CN110881466B - 伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用以及提取方法 - Google Patents

伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用以及提取方法 Download PDF

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    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms

Abstract

本发明提供了伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用以及提取方法；属于农药研究技术领域，所述伊快霉素类化合能够在低浓度的情况下，抑制赤星病菌孢子萌发，而同等浓度下多菌灵并无此效果，所述伊快霉素类化合具有非常大的应用潜力。

Description

伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用以及提取方法
技术领域
本发明属于农药研究技术领域，尤其涉及伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用以及提取方法。
背景技术
赤星病是烟草重要病害，每年造成巨大经济损失。烟草赤星病在成熟期发生严重且扩展迅速，目前生产上主要以化学防治为主，带来的农药残留、环境污染以及病原抗药性等负面效应日益显现，亟需寻找替代药剂，为烟草赤星病防治提供环境友好的植保产品。随着烟草种植面积的不断扩大，连作烟田的增多，连作年限的延长，耕作栽培制度及烟草品种的变化，烟草病害种类也随之增多，危害不断加重。在各类病害中，烟草赤星病成为了烟草生产威胁最大的一类病害。烟草赤星病的防治是一个世界性难题，备受国内外科学家的关注。国内外科学家在抗病品种选育、化学防治、农业防治、生物防治、基因工程等方面进行了大量研究，并取得了较大进展。目前烟草赤星病的防治以种植抗病品种、实施合理栽培措施为主，辅以药剂防治。
1929年，弗莱明发现青霉素是人类药物研发史上里程碑的事件，人们开始将微生物当作药用资源进行研究。众所周知，陆地微生物早已成为人们研发抗生素等药物的重要来源，从20世纪40年代到70年代，被称为“Golden Age ofAntibiotics”，四环素类、氨基糖苷类、糖肽类和大环类抗生素相继诞生。随着陆地环境的污染和科学技术的进步，特别是人们对陆地微生物研究越来越多，新种属发现的难度越来越大，新结构和新活性化合物发现难度不断增大，因而科学家们把寻找活性物质的目光投向了海洋。海洋真菌是海洋医药和农药研发新的资源领域，拥有巨大的开发潜力。海洋真菌生存于海洋独特的环境当中，生存竞争激烈，形成了有别于陆生真菌的独特的生存繁殖方式和遗传代谢机制，因而能够产生许多结构新颖、生物活性显著的化合物。海洋真菌可以经过发酵工程的手段进行多次规模化发酵，获得大量发酵产物，也可通过基因工程的手段获得高产菌株，不会破坏生态平衡，可以很大程度上解决海洋天然药物所面临的药源问题。除此之外，许多研究证实，从海洋动植物中发现的结构新颖的化合物的真正的来源是其共附生微生物，因此近年来海洋真菌引起科学家们的广泛关注，成为了活性天然产物的重要源泉。
现代农业生产中，化学农药的广泛使用造成了严重的环境污染和食品安全问题，更为关键的是，很多病原生物已经对化学农药产生了抗药性，而人们研发新型农药的速度远远跟不上病原生物抗药性形成的速度。海洋真菌具有作为生物农药的巨大潜力，然而，目前对于海洋生物包括海洋真菌药用资源的研究大多集中于医药领域，对于其作为农药的研究和应用还很少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用以及提取方法；所述伊快霉素类化合能够在低浓度的情况下，抑制赤星病菌孢子萌发，而同等浓度下多菌灵并无此效果，所述伊快霉素类化合具有非常大的应用潜力。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用。
优选的，所述伊快霉素类化合物包括伊快霉素和差向伊快霉素。
优选的，所述伊快霉素类化合物能够抑制赤星病菌孢子的萌发。
优选的，所述伊快霉素的最小抑菌浓度MIC为33.47μg/mL。
优选的，所述差向伊快霉素的最小抑菌浓度MIC为133.87μg/mL。
本发明还提供了所述的应用中伊快霉素类化合物的提取方法，包括以下步骤：
1)将保藏编号为CGMCC 14348的海洋真菌进行发酵培养获得发酵产物；
2)将所述发酵产物依次用乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷混合液、甲醇浸泡后，减压浓缩后收集水相；
3)将所述水相经乙酸乙酯萃取后溶解于甲醇水溶液中，用石油醚进行萃取后，甲醇溶液浓缩干燥获得粗提物；
4)将所述粗提物依次进行减压硅胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析和高效液相色谱分离获得伊快霉素类化合物。
优选的，步骤2)中所述的甲醇-二氯甲烷混合液中甲醇和二氯甲烷的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
优选的，步骤3)中所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为85％～95％。
优选的，所述减压硅胶柱层析的固定相为100～200目正相硅胶，流动相依次为10％乙酸乙酯-石油醚混合溶剂和100％乙酸乙酯。
优选的，所述ODS反相硅胶柱层析的填料粒径为48-63μm。
本发明的有益效果：本发明提供的伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用，所述伊快霉素类化合能够在低浓度的情况下，抑制赤星病菌孢子萌发，最小抑菌浓度MIC为33.47μg/mL或133.87μg/mL；而相同浓度的市售农药多菌灵并不能抑制赤星病菌孢子萌发，由此可见，所述伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中具有非常大的应用潜力。
本发明提供的伊快霉素类化合物的提取方法，能够快速高效的从保藏编号为CGMCC 14348的海洋真菌的发酵产物中提取获得所述伊快霉素类化合物。
附图说明
图1为伊快霉素和差向伊快霉素的化学结构式，其中1a为伊快霉素， 1b为伊快霉素的异构体；2a为差向伊快霉素，2b为差向伊快霉素的异构体；
图2为实施例中收集的产物的液相色谱图；
图3为实施例中收集的产物的质谱图；
图4为实施例中收集的产物的核磁1H NMR图。
生物保藏说明
本发明中的木贼镰刀菌Fusarium equiseti GLY27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 14348，保藏日期为2017年7月3号，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
本发明提供了伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用。在本发明中，所述伊快霉素类化合物优选的包括伊快霉素和差向伊快霉素；所述伊快霉素的化学结构式如图1中的1所示，所述差向伊快霉素的化学结构式如图 1中的2所示。在本发明中，所述伊快霉素类化合物优选的能够抑制赤星病菌孢子的萌发，通过抑制赤星病菌孢子的萌发来实现抗烟草赤星病的作用。在本发明中，所述伊快霉素的最小抑菌浓度MIC为33.47μg/mL；所述差向伊快霉素的最小抑菌浓度MIC为133.87μg/mL。本发明中所述的伊快霉素类化合物能够在较低的浓度水平抑制赤星病菌孢子的萌发，抑制作用显著，用量少，具有非常大的应用潜力。
本发明还提供了所述的应用中伊快霉素类化合物的提取方法，包括以下步骤：1)将保藏编号为CGMCC 14348的海洋真菌进行发酵培养获得发酵产物；2)将所述发酵产物依次用乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷混合液、甲醇浸泡后，减压浓缩后收集水相；3)将所述水相经乙酸乙酯萃取后溶解于甲醇水溶液中，用石油醚进行萃取后，甲醇相浓缩干燥获得粗提物；4)将所述粗提物依次进行减压硅胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析和高效液相色谱分离获得伊快霉素类化合物。
在本发明中，首先将保藏编号为CGMCC 14348的海洋真菌进行发酵培养获得发酵产物。在本发明中，所述发酵培养优选的包括活化培养和发酵两个阶段，所述活化培养的培养基优选为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；所述活化培养的温度优选为27～29℃，更优选为28℃，所述活化培养的时间优选为 6～8d，更优选为7d。在本发明中，所述发酵的培养基优选为大米固体培养基，所述大米固体培养基优选的包括大米和水；所述大米和水的质量体积比优选为40g:30mL；所述发酵的温度优选为27～29℃，更优选为28℃；所述发酵的时间优选为28～32d，更优选为30d。
本发明在所述发酵完成后，将所述发酵产物依次用乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷混合液、甲醇浸泡后，减压浓缩后收集水相。在本发明中，所述乙酸乙酯的体积优选为发酵产物体积的1～2倍，更优选为1.5倍；所述乙酸乙酯浸泡的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述乙酸乙酯浸泡的目的是杀死菌体和充分提取次级代谢产物。在本发明中，在所述乙酸乙酯浸泡结束后，过滤后浓缩至干。菌体继续采用甲醇-二氯甲烷混合液浸泡；所述甲醇-二氯甲烷混合液中甲醇和二氯甲烷的体积比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，更优选为1:1；所述甲醇-二氯甲烷混合液的体积为所述发酵产物体积的1～2倍，更优选为1.5倍；所述甲醇-二氯甲烷混合液浸泡的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h，所述甲醇-二氯甲烷混合液浸泡的目的是充分提取次级代谢产物。本发明在所述甲醇-二氯甲烷混合液浸泡后，采用甲醇浸泡，所述甲醇的体积优选为所述发酵产物体积的1～2倍，更优选为1.5倍，所述甲醇浸泡的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述甲醇浸泡的目的是充分提取次级代谢产物。本发明在所述甲醇浸泡结束后，进行减压浓缩收集水相。
本发明将所述水相经乙酸乙酯萃取后浓缩至干，溶解于甲醇水溶液中，用石油醚进行萃取后，浓缩干燥获得粗提物。在本发明中，所述乙酸乙酯的体积优选为所述水相体积的1.5～2.5倍，更优选为2倍；所述乙酸乙酯萃取的时间优选为0.5h；所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度优选为85％～95％，更优选为90％。在本发明中，所述石油醚的体积为；所述石油醚萃取的时间为0.5h。在本发明中，浓缩干燥的方法优选为旋转蒸发仪浓缩。
本发明在获得所述粗提物后，优选的对所述粗提物进行抗菌活性测定。本发明中所述抗菌活性测定优选的包括琼脂扩散法和生长速率法；本发明对所述琼脂扩散法和生长速率法没有特殊限定，采用本领域常规的上述方法步骤即可。本发明在获得所述粗提物后，优选的还包括采用LCMS和1H NMR 方法考察粗提物中次级代谢产物的结构类型、结构新颖性和丰富性。
本发明在获得所述粗提物后，将所述粗提物依次进行减压硅胶柱层析、 ODS反相硅胶柱层析和高效液相色谱分离获得伊快霉素类化合物。在本发明中，所述减压硅胶柱层析的固定相优选为100～200目正相硅胶，在本发明中，所述减压硅胶柱直径优选为4.5cm，所述减压硅胶柱的长优选为50cm，所述减压硅胶柱层析的流动相依次为10％乙酸乙酯-90％石油醚混合溶剂洗脱2L 和100％乙酸乙酯洗脱2L。本发明收集所述100％乙酸乙酯洗脱的洗脱液浓缩后，进行ODS反相硅胶柱层析。在本发明中，ODS反相硅胶柱层析的填料粒径优选为48-63μm。在本发明中，所述ODS反相硅胶柱层析的流动相洗脱优选的依次包括80％甲醇-20％水和85％甲醇-15％水洗脱，本发明收集85％甲醇-水洗脱的洗脱液进行浓缩获得浓缩液；将所述浓缩液经过高效液相色谱分离获得伊快霉素和差向伊快霉素。在本发明中，所述高效液相色谱分离的程序优选为60％乙腈-40％水(水中含0.1％三氟乙酸)，收集57min和 66min出峰的样品。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
海洋真菌F.equiseti，保藏编号CGMCC 14348来源于青岛沿海滩涂植物的菌种培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基：含有马铃薯6g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，其余为水；使用时制成平板培养基，真菌菌株在28℃下培养7 天。
(2)海洋真菌F.equiseti的发酵培养采用大米固体培养基，每500mL锥形瓶中加入大米40g，水30mL，发酵3瓶，真菌菌株于28℃培养30天。
(3)将所得发酵物以乙酸乙酯浸泡1遍，50L，随后用甲醇-二氯甲烷＝1:1 和纯甲醇各浸泡1遍，50L，减压浓缩后将剩余水相(大米中含有水分)经乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯蒸干后的产物溶于90％的甲醇-水中，并采用石油醚进行萃取，将萃取后的90％的甲醇-水溶液旋转蒸发仪40℃浓缩干得到提取物。这样做的目的是能够充分除去大米培养基中的脂肪酸类小极性杂质，避免其干扰。
(4)将提取物浸膏用DMSO溶解，最终配成浓度为10.0mg/L的母液。采用以下两种方法测试海洋真菌提取物对植物病原真菌的抑制活性：
琼脂扩散法：通过摇床培养法获得植物病原真菌孢子，取100μL孢子数为105(个/mL悬液)的菌液均匀涂布于PDA固体平板上，用打孔器在距培养基边缘2cm处打3个位置均匀的孔，并用挑针把琼脂挑出，每孔加入15～20μL 母液，用无菌水作空白对照，DMSO作阴性对照，多菌灵(1.0mg/mL)作阳性对照，用封口膜封好后放到28℃培养箱培养72h，观察真菌生长情况，对有抑菌效果的平板用十字相乘法测量抑菌圈直径。
生长速率法：取100μL母液均匀涂布到PDA平板上，从活化后的植物病原真菌菌落边缘，取3个直径为5mm的菌饼，均匀置于平板上，以DMSO 代替样品作为空白对照。28℃恒温培养72h，采用十字交叉法记录菌饼生长直径，计算抑制率为42.59％。
抑制率(％)＝(1-处理组纯生长量/空白组纯生长量)×100
纯生长量(mm)＝菌饼生长直径(mm)-5
(5)将提取物用甲醇溶解，配置成1mg/mL溶液，采用LCMS和1HNMR 快速考察活性粗提物中次级代谢产物的结构类型、结构新颖性和丰富性。仪器为安捷伦液质联用仪(MSD6545Q-TOF)，质谱参数：ESI负离子，鞘层气体温度350℃，管电压3.5KV，干燥气体10L/min，气体温度325℃，喷雾器30psig，鞘层气体流速：12L/min，喷嘴电压500V。液相参数：A相是0.1％的甲酸水，B相是乙腈，流速0.2mL/min，浓度梯度为：0-3min，5％乙腈； 3-23min，5％-100％乙腈；23-25min，100％乙腈；25-27min，100％-5％乙腈； 27-30min，5％乙腈。通过LC-DAD-MS，了解提取物中各产物质谱裂分、分子量分布、紫外吸收、基本结构等信息，结合1HNMR给出的特征峰信号和该属真菌次级代谢产物在文献数据库中的报道，判断其可能的结构类型，然后根据分子量判断可能的物质；通过LC-DAD-MS还可判断次级代谢产物的丰富性。发现紫外吸收在200，230，295nm有伊快霉素特征峰，质谱374处分子量与伊快霉素相同，核磁1H NMR低场区表现出了伊快霉素特征峰，判断所述海洋真菌次级代谢产物中主要成分为伊快霉素类，并了解了其大致的极性范围，为下一步的分离纯化提供了指导。
将粗提物进行减压硅胶柱层析，固定相为100～200目正相硅胶，流动相为10％乙酸乙酯-石油醚混合溶剂洗脱2L，后100％乙酸乙酯洗脱2L，将 100％乙酸乙酯所得洗脱液浓缩后，再进行ODS(48-63μm)反相硅胶柱层析，流动相为80％甲醇-水除杂，之后用85％甲醇-水洗脱，浓缩洗脱液，得到伊快霉素和差向伊快霉素经过高效液相色谱(X-Brigde C18柱，5μm， 10*250mm，检测波长210-400nm)60％乙腈-水(加0.1％三氟乙酸)得到。
通过质谱和核磁确定了获得的提取物的结构，所得化合物的波谱数据：
伊快霉素Equisetin(1):橙黄色油状物；1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δH 5.39(2H,m,H-4,5),5.26(1H,m,H-14),5.19(1H,m,H-13),4.00(1H,m,H-3), 3.88(1H,m,H-6’),δ3.04(3H,s,H-12),1.79(5H,m,H-7,8,9),1.53(3H,s, H-7’),1.46(3H,dd,J＝22.5Hz,H-15),1.07(2H,m,H-10),0.91(3H,brd, H-16)；13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δC 199.1(C,C-4’),190.5(C,C-1),177.1 (C,C-2’),130.9(CH,C-5),130.0(CH,C-13),127.0(CH,C-4),126.5(CH, C-14),100.0(C,C-3’),66.8(CH,C-5’),60.4(CH2,C-6’),48.7(C,C-2),45.0 (CH,C-3),42.2(CH2,C-7),39.9(C,C-11),38.6(CH,C-6),35.7(CH2,C-9), 33.5(CH,C-8),28.3(CH3,C-10),27.3(CH3,C-7’),22.5(CH3,C-16),17.9(CH3, C-15),14.0(CH3,C-12)；ESIMSm/z 374.23[M+H]+,396.22[M+Na]+.
差向伊快霉素Epi-equisetin(2):橙黄色油状物；1H NMR(DMSO-d6,500 MHz)δ5.38(2H,m,H-4,5),5.24(1H,m,H-14),5.14(1H,m,H-13),4.03(1H, m,H-3),3.85(1H,dd,J＝11.5,4.0Hz,H-6’),δ3.03(3H,s,H-12),1.80(5H,m, H-7,8,9),1.50(3H,s,H-7’),1.45(3H,brd,H-15),1.07(2H,m,H-10),0.90(3H, d,J＝6.5Hz H-16)；13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ199.0(C,C-4’),190.7(C, C-1),177.0(C,C-2’),130.8(CH,C-5),130.0(CH,C-13),127.1(CH,C-4), 126.6(CH,C-14),100.3(C,C-3’),66.4(CH,C-5’),60.1(CH2,C-6’),48.8(C, C-2),44.9(CH,C-3),42.2(CH2,C-7),39.9(C,C-11),38.5(CH,C-6),35.7(CH2, C-9),33.5(CH,C-8),28.3(CH3,C-10),27.2(CH3,C-7’),22.4(CH3,C-16),17.8 (CH3,C-15),14.0(CH3,C-12)；ESIMS m/z 374.23[M+H]+.
伊快霉素和差向伊快霉素对烟草赤星病的MIC测定：
具体测试方法为微量稀释法：活化供试真菌于PDA平板上，培养5～7d，在真菌平板中加入适量无菌水，用无菌枪尖轻轻刮菌丝，使孢子悬浮在水中。血球计数板法计算孢子数量，并稀释至105个/mL。将待测化合物用DMSO 配成10mg/mL母液。在96孔板第1列的第1孔加196μL的菌液，余下2～8 孔各加100μL菌液，吸取4μL母液加入第1孔，混合均匀。采用二倍稀释法将1～8孔依次稀释，第8孔混匀后吸取100μL打掉。在1～8孔各加100μL 菌液，使每孔总体积为200μL。用无菌水作空白对照，DMSO作阴性对照，多菌灵作阳性对照。3～5d后，与阳性药比较观察孔内有无菌丝，得出化合物 MIC值。
测得伊快霉素和差向伊快霉素对烟草赤星病的MIC分别为33.47μg/mL 和133.87μg/mL，这是抑制孢子萌发的浓度，值得注意的是，常用的抗真菌农药多菌灵在此浓度下无法抑制赤星病菌的孢子萌发，因此这两个化合物具有非常大的应用潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.伊快霉素类化合物在抗烟草赤星病中的应用，其特征在于，所述伊快霉素类化合物为伊快霉素或差向伊快霉素。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述伊快霉素类化合物能够抑制赤星病菌孢子的萌发。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述伊快霉素类化合物的提取方法，包括以下步骤：
1)将保藏编号为CGMCC 14348的海洋真菌进行发酵培养获得发酵产物；
2)将所述发酵产物依次用乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷混合液、甲醇浸泡后，减压浓缩后收集水相；
3)将所述水相经乙酸乙酯萃取后溶解于甲醇水溶液中，用石油醚进行萃取后，浓缩干燥获得粗提物；
4)将所述粗提物依次进行减压硅胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析和高效液相色谱分离获得伊快霉素类化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述的甲醇-二氯甲烷混合液中甲醇和二氯甲烷的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为85％～95％。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述减压硅胶柱层析的固定相为100～200目正相硅胶，流动相依次为10％乙酸乙酯/90％石油醚和100％乙酸乙酯。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述ODS反相硅胶柱层析的填料粒径为48-63μm。
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