CN117510441B - 一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A及其制备方法 - Google Patents
一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物农药制备技术领域，具体公开一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A及其制备方法，所述酮类化合物为penlactone A，其结构如下所示：。从滇重楼新鲜种子中分离得到的2株内生真菌：球黑孢菌CLG‑4‑1和青霉菌CLG‑31，并将上述两株内生真菌同时接种于宿主培养基中扩大发酵，分离纯化后得到酮类化合物penlactone A，该化合物对两种植物病原菌F.oxysporum和N.sphaerica有一定的抑制活性，其MICs值分别为16和8µg/mL，该制备方法成本低，过程简单，环境友好，可大量生产，满足了低碳经济的需求，而且为后期penlactone A的进一步研究和生物农药的开发奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物农药制备技术领域，本具体涉及一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A及其制备方法。
背景技术
微生物次生代谢物被视为新型药物和农用化学分子的重要来源。随着基因组数据的增加，已经发现了许多生物合成基因簇，但大多数的生物合成基因簇处于沉默状态。近年来，研究人员尝试了不同的策略来刺激微生物沉默基因簇的表达，增强微生物天然产物的分子多样性。但最方便的方法是微生物共同培养，它们之间的竞争或协同关系可以激活沉默的生物合成基因，产生单培养中不存在的隐性天然产物，从而为研究发现新型的生物农药化合物提供了途径。
发明内容
本发明一个目的是提供了一个可以通过微生物共培养发酵得到的、新的具有抑制植物病原菌的酮类化合物，为研究发现新型的生物农药化合物提供了途径。
具体的，本发明提供的一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A，其结构如下所示：
。
本发明的另一个目的是提供一种通过微生物共培养制备penlactone A的生物方法，利用N. sphaerica和Penicillium sp.共培养制备penlactone A，提纯后纯度可达到90~93%。该发明具有成本低，过程简单，环境友好，易于大量生产等特点。
进一步的，本发明提供的一种利用宿主培养基对微生物共培养生产生物菌剂penlactone A的方法。
包括以下步骤：
（1）将球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）CLG-4-1和青霉菌（Penicillium sp.）CLG-31同时接种于宿主培养基中扩大发酵，得到共培养发酵物，球黑孢菌和青霉菌的保藏编号分别为CCTCC NO: M 20231755 和CCTCC NO: M 20231753；
（2）将所述步骤（1）得到的共培养发酵物依次经过有机溶剂萃取、过滤和浓缩得到粗提物；将粗提物进行一系列的色谱纯化，得到所述化合物penlactone A。
优选的，所述步骤（1）中宿主培养基的制作方式为： 180 g土豆去皮洗净切成体积为1 cm3的土豆块、切片厚度为0.1 cm的20 g滇重楼干燥块根、20 g葡萄糖，加入1 L水煮制而成，所述发酵方式为液体发酵。
优选的，所述步骤（1）中发酵条件是在28 °C、150 rpm下进行发酵7d。
进一步的，所述步骤（2）中极性有机溶剂为乙酸乙酯，共培养发酵物与乙酸乙酯的体积比为1:1，重复萃取多次，真空浓缩得到粗提物。
优选的，所述色谱纯化方法为硅胶柱色谱洗脱，步骤为：
S1：用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液将所述粗提物溶解，得到粗提物溶液；
S2：将所述粗提物溶液与粗提物干重质量1.0~1.2倍的硅胶混合，烘干溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、50:1、10:1的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，得到三个馏分Fractions A、Fractions B、Fractions C；其中，取Fractions B以体积比为5:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，再以体积比为25:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到化合物penlactone A，再通过 1D-、2D-NMR，HR-ESI-MS，IR等鉴定手段得到化合物结构。
优选的，硅胶柱所用硅胶的粒径为300~400目。
本发明提供的活性化合物penlactone A或上述制备方法在农业病害防治中的应用。
进一步的，所述应用为制备杀菌剂，所述杀菌剂防治病害为植物病原菌Fusariumoxysporum和Nigrospora sphaerica感染引起的病害。
本发明达到的技术效果：
本发明提供的化合物penlactone A是具有新颖结构的酮类化合物，对该化合物的抗菌活性筛选试验表明，它对两种植物病原菌F. oxysporum和N. sphaerica有一定的抑制活性，MICs值分别为16和8 µg/mL。
本发明提供的抗植物病原菌活性化合物penlactone A为N. sphaerica-Penicillium sp.共培养的代谢产物，通过微生物发酵制备得到，制备方法周期短、培养条件温和、立体选择性强、成本低，易于实现工业化，符合现代环保和低碳经济的需求。
本发明利用宿主培养基将N. sphaerica和Penicillium sp.进行共培养，激活了菌株的生物合成基因，得到了一个新的酮类化合物penlactone A，其对两种植物病原菌F.oxysporum和N. sphaerica有一定的抑制活性，MICs值分别为16和8 µg/mL。因此，penlactone A具有作为先导化合物开发生物农药的研究价值。
附图说明
图1球黑孢菌CLG-4-1形态图；
图2球黑孢菌CLG-4-1构建的系统发育树显示图；
图3青霉菌CLG-31形态图；
图4青霉菌CLG-31构建的系统发育树显示图；
图5为化合物penlactone A的1H-NMR谱图；
图6为化合物penlactone A的13C-NMR谱图；
图7为化合物penlactone A的HMBC谱图；
图8为化合物penlactone A的HSQC谱图；
图9为化合物penlactone A的1H-1H COSY谱图；
图10为化合物penlactone A的NOESY谱图；
图11为化合物penlactone A的IR谱图；
图12为化合物penlactone A的HR-ESI-MS谱图；
图13为化合物penlactone A的实验和计算ECD谱图。
具体实施方式
下面结合实施对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换及改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内，本发明所用分析纯试剂，未特别说明的均可以由市场购买，本发明中所用的二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯有机溶剂。
本发明中：
球黑孢菌（N. sphaerica）CLG-4-1，保藏名称为Nigrospora sphaerica CLG-4-1,保藏编号为CCTCC NO：M 20231755，保藏地址为中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，该培养物已于2023年09月20日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保存三十年，在期满前收到提供该培养物样品的请求后再延续保存五年，该培养物的存活性由保藏中心于2023年09月27日检测完毕，结果为存活。
青霉菌（Penicillium sp.）CLG-31，保藏名称为Penicillium sp. CLG-31，保藏编号为CCTCC NO：M 20231753，保藏地址为中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，该培养物已于2023年09月20日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保存三十年，在期满前收到提供该培养物样品的请求后再延续保存五年，该培养物的存活性由保藏中心于2023年09月27日检测完毕，结果为存活。
本发明提供的一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A，其结构如下所示：
。
实施例1 菌株分离、鉴定
将采自云南文山的野生滇重楼次氯酸钠溶液（有效氯浓度 5.0 %）、75 %乙醇浸泡和无菌水洗涤工艺进行表面灭菌，然后把处理成小块的植物组织植入121 °C、灭菌30 min的 PDA培养基中，25 °C 培养4天后使用121 °C、灭菌30 min的 PDA培养基连续纯化得到菌株CLG-4-1和CLG-31，并将菌株接种于 PDA 斜面培养基中，在 4°C 冰箱中保存。
将菌株CLG-4-1在PDA培养基上培养，菌落形态如图1所示：菌落絮状，正背面均为白色，边缘均匀，气生菌丝发达，生长较快（28 ℃培养2~3 d），菌丝有隔，无色，分枝，呈放射状。
将菌株CLG-4-1测序得到ITS基因序列经过拼接处理，确定其可信区间序列如下：
AGCTACCCGGGACCTCGCGCCCCGGGCGGCCCGCCGGCGGACAAACCAAACTCTGTTATCTTCGTTGATTATCTGAGTGTCTTATTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTAAGCACAGCTTATTGTTGGGCGTCTACGTCTGTAGTGCCTCAAAGACATTGGCGGAGCGGCAGCAGTCCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTATCTCGCTTCTGTTAGGCGCTGCCCCCCCGGCCGTAAAACCCCCAATTTTTTCTGGTTGACCTCGGATCAGGT
将获得的菌株CLG-4-1的可信区间序列，在GenDank序列数据库中进行同源序列搜索，整理相关菌株的ITS的序列用GlustalX软件进行多序列比对，通过MEGA7.0软件用Maximum Likelihood法构建系统发育树（如图2所示），在分枝上标记500次重复获得自展检验Bootstrap值以评估系统发育树的置信度。结果显示菌株CLG-4-1与球黑孢菌Nigrospora sphaerica MEBP0014 ITS基因序列的相似度达到 99.98%，且聚于同一个分支，支持率为 72%，依据其菌落特征、孢子特征和系统发育分析，鉴定菌株CLG-4-1为Nigrospora sphaerica，保藏编号为CCTCC NO: M 20231755。
将菌株CLG-31在PDA培养基上培养，菌落形态如图3所示：菌落为圆形，颜色为白色，直径为2-6 mm，7天后，菌落颜色为浅绿色，质地绒状、光滑，孢子扩散速度快；菌落背面随生长周期慢慢变至黄色。
将菌株CLG-31测序得到ITS基因序列经过拼接处理，确定其可信区间序列如下：
TGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTTGTGGCCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCTAGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCAAACTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATA
通过上述相同方法构建系统发育树（如图4所示），结果显示菌株CLG-31'与青霉菌Penicillium virgatum FCR16 ITS基因序列的相似度达到 99.88%，且聚于同一个分支，支持率为 98%，依据其菌落特征、孢子特征和系统发育分析，鉴定菌株CLG-31'为Penicilliumvirgatum，保藏编号为CCTCC NO: M 20231753。
实施例2 制备化合物penlactone A
1、菌体活化：将球黑孢菌CLG-4-1和青霉菌CLG-31分别接种到经过121 °C、灭菌30min的PDA斜面培养基，置于28 °C恒温培养箱中培养3 d后，得到活化后的菌株置于4 ℃环境中备用。
2、宿主培养基的制备：将 180 g土豆去皮洗净切成体积为1 cm3的土豆块、切片厚度为0.1 cm的20 g滇重楼干燥块根、20 g葡萄糖，加入1 L水煮制而成。
3、发酵过程：将活化的2株菌同时接种到经过121 °C、灭菌30 min的宿主培养基中，28 °C、150 rpm下进行发酵7d。
4、发酵结束后，用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液，真空浓缩得到粗提物54.2 g。
5、用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液将所述粗提物溶解，得到粗提物溶液。将所述粗提物溶液与粗提物干重质量1.0~1.2倍的硅胶混合，烘干溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、50:1、10:1的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，从得到三个馏分Fractions A、Fractions B、Fractions C；其中，取Fractions B以体积比为5:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，再以体积比为25:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到化合物penlactone A，再通过 1D-、2D-NMR，HR-ESI-MS，IR等鉴定手段得到化合物结构。
实施例3 penlactone A结构鉴定（参看图5～13）
本发明通过1D/2D NMR（一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱）、IR（红外）以及HR-ESI-MS对化合物penlactone A的结构进行鉴定，通过1H、13C、HMBC、HSQC、ROESY以及1H-1HCOSY的核磁数据，结合IRHR-ESI-MS和确定其结构。
由1H-NMR和13C-NMR，结合HSQC谱可以得到该化合物的对应C和H相连接的化学位移。
表1 penlactone A的1H-NMR和13C-NMR数据 (δ in ppm, J in Hz, in CDCl3)
penlactone A：黄色油状物，+15.89 (c 0.1, CH3OH)。其HR-ESI-MS准分子离子峰m/z 为173.0808 [M + H]+，表明其分子式为C8H12O4，确定其不饱和度为3。红外光谱在1728 cm-1和1123 cm-1处显示吸收带，表明其存在羰基和醚键。根据1H-NMR和13C-NMR波谱数据显示（表1），化合物中含有2个甲基 [δH1.35 (3H, d, J = 7.1 Hz, H-7), δH2.29 (3H,s, H-6); δC15.3 (C-7), δC30.1 (C-6)]；1个含氧甲基 [δH3.58 (3H, s, H-8) ; δC58.0(C-8)]；2个次甲基 [δH2.96 (1H, m, H-2); δH3.03 (1H, dd, J = 9.2, 5.3 Hz, H-3) ;δC37.6 (C-2), δC61.8 (C-3)]；1个含氧次甲基 [δH5.32 (1H, d, J = 5.3 Hz, H-4); δC100.3 (C-4)]；2个羰基 [δC175.7 (C-1), δC203.4 (C-5)]。从该化合物的NMR数据可以看出，其类似于文献报道的(3S, 4S)-(-)-3-acetyl-2-methyl-2(3H)-dihydrofura-none，但两个化合物的主要差异是该化合物中C-4位多了一个甲氧基，导致了C-4的化学位移向低场移动（δC+37.2）。在HMBC中甲氧基的H-8与C-4相关，从而推断出-OCH3与C-4相连。在1H-1HCOSY谱中，可以确定H-2/H-7以及H-3/H-4的相关，结合HMBC谱中的H-2与C-4的相关，H-4与C-1的相关，H-6与C-3、C-5的相关以及H-7与C-1、C-2、C-5的相关，确证了该化合物的平面结构。
为了确定该化合物的立体构型，对其NOESY谱进行了分析，可以观察到H-3/H-7和H-2/H-4的相关，从而确定了其相对构型为2S*, 3S*, 4S*。进一步提高ECD计算，其中2S,3S, 4S的ECD计算谱图与实验谱图高度拟合。因此，确定该化合物的绝对构型为2S, 3S,4S，并命名为penlactone A。
实施例4 抗菌活性筛选
本实验选择宿主滇重楼的内生菌球黑孢菌N. sphaerica和尖孢镰孢菌Fusariumoxysporum作为病原指示菌，通过二倍稀释法测定化合物penlactone A的抗菌活性，以制霉菌素作为阳性对照。具体实验步骤如下所示：
1、菌体活化：将球黑孢菌N. sphaerica和尖孢镰孢菌F. oxysporum分别接种到经过121 °C、灭菌30 min的PDA斜面培养基，置于28 °C恒温培养箱中培养5 d后，得到活化后的菌株。
2、菌种制备：将活化好的2株菌分别接种到经过121 °C、灭菌30 min的含有PDB培养基的试管中培养，再培养两瓶不加菌株的空白PDB培养基，28 °C、150 rpm培养2~3天至刚长出菌丝体。
3、抗菌活性测定：先准备10 μL、200 μL以及1000 μL移液枪枪头若干和2个塑料凹槽，用报纸密封后进行121 ℃、灭菌30 min，结束后取出放入烘箱中烘干备用。然后使用电子分析天平称取0.5 mg的penlactone A以及制霉菌素置于1.5 ml的EP管中用DMSO溶解，配制成浓度为10.24 mg/mL的溶液。
首先，将浓度为10.24 mg/mL的样品溶液吸取5 μL分别加入96孔板的第1孔和第2孔，然后加85 μL的PDB培养基稀释；除11孔外，第3~12孔，均加90 μL的PDB培养基。
其次，用移液枪从第2孔取90 μL混合溶液至第3孔中混匀，之后用二倍法依次稀释，最终1-10 孔的样品浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/mL，第12孔不加入样品作为阴性对照。
最后，取200 μL病原指示菌用PDB培养基稀释50倍后，除11孔外，其余孔均加入10μL病原菌菌液。将处理好的96孔板置于28 ℃恒温箱中培养16~18 h后观察，从而测得化合物的最小抑制浓度 MIC值。
实验结果表明，penlactone A对两种植物病原菌F. oxysporum和N. sphaerica有一定的抑制活性，MICs值分别为16和8 µg/mL。
表2化合物penlactone A的抗菌活性（MICs at μg/mL）
因此，penlactone A具有作为先导化合物开发生物农药的研究价值。而基于微生物发酵的方法，不仅可以实验环保低碳的需求，而且还能实现量产新途径。
Claims (9)
1.一种具有抗植物病原菌活性的酮类化合物penlactone A，其结构如下所示：
。
2.权利要求1所述的化合物penlactone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）CLG-4-1和青霉菌（Penicillium sp.）CLG-31同时接种于宿主培养基中扩大发酵，得到共培养发酵物，球黑孢菌和青霉菌的保藏编号分别为CCTCC NO: M 20231755 和CCTCC NO: M 20231753；
（2）将所述步骤（1）得到的共培养发酵物依次经过有机溶剂萃取、过滤和浓缩得到粗提物；将粗提物进行一系列的色谱纯化，得到所述化合物penlactone A。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中宿主培养基由180 g土豆、20 g滇重楼干燥块根、20 g葡萄糖、1 L水构成。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵条件为28 °C、150 rpm下进行发酵7d。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述有机溶剂为乙酸乙酯，共培养发酵物与乙酸乙酯的体积比为1:1，重复萃取多次，真空浓缩得到粗提物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述色谱纯化方法为硅胶柱色谱洗脱，步骤为：
S1：用体积比为1:1的氯仿-甲醇溶液将所述粗提物溶解，得到粗提物溶液；
S2：将所述粗提物溶液与粗提物干重质量1.0~1.2倍的硅胶混合，烘干溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、50:1、10:1的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，从得到三个馏分Fractions A、Fractions B、Fractions C；其中，取Fractions B以体积比为5:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，再以体积比为25:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到化合物penlactone A。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，硅胶柱所用硅胶的粒径为300~400目。
8.根据权利要求1所述的化合物penlactone A在农业病害防治中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为制备杀菌剂，所述杀菌剂防治病害为植物病原菌Fusarium oxysporum和Nigrospora sphaerica感染引起的病害。
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