CN115850354A - 一种聚酮类化合物efrotomycin及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚酮类化合物efrotomycin及其制备方法和应用。所述聚酮类化合物efrotomycin的结构式如式(I)所示。本发明从放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的发酵培养物中分离得到了4个新的聚酮类化合物efrotomycins A1‑A4(1‑4)，并在异源宿主S.lividans SBT18成功表达了包含efrotomycin生物合成基因簇的BAC质粒pCSG8112，产生了新化合物efrotomycin B1(5)。聚酮类化合物efrotomycins(1‑5)具有抗藤黄微球菌和链霉菌活性，能用于制备抗藤黄微球菌和链霉菌的活性药物。

Description

一种聚酮类化合物efrotomycin及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于工业微生物领域，具体涉及聚酮类化合物efrotomycins A1-A4和efrotomycin B1及其制备方法和应用。

背景技术：

Efrotomycin属于elfamycin家族抗生素，作用于细菌延长因子从而抑制蛋白质合成，因而具有窄谱抗菌活性。本发明从放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679中分离得到了新颖的糖基化elfamycin抗生素：efrotomycins A1-A4，并通过异源表达efrotomycin的生物合成基因簇获得了非糖基化的efrotomycin B1。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供聚酮类化合物efrotomycin及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供聚酮类化合物efrotomycins A1-A4(1-4)和efrotomycin B1(5)，其结构如式(I)所示：

本发明的第二个目的是提供一种重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112，其特征在于，是将聚酮类化合物efrotomycin的生物合成基因簇转化到Streptomyces lividansSBT18中而获得。

本发明的第三个目的是提供放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679在制备所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4中的应用。

本发明的第四个目的提供是重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112在制备聚酮类化合物efrotomycin B1中的应用。

本发明的第五个目的提供所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4的制备方法，其特征在于，所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4是从放线菌A.cihanbeyliensisDSM 45679的发酵培养物中分离得到的。

优选，具体步骤为：

a、将放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679用AM3培养基发酵培养，获得发酵培养物，离心分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用大孔树脂XAD-16吸附，然后用丙酮洗脱；菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞，两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，得到放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的AM3培养基粗提物；

b、将粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，依次从体积比100:0，10:1，4:1，2:1，0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比10:1洗脱下来的流分Fr.2；流份Fr2经正相硅胶柱层析分离，从环己烷/乙酸乙酯2:1、环己烷/乙酸乙酯1:1、环己烷/乙酸乙酯1:2、乙酸乙酯、丙酮，v/v为洗脱剂进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯洗脱的流份Fr2-4；流份Fr2-4用凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1:1，v/v为洗脱剂进行分离，得到流份Fr2-4-1-Fr2-4-4；流份Fr2-4-2经中压反相色谱，以水和乙腈为洗脱剂进行梯度洗脱，得到流份Fr2-4-2-1-Fr2-4-2-13；流份Fr2-4-2-8经半制备HPLC纯化得到化合物efrotomycin A1和efrotomycinA2；流份Fr2-4-2-7经半制备HPLC纯化得到化合物efrotomycin A3和efrotomycin A4。

优选，放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679发酵培养的方法为：将活化的放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679接入AM3培养基中，28℃，200rpm培养3d得到种子液；将种子液以10％，v/v的接种量接入AM3培养基中，28℃，200rpm培养5-7d后得到发酵培养物；AM3培养基：黄豆粉5g，细菌学蛋白胨15g，可溶性淀粉15g，甘油15g，CaCO₃ 2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH 7.2-7.4。

本发明的第六个目的是提供聚酮类化合物efrotomycin B1的制备方法，其特征在于，所述的聚酮类化合物efrotomycin B1是从重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的发酵培养物中分离得到的。

优选，具体步骤为：

a、将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112用AM3培养基发酵培养，获得发酵培养物，离心分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用大孔树脂XAD-16吸附，然后用丙酮洗脱；菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞，两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，得到重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的AM3培养基粗提物；

b、将粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v进行梯度洗脱，依次得到流份Fr1-Fr4；将氯仿/甲醇4:1，v/v洗脱的流份Fr2用凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1:1，v/v为洗脱剂进行分离，得到流份Fr2-1-Fr2-4；流份Fr2-2经半制备HPLC纯化得到化合物efrotomycin B1。

优选，重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112发酵培养的方法为：将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112接入AM3培养基中，28℃，200rpm培养5-7d后得到发酵培养物。

本发明的第七个目的是提供所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4、efrotomycin B1或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。所述的抗菌药物是抗藤黄微球菌和链霉菌的药物。

本发明从放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的AM3培养基发酵培养物中分离得到了4个新化合物efrotomycins A1-A4，并在异源宿主S.lividans SBT18成功表达了包含聚酮类化合物efrotomycin生物合成基因簇的BAC质粒pCSG8112，产生了新化合物efrotomycin B1；聚酮类化合物efrotomycins A1-A4和efrotomycin B1具有抗藤黄微球菌和链霉菌活性，能用于制备抗藤黄微球菌和链霉菌的活性药物。

本发明的放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679公开于文献：Tatar,D.；Sazak,A.；Guven,K.；Cetin,D.；Sahin,N.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2013,63,3739-3743。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。

本发明的异源表达宿主链霉菌S.lividans SBT18公开于文献：Peng,Q.Y.；Gao,G.X.；Lu,J.；Long,Q.S.；Chen,X.F.；Zhang,F.；Xu,M.；Liu,K.；Wang,Y.M.；Deng,Z.X.；Li,Z.Y.；Tao,M.F.Front.Microbiol.2018,9。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。

附图说明：

图1是聚酮类化合物efrotomycins A1-A4和efrotomycin B1的化合物结构。

图2是efrotomycin生物合成基因簇示意图。

图3是efrotomycin生物合成基因簇在BAC质粒pCSG8112中的位置。

图4是efrotomycin生物合成基因簇在S.lividans SBT18中异源表达的HPLC图谱。(i)异源表

达宿主菌S.lividans SBT18包含质粒pSET152；(ii)异源表达宿主菌S.lividansSBT18包含质粒pCSG8112；(iii)化合物efrotomycins A1-A4(1-4)的标准品。

图5是化合物1-5对链霉菌毒性的纸片扩散实验。

图6是化合物efrotomycin A1(1)的HR-ESI-MS谱图。

图7是化合物efrotomycin A1(1)的¹H NMR(δ_H 7.70-4.20)谱图。

图8是化合物efrotomycin A1(1)的¹H NMR(δ_H 4.20-0.50)谱图。

图9是化合物efrotomycin A1(1)的¹³C和DEPT135 NMR谱图。

图10是化合物efrotomycin A1(1)的HSQC谱图。

图11是化合物efrotomycin A1(1)的COSY谱图。

图12是化合物efrotomycin A1(1)的HMBC谱图。

图13是化合物efrotomycin A1(1)的ROESY谱图。

图14是化合物efrotomycin A1(1)的J-HMBC谱图。

图15是化合物efrotomycin A2(2)的HR-ESI-MS谱图。

图16是化合物efrotomycin A2(2)的¹H NMR(δ_H 7.70-4.10)谱图。

图17是化合物efrotomycin A2(2)的¹H NMR(δ_H 4.20-0.40)谱图。

图18是化合物efrotomycin A2(2)的¹³C和DEPT135 NMR谱图。

图19是化合物efrotomycin A2(2)的HSQC谱图。

图20是化合物efrotomycin A2(2)的COSY谱图。

图21是化合物efrotomycin A2(2)的HMBC谱图。

图22是化合物efrotomycin A2(2)的ROESY谱图。

图23是化合物efrotomycin A2(2)的J-HMBC谱图。

图24是化合物efrotomycin A3(3)的HR-ESI-MS谱图。

图25是化合物efrotomycin A3(3)的¹H NMR(δ_H 7.70-4.00)谱图。

图26是化合物efrotomycin A3(3)的¹H NMR(δ_H 4.00-0.50)谱图。

图27是化合物efrotomycin A3(3)的¹³C和DEPT135 NMR谱图。

图28是化合物efrotomycin A3(3)的HSQC谱图。

图29是化合物efrotomycin A3(3)的COSY谱图。

图30是化合物efrotomycin A3(3)的HMBC谱图。

图31是化合物efrotomycin A3(3)的ROESY谱图。

图32是化合物efrotomycin A3(3)的J-HMBC谱图。

图33是化合物efrotomycin A4(4)的HR-ESI-MS谱图。

图34是化合物efrotomycin A4(4)的¹H NMR(δ_H 7.70-4.00)谱图。

图35是化合物efrotomycin A4(4)的¹H NMR(δ_H 4.10-0.60)谱图。

图36是化合物efrotomycin A4(4)的¹³C和DEPT135 NMR谱图。

图37是化合物efrotomycin A4(4)的HSQC谱图。

图38是化合物efrotomycin A4(4)的COSY谱图。

图39是化合物efrotomycin A4(4)的HMBC谱图。

图40是化合物efrotomycin A4(4)的ROESY谱图。

图41是化合物efrotomycin A4(4)的J-HMBC谱图。

图42是化合物efrotomycin B1(5)的HR-ESI-MS谱图。

图43是化合物efrotomycin B1(5)的¹H NMR(δ_H 7.80-4.00)谱图。

图44是化合物efrotomycin B1(5)的¹H NMR(δ_H 4.20-0.50)谱图。

图45是化合物efrotomycin B1(5)的¹³C和DEPT135 NMR谱图。

图46是化合物efrotomycin B1(5)的HSQC谱图。

图47是化合物efrotomycin B1(5)的COSY谱图。

图48是化合物efrotomycin B1(5)的HMBC谱图。

图49是化合物efrotomycin B1(5)的ROESY谱图。

图50是化合物efrotomycin B1(5)的J-HMBC谱图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。

1.放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679中efrotomycins A1-A4的分离

通过培养基筛选，选用AM3培养基对放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679进行放大发酵培养，萃取后获得发酵粗提物，然后采用正相、反相、凝胶、HPLC等分离手段从发酵粗提物分离得到了4个聚酮类化合物efrotomycins A1-A4(图1)。

2.聚酮类化合物efrotomycins A1-A4生物合成基因簇的定位与异源表达

聚酮类化合物efrotomycins A1-A4属于elfamycin家族抗生素，以elfamycin家族抗生素中已报道的kirromycin生物合成基因簇为导向，通过比较基因组学在放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的基因组中定位了efrotomycin的生物合成基因簇efr(图2)。为验证efr基因簇是否负责efrotomycins的合成，将筛选得到的包含efr基因簇的BAC质粒pCSG8112进行异源表达，结果在异源宿主S.lividans SBT18中成功表达了efr基因簇(图4)，并分离得到了异源表达产物efrotomycin B1。

3.聚酮类化合物efrotomycins A1-A4和efrotomycin B1的生物活性评价

采用Mueller-Hinton肉汤微量稀释法对聚酮类化合物efrotomycins A1-A4和efrotomycin B1进行抗菌活性评价，发现5个化合物对藤黄微球菌Micrococcus luteusSCSIO ML01均具有中等程度的抑制作用。采用纸片扩散实验测试化合物1-5对3个链霉菌的毒性，发现5个化合物对链霉菌S.albus Del14均具有毒性，efrotomycins A1(1)和efrotomycin B1(5)对链霉菌S.lividans SBT18和S.coelicolor YF11也有毒性(图5)。

以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不是对本发明的限制。

实施例1：聚酮类化合物efrotomycins A1-A4的分离和制备

1.放大发酵培养

将放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679在ISP4培养基固体平板上活化后，刮取适量菌丝体接种到50mL AM3培养基中，28℃摇床200rpm培养3d得到种子液；将种子液以10％，v/v的接种量接入含200mL AM3培养基(共15L)的三角瓶中，28℃摇床200rpm培养5-7d后得到发酵培养物。

ISP4培养基：可溶性淀粉10g，(NH₄)₂SO₄ 2g，K₂HPO₄ 1g，CaCO₃ 2g，NaCl 1g，MgSO₄·7H₂O 1g，1×微量元素1mL，海盐30g，加纯净水至1L，pH 7.2-7.4。

AM3培养基：黄豆粉5g，细菌学蛋白胨15g，可溶性淀粉15g，甘油15g，CaCO₃ 2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH 7.2-7.4。

2.发酵液的萃取

发酵培养物3900rpm离心20min后分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用2L大孔树脂XAD-16吸附，然后用15L丙酮洗脱；菌丝体用1L甲醇浸提4次，每次超声破碎细胞1h。然后用旋转蒸发仪回收两部分中的有机溶剂，剩余的水相合并后用1L乙酸乙酯萃取10次，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯后得到放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的AM3培养基粗提物。

3.化合物的分离

将放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的AM3培养基粗提物(30.0g)用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解，加入70mL 100-200目硅胶旋蒸拌样，以拌样硅胶(70mL)/分离硅胶(200mL)1:3干法装柱，用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇10:1、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v)，依次得到流份Fr1到Fr5。将流份Fr2(氯仿/甲醇10:1洗脱流份，10.0g)再次用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解，加入20mL 100-200目硅胶旋蒸拌样，以拌样硅胶(20mL)/分离硅胶(100mL)1:5干法装柱，用环己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱(环己烷/乙酸乙酯2:1、环己烷/乙酸乙酯1:1、环己烷/乙酸乙酯1:2、乙酸乙酯、丙酮，v/v)，依次得到流份Fr2-1到Fr2-5。将流份Fr2-4(乙酸乙酯洗脱流份)用SephadexLH-20凝胶柱层析(120cm×3cm，氯仿/甲醇1:1，v/v)进行分离，每10mL接收一瓶，根据TLC检测结果合并得到流份Fr2-4-1到Fr2-4-4。将流份Fr2-4-2(第6-13瓶)经中压反相色谱(YMC*GELODS-A-HG，12nm S-50μm)用A相/B相＝水/乙腈(v/v)根据以下程序进行洗脱：10％B(0-20min)，10％B-20％B(20-30min)，20％B(30-50min)，20％B-30％B(50-60min)，30％B(60-90min)，30％B-40％B(90-110min)，40％B(110-140min)，40％B-50％B(140-150min)，50％B(150-170min)，50％B-70％B(170-180min)，70％B(180-200min)，70％B-90％B(200-210min)，90％B(210-240min)，依次得到流份Fr2-4-2-1到Fr2-4-2-13。

将流份Fr2-4-2-8[40％B-50％B(140-150min)洗脱流份]采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Kinetex C18，250mm×10.0mm，5μm；A相为水，B相为乙腈，48％的B相等度洗脱；流速为2.5mL·min^-1；检测波长为360nm)纯化得到化合物efrotomycin A1(1)(Rt＝20.0min)和efrotomycin A2(2)(Rt＝22.0min)。将流份Fr2-4-2-7[40％ B(110-140min)洗脱流份]采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Kinetex C18，250mm×10.0mm，5μm；A相为水，B相为乙腈，45％的B相等度洗脱；流速为2.5mL·min^-1；检测波长为360nm)纯化得到化合物efrotomycin A3(3)(Rt＝18.0min)和efrotomycin A4(4)(Rt＝19.5min)。

4.化合物的结构鉴定

化合物1-4的结构根据HR-ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR、DEPT135、HSQC、COSY、HMBC、ROESY和J-HMBC谱图进行鉴定，其核磁数据归属见表1和表2。化合物efrotomycin A1(1)的谱图见图6-14，efrotomycin A2(2)的谱图见图15-23，efrotomycin A3(3)的谱图见图24-32，efrotomycin A4(4)的谱图见图33-41。

由此确定化合物1-4的结构式如下所示：

表1.化合物1和2的¹H(700MHz)和¹³C(175MHz)核磁数据(CD₃OD)

续表

表2.化合物3和4的¹H(700MHz)和¹³C(175MHz)核磁数据(CD₃OD)

续表

实施例2：聚酮类化合物efrotomycins A1-A4生物合成基因簇的定位

聚酮类化合物efrotomycins A1-A4属于elfamycin家族抗生素。在elfamycin家族抗生素中，kirromycin、factumycin和aurodox的生物合成基因簇已经被报道。以kirromycin的生物合成基因簇为导向，通过比较基因组学在放线菌A.cihanbeyliensisDSM 45679的基因组(GenBank accession no.VFML01000000)中定位了efrotomycin的生物合成基因簇efr(GenBank accession no.OP381654，图2)。efrotomycin基因簇efr与kirromycin基因簇kir的相似度较高，含有20个开放阅读框(表3)，其中5个trans-AT PKS基因(efrAI、efrAII和efrAIV-efrAVI)、2个trans-AT基因(efrCI和efrCII)、1个PKS/NRPS基因(efrAIII)、1个NRPS基因(efrB)和1个环化酶基因(efrH)负责聚酮骨架的合成。另外5个基因，包括2个糖基转移酶基因(efrGI和efrGII)、2个甲基转移酶基因(efrMIII和efrMIV)和1个还原酶基因(efrOIV)负责二糖单元的合成与组装。剩余的2个P450酶基因(efrOI和efrOII)、2个甲基转移酶基因(efrMI和efrMII)和1个双加氧酶基因(efrOIII)可能编码后修饰酶。然而，kir基因簇中编码前体供应蛋白、转运蛋白、调控蛋白和一些未知功能蛋白的基因在efr基因簇中不存在(表3)。

表3.Efrotomycin生物合成基因簇的基因功能注释

续表

实施例3：包含efrotomycin生物合成基因簇BAC质粒的筛选

根据efrotomycin生物合成基因簇的上下游边界基因设计检测引物Efr-testF1/R1和Efr-testF2/R2(表4)对放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的BAC文库进行筛选，获得阳性BAC质粒pCSG8112，经末端测序确认pCSG8112包含efrotomycin生物合成基因簇的所有基因(图3)。

表4.本发明中使用的引物

实施例4：重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的构建

通过三亲本接合转移的方法将BAC质粒pCSG8112导入异源宿主S.lividans SBT18中，接合转移过程具体说明如下：链霉菌S.lividans SBT18在MS固体培养基平板上培养5-7d后，用已灭菌竹签刮取适量的孢子收集于500μL TSB培养基中，振荡混匀，50℃热激10min，28℃摇床200rpm复苏2h，作为接合转移的受体菌。将供体菌EscherichiacoliDH10B/pCSG8112接种于5mL LB液体培养基中(含50μg·mL^-1阿泊拉霉素)，同时将助体菌E.coli ET12567/pUB307接种于5mL LB液体培养基中(含50μg·mL^-1卡那霉素和50μg·mL^-1氯霉素)，37℃摇床200rpm过夜培养。然后取100μL过夜培养的E.coliDH10B/pCSG8112和E.coli ET12567/pUB307分别转接到10mL LB液体培养基中(含50μg·mL^-1阿泊拉霉素-针对供体菌的LB液体培养基，或含50μg·mL^-1卡那霉素和50μg·mL^-1氯霉素-针对助体菌的LB培养基)，37℃摇床200rpm培养3-4h至OD₆₀₀值约为0.6，3900rpm离心10min收集2种菌体，用10mL无抗的LB液体培养基清洗2次，分别悬浮于250μLLB液体培养基中。最后将250μL供体菌、250μL助体菌和500μL受体菌混匀，涂布于Mg²⁺终浓度为20mM的ISP4培养基无抗固体平板上，吹干，28℃培养箱倒置培养18-20h。将平板取出，用含抗生素的水(含50μg·mL^-1阿泊拉霉素和100μg·mL^-1甲氧苄啶)覆盖平板，吹干后置于28℃培养箱倒置培养5-7d。待接合子长出后，划线到MS培养基固体平板上(含50μg·mL^-1阿泊拉霉素和100μg·mL^-1甲氧苄啶)。28℃培养箱倒置培养2d后，提取接合子的基因组DNA用检测引物Efr-testF1/R1和Efr-testF2/R2(表4)进行验证，阳性克隆即为重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112。

实施例5：重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的发酵检测

将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112在MS培养基固体平板上(含50μg·mL^-1阿泊拉霉素和100μg·mL^-1甲氧苄啶)培养5d后，用已灭菌竹签刮取少量菌体接种于50mL AM3培养基中，28℃摇床200rpm培养5d后取样5mL菌体，加入5mL丁酮萃取，超声破碎30min后3900rpm离心10min，取上清于2mL离心管中，旋转蒸干有机溶剂，剩余粗提物加入50μL DMSO溶解并进样HPLC检测。

HPLC条件：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18,150mm×4.6mm,5μm；流动相A相：10％乙腈/水(v/v)+0.1％的甲酸(v/v)，B相：90％的乙腈/水(v/v)；进样程序：5％B-80％B(0-20min)，80％B-100％B(20-21min)，100％B(21-25min)，100％B-5％B(25-26min)，5％B(26-30min)，检测波长360nm，流速1mL·min^-1。

结果发现重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112能够产生与efrotomycins A1-A4(1-4)保留时间不同的efrotomycin同系物，而对照菌株S.lividans SBT18/pSET152中并无efrotomycin同系物产生(图4)。

实施例6：聚酮类化合物efrotomycin B的分离和制备

1.放大发酵培养

将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112在MS培养基固体平板上(含50μg·mL^-1阿泊拉霉素和100μg·mL^-1甲氧苄啶)活化后，刮取适量菌丝体接种到含50mL AM3培养基(共20L)的三角瓶中，28℃摇床200rpm培养5-7d后得到发酵培养物。

2.发酵液的萃取

发酵培养物3900rpm离心20min后分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用1L大孔树脂XAD-16吸附，然后用10L丙酮洗脱；菌丝体用1L甲醇浸提4次，每次超声破碎细胞1h。然后用旋转蒸发仪回收两部分中的有机溶剂，剩余的水相合并后用1L乙酸乙酯萃取10次，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯后得到重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的AM3培养基粗提物。

3.化合物的分离

将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的AM3培养基粗提物(13.2g)用氯仿甲醇(体积比1:1)溶解，加入50mL 100-200目硅胶旋蒸拌样，以拌样硅胶(50mL)/分离硅胶(150mL)1:3干法装柱，用氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱(氯仿、氯仿/甲醇4:1、氯仿/甲醇2:1、甲醇，v/v)，依次得到流份Fr1到Fr4。将流份Fr2(氯仿/甲醇4:1洗脱流份)用Sephadex LH-20凝胶柱层析(120cm×3cm，氯仿/甲醇1:1，v/v)进行分离，每10mL接收一瓶，根据TLC检测结果合并得到流份Fr2-1到Fr2-4。将流份Fr2-2(第14-25瓶)采用半制备高效液相色谱(Phenomenex Kinetex C18，250mm×10.0mm，5μm；A相为水，B相为乙腈，50％的B相等度洗脱；流速为2.5mL·min^-1；检测波长为360nm)纯化得到化合物efrotomycin B1(5)(Rt＝17.0min)。

4.化合物的结构鉴定

化合物5的结构根据HR-ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR、DEPT135、HSQC、COSY、HMBC、ROESY和J-HMBC谱图进行鉴定，其核磁数据归属见表5。化合物efrotomycin B1(5)的谱图见图42-50。

由此确定化合物5的结构式如下所示：

表5.化合物5的¹H(700MHz)和¹³C(175MHz)核磁数据(CD₃OD)

实施例7：化合物1-5的抗菌活性测定

采用Mueller-Hinton肉汤微量稀释法测定了聚酮类化合物efrotomycins A1-A4(1-4)和efrotomycin B1(5)对5种革兰氏阳性菌Enterococcus faecalis ATCC 29212、Staphylococcus aureus ATCC 29213、methicillin-resistant Staphylococcus aureusshhs-A1(clinical sample)、Micrococcus luteus SCSIO ML01、Bacillus subtilis 1064和3种革兰氏阴性菌Acinetobacter baumannii 19606、E.coli ATCC 25922、Klebsiellapneumoniae ATCC 13883的抑制活性。8种指示菌用MH培养基37℃摇床200rpm培养16h后，用无菌MH培养基稀释到OD₆₀₀值约为0.04-0.06，再稀释10倍加入到96孔板中；加入样品后，等倍稀释到样品终浓度为64-0.125μg·mL^-1，每个浓度3个平行；37℃静置培养18h，用酶标仪测定各孔在波长600nm处的吸光值，并计算各个化合物的最小抑菌浓度(MIC)，抑制率(％)＝[1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照)]×100％，抑制率>80％时的样品浓度即为MIC值。结果发现聚酮类化合物efrotomycins A1-A4(1-4)和efrotomycin B1(5)对藤黄微球菌Micrococcus luteus SCSIO ML01均具有中等程度的抑制作用(表6)。

表6.化合物1-5的抗菌活性

a.Van：Vancomycin，革兰氏阳性菌的阳性对照；b.Cip：Ciprofloxacin，革兰氏阴性菌的阳性对照。

实施例8：化合物1-5的链霉菌毒性测定

采用平板纸片扩散法测试了聚酮类化合物efrotomycins A1-A4(1-4)和efrotomycin B1(5)对3种链霉菌S.lividans SBT18、S.albus Del14和S.coelicolor YF11的毒性。将链霉菌S.lividans SBT18、S.albus Del14和S.coelicolor YF11在MS固体平板上培养5-7d后，用已灭菌竹签刮取适量的孢子收集于500μL TSB培养基中，混匀后涂布于MS固体平板上，吹干后将直径6mm已灭菌滤纸片贴于平板表面，加入5μL样品(浓度为2mg·mL^-1)于滤纸片上，28℃倒置培养24h，DMSO和apramycin分别为阴性和阳性对照。结果发现化合物1-5对链霉菌S.albus Del14均具有明显毒性，化合物efrotomycins A1(1)和efrotomycin B1(5)对链霉菌S.lividans SBT18和S.coelicolor YF11也具有毒性(图5)。

Claims (10)

1.聚酮类化合物efrotomycins A1-A4、efrotomycin B1，其结构如式(I)所示：

2.一种重组菌株Streptomyces lividans SBT18/pCSG8112，其特征在于，是将权利要求1所述的聚酮类化合物efrotomycin的生物合成基因簇转化到Streptomyces lividansSBT18中而获得。

3.放线菌Amycolatopsis cihanbeyliensis DSM 45679在制备权利要求1中所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4中的应用。

4.权利要求2所述的重组菌株Streptomyces lividans SBT18/pCSG8112在制备权利要求1中所述的聚酮类化合物efrotomycin B1中的应用。

5.一种权利要求1所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4的制备方法，其特征在于，所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4是从放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679的发酵培养物中制备得到的。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

a、放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679发酵培养，获得发酵培养物，离心分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用大孔树脂吸附后用丙酮洗脱，菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞，两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，得到粗提物；

b、将粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，依次从体积比100:0，10:1，4:1，2:1，0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比10:1洗脱下来的流分Fr.2；流份Fr2经正相硅胶柱层析分离，从环己烷/乙酸乙酯2:1、环己烷/乙酸乙酯1:1、环己烷/乙酸乙酯1:2、乙酸乙酯、丙酮，v/v为洗脱剂进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯洗脱的流份Fr2-4；流份Fr2-4用凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1:1，v/v为洗脱剂进行分离，得到流份Fr2-4-1-Fr2-4-4；流份Fr2-4-2经中压反相色谱，以水和乙腈为洗脱剂进行梯度洗脱，得到流份Fr2-4-2-1-Fr2-4-2-13；流份Fr2-4-2-8经半制备HPLC纯化得到化合物efrotomycin A1和efrotomycinA2；流份Fr2-4-2-7经半制备HPLC纯化得到化合物efrotomycin A3和efrotomycin A4；

所述的放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679发酵培养的方法为：将活化的放线菌A.cihanbeyliensis DSM 45679接入AM3培养基中，28℃，200rpm培养3d得到种子液；将种子液以10％，v/v的接种量接入AM3培养基中，28℃，200rpm培养5-7d后得到发酵培养物；每升AM3培养基：黄豆粉5g，细菌学蛋白胨15g，可溶性淀粉15g，甘油15g，CaCO₃2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH 7.2-7.4。

7.一种权利要求1所述的聚酮类化合物efrotomycin B1的制备方法，其特征在于，所述的聚酮类化合物efrotomycin B1是从权利要求2所述的重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112的发酵培养物中制备得到的。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

a、将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112发酵培养，获得发酵培养物，离心分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用大孔树脂吸附后用丙酮洗脱，菌丝体用甲醇浸提并超声破碎细胞，两者回收有机溶剂后剩余的水相用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，得到粗提物；

b、将粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，依次从体积比100:0，4:1，2:1，0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比4:1洗脱下来的流分Fr.2；流份Fr2用凝胶柱层析，以氯仿/甲醇1:1，v/v为洗脱剂进行分离，得到流份Fr2-1-Fr2-4；流份Fr2-2经半制备HPLC纯化得到化合物efrotomycin B1；

所述的重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112发酵培养的方法为：将重组菌株S.lividans SBT18/pCSG8112接入AM3培养基中，28℃，200rpm培养5-7d后得到发酵培养物。每升AM3培养基：黄豆粉5g，细菌学蛋白胨15g，可溶性淀粉15g，甘油15g，CaCO₃ 2g，海盐30g，加纯净水至1L，pH 7.2-7.4。

9.权利要求1中所述的聚酮类化合物efrotomycins A1-A4、efrotomycin B1或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物是抗藤黄微球菌或链霉菌的药物。

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