）化学试剂有限公司）；分析级甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；石油醚（上海星可高纯溶剂有限公司）；丙酮（成都市科隆化学品有限公司）；制备级乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司）；二氯甲烷（上海星可高纯溶剂有限公司）；制备级甲醇（海星可高纯溶剂有限公司）；分析级乙酸乙酯（海星可高纯溶剂有限公司）。
二、仪器
柱层析硅胶（200-300目）（青岛海洋化工厂）；Diaion HP-20（日本三菱化学公司）；MCI填料（日本三菱化学公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；QExactive UHMR复合四极杆—轨道阱质谱仪（美国赛默飞世尔公司）；硅胶（200~300目，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；轴向动态压缩柱（中国江苏汉邦科技）；NU3000型紫外检测器（中国江苏汉邦科技）；真空干燥箱（DZF型，北京科伟永兴仪器有限公司）；Kromasil100-5-C18,（10×250 mm, 4.5μm，瑞典阿克苏诺贝尔（Akzo Nobel）公司）；快速制备液相仪（常州三泰科技仪器有限公司）；Bruker Bruker-Ascend-700-MHz核磁共振仪（德国布鲁克公司）；高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；NP7000型半制备高效液相色谱仪（中国江苏汉邦科技）；Bruker Bruker-Ascend-600-MHz 核磁共振仪（德国布鲁克公司）超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）；真空干燥箱（DZF型，北京科伟永兴仪器有限公司）；Perkin-Elmer 241MC旋光仪（美国珀金埃尔默公司）；chirascan圆二色谱仪（英国应用光物理有限公司）；Cary 600 FT-IR红外光谱仪（美国加州安捷伦科技公司）；SL302N型万分之一电子天平（上海民侨精密科学仪器有限公司）；SHZ-D(III）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DLSB-5L/20型低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。
实施例1 式I化合物的分离和鉴定
一、式I化合物的分离
1、实验菌株
钩状木霉菌（Trichoderma hamatum），GenBank 准入号（OR553890）。
本实施例中，钩状木霉菌按照如下方法分离得到：
实验菌株从传统中药岩白菜（Bergeniapurpurascens）的新鲜植株中分离得到，取岩白菜新鲜的叶、根茎于流水中冲洗干净，晾干水分。在无菌操作室中，将根茎和叶分别在培养皿中用75%的酒精浸泡1min，再用镊子分别于3个培养皿中加无菌水进行漂洗3次后，再取出用无菌滤纸中将水分充分吸干。设置空白对照组，用移液枪取最后一次清洗样品的无菌水200微升，用金属涂布棒均匀涂抹于PDA（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L）平板上作为对照，倒置于28℃恒温培养箱中培养。若对照组培养皿上未长出菌落则表面消毒彻底。实验组用无菌滤纸片吸干样品表面水分后再用无菌手术刀将样品切成小块，叶剪成５mm×5mm的方块，根茎剪成0.5cm长的片段，并从中间剪开。分别将上述组织块接种于PDA培养基中，每皿2块，并将切口紧贴于PDA培养基上，用封口膜封好，28℃恒温培养箱中培养。
每天对培养皿进行观察，有菌落长出便对其进行标记，然后用接种环从样品切口处将菌丝接种至新的培养基中，培养观察，通过菌丝颜色和形状初步判断是否为单一菌种，若不是，则继续将菌丝分别挑出、纯化，直至各菌种达到分离培养条件。将菌种分离后，28℃培养箱中继续培养3~5天后，于4℃冰箱保存。经过分离纯化，共得到3株真菌，真菌b-3由生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定完成（GenBank登录号OR553890，序列号NR134371.1），经BLAST对比，鉴定为Trichodermahamatum。现保存于成都中医药大学药学院生化制药实验室。
2、菌株的扩培及提取分离
将实验菌株接种至PDA培养基上活化3 天，用打孔器取5个菌饼接种于已灭菌冷却的真菌2号液体培养基中（500 mL锥形瓶，每瓶200 mL），将其放置于28℃、120 rpm/min恒温摇床中培养7天，得到钩状木霉菌种子液。将培养好的种子液接种于已灭菌的真菌2号培养基（麦芽糖20 g；味精10 g；葡萄糖10 g；酵母膏3 g；玉米浆1 g；甘露醇20 g；KH2PO40.5 g；MgSO4.7H2O 0.3 g；CaCO320 g；5-氮杂胞苷10 mg；蒸馏水1 L）中进行扩大培养，每100 mL培养基接种2.5 mL种子液，将接种后的培养基在28 ℃、120rpm/min的恒温摇床中振荡培养14天。
3、式I化合物的提取与分离
用高速离心机将培养好的菌丝和发酵液离心，发酵液用等体积的乙酸乙酯浸泡24小时后萃取三次，收集乙酸乙酯层并减压浓缩，得到乙酸乙酯部位提取物，得到总浸膏126.0g。
浸膏经硅胶（200~300 目）柱层析进行粗分，以石油醚-丙酮（30：1，20：1，10：1，8：1，6：1，4：1，2：1，1：1）为流动相进行洗脱，每个梯度5倍柱体积，根据TLC结果进行合并，共得到8个组分（Fr.1~Fr.8）。
Fr.3经轴向压缩柱（甲醇:水—50~100%, 梯度洗脱，20min，）洗脱得到6个组分（Fr.3-1~ Fr.3-6），Fr.3-4（保留时间13-15 min）采用凝胶柱，用纯甲醇进行洗脱，根据TLC检识结果进行合并，得到5个组分（Fr.3-4-1~ Fr.3-4-5），将Fr.3-4-3通过半制备液相进行纯化得到式I所示的化合物（半制备液相纯化的条件为：配备Kromasil 100-5-C18, 10×250 mm, 4.5 μm，瑞典阿克苏诺贝尔（Akzo Nobel）公司）;流动相：甲醇（A）：水（B）；流速：3mL/min；检测波长：190nm，210 nm; 柱温：30°C；26%等度乙腈洗脱）。
二、式I化合物的鉴定
采用质谱、红外光谱、核磁共振等方法表征得到的化合物，如图1-10所示，具体结果如下：
式I化合物物理常数： ESI-MSm/z: 319.2268[M+H]+。提示化合物的分子量为318，分子式C20H30O3，不饱和度为6。
无色油状；C20H30O3；7.1o(c 0.01, MeOH)；IR (KBr)v max3433.1, 2936.7,1735.6 cm-1；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 4.40（1H, d,J= 18 Hz , H-20a）, 4.20（1H,d,J= 18 .2Hz, H-20b）, 3.98(1H, dd,J= 3.6, 6.6 Hz , H-3), 2.57（1H , d,J= 16.7Hz, H-12a）, 2.46（1H , d,J= 16.9 Hz, H-12b）, 2.45（1H , m, H-5）, 2.42（1H , d,J=16.9 Hz , H-4a）, 2.40（1H ,m, H-8a）, 2.14（1H , dd,J= 11.3, 8.9 Hz, H-14）, 2.00（1H , m, H-8b）, 1.97（1H , m,H-7a）, 1.90（1H , m, H-15a）, 1.84 (1H, dd,J= 8.2,3.7 Hz, H-2), 1.51（3H, s, H-19）, 1.50（1H , d,J= 15.3 Hz, H-4a）, 1.32（3H, s,H-17）, 1.25（1H , m,H-7b）, 1.18（3H, d,J= 7.6 Hz, H-18）, 1.09（1H ,dd,J= 14.0,9.3 Hz, H-15b）, 0.87（3H, s, H-16）；13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ: 200.2（C-11）,154.0（C-9）, 148.9（C-10）, 74.4（C-3）, 67.3（C-20）, 58.7（C-12）, 51.4（C-14）, 50.4（C-5）, 49.6（C-2）, 45.8（C-）, 40.0（C-）, 34.4（C-4）, 30.4（C-7）, 28.2（C-5）, 27.6（C-15）, 26.8（C-16）, 24.6（C-8）, 23.6（C-17）, 21.6（C-19）, 21.4（C-18）；ESI-MSm/ z319.2268 [M+H]+(计算值为C20H31O3 +, 319.2268)。
通过上述表征结果分析可知，分离得到的化合物结构式如下：
下面通过实验对本发明的技术方案做进一步说明。
实验例1 式I化合物的抗菌活性
一、实验方法
称取式I化合物（按照实施例1的方法制备）3mg，溶于0.1ml的DMSO中，配成30000ppm的母液。用移液枪吸取一定量的母液，按照浓度加入0.5%吐温-80无菌水，配成所需的浓度药液。用移液枪吸取1mL药液放入已灭菌的培养皿中，再放入9ml的PDA，摇匀，冷却。用打孔器打取圆形菌饼后用接种针挑至培养皿中央，然后将培养皿置于培养箱25℃中培养即可，48h后测量菌落直径。
试验处理3天后测量菌落直径，计算生长抑制率（％）。
D=D1－D2 （1）
式中：D表示菌落增长直径；D1表示菌落直径；D2表示菌饼直径。
式中：I表示菌丝生长抑制率；D0表示空白对照菌落增长直径；Dt表示药剂处理菌落增长直径。
二、实验结果
式I化合物对8种常见的农业病害真菌的抑制效果如下表所示：
表1. 式I化合物对8种常见的农业病害真菌的抑制效果（%）
a.浓度单位为ppm.
以上抗菌实验表明：式I化合物对黄瓜灰霉（抑制率为85.4%）、油菜菌核（抑制率为79.6%）具有显著的抑制活性，对草莓炭疽（抑制率为68.2%）、玉米茎基腐（抑制率为57.0%）具有良好的抑制活性。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明从钩状木霉菌的次生代谢物中分离出一种新的化合物，该化合物对多种农业病害真菌具有良好的抑制效果。因而，该化合物及含有该化合物的提取物（例如实施例1的Fr.3、Fr.3-4和Fr.3-4-3等）均具有抑制农业病害真菌，提高植物抗病性的应用潜力。本发明的技术方案有利于钩状木霉菌推广和高效利用，具有很好的应用前景。
Claims (9)
1.式I所示化合物：
式I。
2.一种钩状木霉菌发酵液提取物，其特征在于：所述钩状木霉菌发酵液提取物中包括权利要求1所述化合物。
3.按照权利要求2所述的钩状木霉菌发酵液提取物，其特征在于：所述钩状木霉菌为Trichoderma hamatum。
4.权利要求1所述化合物，或权利要求2或3所述的钩状木霉菌发酵液提取物用于抑制农业病害真菌的用途。
5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于：所述农业病害真菌包括如下真菌中的至少一种：小麦赤霉、辣椒疫霉、油菜菌核、黄瓜灰霉、水稻纹枯、玉米茎基腐、草莓炭疽、花生褐斑。
6.一种用于提高植物抗病性的农药，其特征在于：它是以权利要求1所述化合物，或权利要求2或3所述的钩状木霉菌发酵液提取物作为活性成分制成的。
7.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，从钩状木霉菌的发酵液中提取乙酸乙酯部位提取物；
步骤2，采用柱层析对所述乙酸乙酯部位提取物进行粗分，所述柱层析中采用体积比30：1~1：1的石油醚-丙酮作为流动相，分离得到8个组分，依次记为Fr.1~Fr.8；
步骤3，取Fr.3经轴向压缩柱洗脱，洗脱液为体积分数50~100%的甲醇水溶液，得到6个组分，依次记为Fr.3-1~ Fr.3-6；
步骤4，取Fr.3-4采用凝胶柱洗脱，洗脱液为甲醇，得到5个组分，依次记为Fr.3-4-1~Fr.3-4-5；
步骤5，取Fr.3-4-3纯化，即得。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述钩状木霉菌为Trichoderma hamatum。
9.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述乙酸乙酯部位提取物的制备方法为：分离钩状木霉菌的发酵液，用乙酸乙酯浸泡，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，即得。
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