NO164038B

NO164038B - Mikrobiologisk frete for fremstilling av antracykl inderivater ved fermentering av streptomyces purpurascenshpl y-11472, dsm 2658.

Info

Publication number: NO164038B
Application number: NO854909A
Authority: NO
Inventors: Christopher Milton Math Franco; Tripikumar Mukhopadhyay; Kalyanapuram Rajagopal Desikan; Bimal Naresh Ganguli; Hans-Wolfram Fehlhaber; Hans Petter Kraemer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-12-18
Filing date: 1985-12-05
Publication date: 1990-05-14
Also published as: DE3446052A1; MX7626E; ES549951A0; AU5136285A; NO854909L; FI80723C; EP0186807A3; NZ214561A; ES8704506A1; FI854978A0; PH24107A; EP0186807B1; FI80723B; DK587185A; PT81692B; HUT43641A; FI854978A; HU197596B; JPS61145145A; GR853020B

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av nye kesarirodiner eller syreaddisjonssalter av kesarirodin betegnende antracyklinforbindelser, karakterisert ved at mikroorganismen HPL Y-11472 - DSM 2658 fermenteres i nærvær av kjemiske inhibitorer.

De nye forbindelser har en antibakteriell virkning mot gram-positive bakterier, og har dessuten en virkning mot en rekke av tumortyper. De nye forbindelser har den ifølge formel I viste generelle struktur:

hvori betyr H eller 0R2 og R2 betyr H, eller en sukker-kombinas jon av følgende type: (A) Roa-dF-Rod (B) Roa-Rod-Rod,

idet Roa betyr rodosamin, dF betyr deoksyfucose og Rod

betyr rodinose.

Strukturen av disse sukkere er vist i følgende formelbilder.

Rodosamin (Roa) Deoksyfucose (dF) Rodinose (Rod)

De to typer av kesarirodiner tilsvarende sukkerkombinasjonen (A) og (B) betegnes som kesarirodin A resp. kesarirodin B. Følgelig betyr "kesasirodin" i foreliggende oppfinnelse enten kesarirodin A eller B, eller en blanding av begge kesarirodin. Kesarirodin har i sin sakkariddel en dimetylaminogruppe og kan dermed danne syreaddisjonssalter. Til de syrer som ved tilleggsreaksjon med kesari-

rodin danner salter, hører f. eks. saltsyre, svovelsyre og vinsyre.

Mikroorganismer til fremstilling av kesarirodiner Streptomyces purpurascens (HPL Y-11472) - DSM 2658 hører til klassen Actinomycelater, Familie Streptomycetaceae og slekten Streptomyces. Mikroorganismen betegnes nedenfor som "S. purpurascens" - DSM 2658.

Antracyklin-antibiotika produseres påvisningsvis av forskjellige Streptomyces-arter og er omtalt i litteraturen. Disse antibiotika spiller en viktig rolle i medisinen for beherskning av tumorer i kreftterapien og som antibakterielle medikamenter. Tidligere er det fremstilt forskjellige antracyklinforbindelser. Av disse er det tidligere i klinikk-en ved karcinoma anvendt danomycin og adriamycin.

Rodomyciner, iso-rodomyciner og fra rodomycin avledede antracyklin-antibiotika er f. eks. omtalt i J. Med. Chemie 20,

957 - 960 (1977). Aklacinomycin er utførlig beskrevet i US-patent nr. 3 988 315 og av Oki et al. i J. Antibiotics

28, 830 (1975) og 32, 791-812 (1979).

Cinerubinene A og B beskrives i U.K patent nr. 846 130, US-patent nr. 3 864 489 og av Keller-Schlierlein et al i "Anti-microbial Agents and Chemotherapy", side 68 (1970), Chemical Abstracts 54, 14661 (1960) og J. Antibiotics 28, 830 (1975).

Ytterligere sammenfattende beskrivelse av antracyklinanti-biotika kan sees i "Index of Antibiotics from Antinomycetes",

Hamao Umezawa, Editor-in Chief, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1976) som følger:

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling

av forbindelser som nedenfor betegnes som kesarirodiner,

hører til klasse av antracykliner og har den generelle formel I, ved fermentering av S-purpurascens HPL Y-11472-DSM 2658 ved en pH-verdi mellom 6,5 og 8,5, og en tem-

peratur mellom 24°C og 40°C under aerobe betingelser i et næringsmedium som gir karbon og nitrogen som næringsstof-

fer inneholdende uorganiske salter og sporelementer i fravær eller nærvær av antiskummidler som silikonolje eller desmorfen, og hvor det etter 20-36 t. fermentering tilsettes en kjemisk inhibitor 10-80 mg/l, og isolering av forbind-

elsene fra kulturvæske og mycelium etter 48-56 t. på den nedenfor omtalte måte.

Karbonkilder kan være glukose, sakkarose, stivelse, gly-

cerol, dekstrin, fruktose, melasse, havremel, maltose, lak-

tose og galaktose. Foretrukkede karbonkilder er glukose,

stivelse og sakkarose. Nitrogenkilder kan være sojabønne-

mel, gjærmel, gjærekstrakt, storfeekstrakt, maltekstrakt,

agar, pepton, kasein, bomullsfrøolje, kirsebærstenpulver og uorganiske forbindelser som ammoniumsalter eller nitrater (f. eks. ammoniumsulfat, natriumnitrat, ammoniumklorid og kaliumnitrat). Foretrukkede nitrogenkilder er maltekstrakt, gjærekstrakt, sojabønnemel og kaliumnitrat. Hvis ønsket kan næringsstoffet tilsettes i form av uorganiske salter som

natriumklorid, magnesiumsulfat, kaliumklorid, kaliumhydro-gen- og -dihydrogenfosfat, kalsiumklorid, kalsiumkarbonat, ammoniumhydrogenfosfat, natriumhydrogen- og -dihydrogenfosfat, magnesiumfosfat, og kalsiumfosfat. Som sporelementer kan anvendes jern-, mangan, kobber-, sink- og andre tungmetallsalter. Som kjemiske inhibitorer kan det tjene kaliumcyanid, kaliumheksacyanoferrat (III), metylenblå, tri-fenyltetrazoliumklorid, sulfanilsyre, sulfanilamid, askorbinsyre og dens salter, natriumazid, jern(III)klorid, etylen-diaminotetraeddiksyre,nitrofurazin, salinomycin, ditionit, rotenon, 2,4-dinitrofenol, erytromycin og dimetylsulfoksyd. Foretrukkede inhibitorer er askorbinsyre og dens salter, natriumazid og jern(III)klorid.

Kultiveringen av S. purpurascens - DSM 26 58 kan foregå ved temperaturer mellom 24°C og 40°C og en pH-verdi mellom 6,5

og 8,5. S. purpurascens DSM-2653 kultiveres : fortrinnsvis under aerobe betingelser ved 27°C og pH-verdi 7,0. Den kjemiske inhibitor som jern(III)klorid, natriumazid eller askorbinsyre kan tilsettes etter 20 - 36 timers fermentering for å oppnå en sluttkonsentrasjon mellom 10 og 80 mg/liter av fermenteringsvæsken. Fortrinnsvis tilsettes etter 27 timers fermentering natriumazid for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20 mg/liter. Fermenteringen avbrytes etter 48 til 56 timer når det er blitt dannet optimale mengder av de ønske-de forbindelser. Som fermentering foretrekkes submersfermen-tering. Ved begynnelsen av fermenteringen kan det til fermentereren inntil sluttkonsentrasjon på 0,025 % settes antiskummidler.

I den således dannede kulturvæske er det samlede kesarirodin inneholdt såvel i mycelium som i kulturfiltrat.

Forløpet av fermenteringen og dannelse av antracyklin-forbindelsene lar seg påvise ved ekstrahering av den samlede væske (Mycelium og kulturfiltrat) med et organisk oppløsnings-

middel og måling av abeorbsjonsintensiteten ved 492 nm,

og ved kromatografi av ekstraktet på kiselsyreplater, samt ved den antibakterielle virkning overfor Staphylococcus aureus 209 P. Som organisk oppløsningsmiddel kan det anvendes kloroform, etylacetat, butylacetat, butanol, toluen og benzen. Etylacetat foretrekkes.

Kesarirodiner kan fremstilles ved utvinning fra disse kulturvssker med egnede metoder. En av disse metoder som er vist ved det vedlagte skjema I baseres på ekstrahering. Således kan kesarirodin i kulturfiltratet eksempel-vis utvinnes ved ekstrahering med et med vann ikke blandbart oppløsningsmiddel som etylacetat, etter at pH-verdien av filtratet er blitt innstillet på 7,5 - 8,0.

Kesarirodin i mycelium kan isoleres ved behandling av mycelium, som er utvunnet ved filtrering eller sentrifuger-ing med etylacetat, kloroform, metanol, etanol, aceton, butanol, metyletylketon, en saltsyreoppløsning eller en eddik-syreoppløsning. Som oppløsningsmiddel foretrekkes aceton. Etter ekstraheringen fjernes acetonet og det vandige sjikt innstilles på en pH-verdi på 7,5 - 8,0, og ekstraheres med etylacetat. Man kan underkaste kulturvæsken også i overnevnte ekstraheringstrinn uten å avdele mycelet.

Etylacetat-ekstraktet av kulturfiltratet og mycelium kombi-neres eller opparbeides adskilt, konsentreres og deretter renses ifølge skjema II.

Skjema I

Isolering av det antibiotiske kompleks av S. purpurascens DSM 2658

Skjema II

Isolering og rensning av kesarirodin A og B

Oppløsningsmiddel A = kloroform : metanol : eddiksyre :

Aqua dest. : trietanolamin

(80 : 10 : 10 : 2 : 0,1).

En annen metode til fremstilling av kesarirodin fra kulturvæsken baseres pa adsorpsjon. Det kesarirodin holdige flytende materiale som f. eks. kulturfiltratet eller det ved overnevnte ekstraheringsfremgangsmåte fremstilte ekstrakt underkastes søylekromatografi, væskekromatografi eller en annen metode, hvor det anvendes et egnet adsorbens som aktiv-kull "diaion HP-20", "XAD", aluminiumoksyd, kiselgel eller "Sephadex" eller "Sephadex LH-20". Kesarirodinene kan elueres med metanol eller aceton, fra adsorbentene. De fremstilte eluater konsentreres til tørrhet idet det fremkommer rått kesarirodin som orangerødt pulver. De rå kesarirodinene kan renses idet man ønskelig ofte gjentar overnevnte ekstrahering- og adsorpsjonsteknikk. Anvendes kan alt etter ønske søylekromatografi med de allerede nevnte forskjellige absorbenter, motstrømsfordeling eller preparativt tynnsjiktkromatografi og krystallisering. Den videre rensning lar seg oppnå ved hjelp av høy-ydelses væskekromatografi.(HPLC)..

Som det er vist i skjema II gir fraksjon K tre komponenter hvorav den halvrene fraksjon A vidererenses for å gi en ren forbindelse, som nedenfor betegnes som kesarirodin A. Fraksjon B vidererenses for å gi en ren forbindelse som nedenfor betegnes som kesarirodin B. Fraksjonen 'X' er en blanding av ekstra antracyklin-forbindelser som dessuten videreunder-søkes. Den generelle struktur av kesarirodinene er iden-tisk med den med formel I.

De fra fermenteringsvæskene fra S. purpurascens DSM 2658 isolerte som i skjema I og II rensede kesarirodin A og B har de nedenfor viste strukturformleas Ia og Ib: Kesarirodin-antibiotika har antibakteriell virkning mot gram-positive bakterier, fungisid virkning og antitumor-virkning,

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksem-pler .

Eksempel 1

Kultivering av S. purpurascens - DSM 26 58 for den fermentative produksjon av det antibiotiske virksomme kompleks

Streptomyces purpurascens - DSM 26 58 holdes på gjær-malte-agar med følgende sammensetning:

Mediet fordeles i reagensglass og steriliseres i 20 minutter ved 121°C. Reagensglassene avkjøles i skråstilling til fremstilling av skrå agar-rør. Skrå agar-rørene podes med kulturen og innkuberes 10 - 15 dager ved 28°C til det er å iaktta god vekst og sporedannelse. En sporesuspensjon i Aqua dest. av et skrå-agar-rør anvendes til å inokulere 5 erlenmeyerkolber til 500 ml som hver inneholder 100 ml av podningskulturene i mediet, eller en aspiratorflaske til 5 liter som inneholder 1 liter av det samme podningskultur-medium.

Podningskulturmediets sammensetning

Overnevnte medium fordeles i mengder på 100 ml på erlenmeyerkolber til 500 ml, eller i mengder på 1 liter på sugeflasker til 5 liter og steriliseres 5 minutter ved 125°C. Kolbene/flaskene avkjøles, podes med sporesuspen-sjoner og rystes 72 timer ved 28°C ved 240 omdreininger på en dreieryster med en amplitude på 3,75 cm. Med den godt oppvoksede podningskultur podes en 15 liters glass-fermenterer som inneholder 10 liter av produksjonsmediet i konsentrasjon på 5 volum-%. Produksjonsmediets sammensetning

0,025 % "Desmorfen" tilsettes som antiskummiddel til innhold av fermentereren.

Av det overenvnte medium haes 10 liter i en 15 liter fermen-terer. Mediet steriliseres ved hjelp av indirekte og direkte damp 28 minutter ved 121°C. Fermentereren avkjøles og inoku-leres med annet trinns podningskultur ( 5 volum-%). Fermenteringen foregår ved 27°C 0,51°C) under omrøring ved 170-180 omdreininger i 48 - 56 timer. Lufting foregår med en grad på 0,6 - 0,8 wm. I løpet av fermenteringen tilsettes etter ca. 24 - 32 timer som angitt nedenfor inhibitor-stoffet. (eksempel 6 - 9).

Fermentereren høstes etter forløp av 48 - 56 timer, når konsentrasjonen av det antibiotisk virksomme kompleks ut-gjør 30 - 50 mikrogram pr. ml og kulturvæskens pH-verdi ligger mellom 5,5 og 6,0. Svinge-cellevolumet utgjør på dette tidspunkt 11 - 13 ml pr 100 ml.

Eksempel 2

Kultivering av S. purpurascens - DSM 2658 for den fermentative produksjon av det antibiotisk virksomme kompleks

Kulturen dyrkes under samme betingelser som i eksempel 1 med følgende medier:

(1) Podningskulturmediets sammensetning: 7 2 timer ved 28oc. Produksjonsmediets sammensetning

I løpet av fermenteringen tilsettes som omtalt nedenfor etter ca. 24-32 timer den kjemiske inhibitor (eksempel 6-9). Fermentereren høstes etter forløp av 48-56 timer når konsentrasjonen av antibiotisk virksomt stoff utgjør 20-40 mikrogram pr. ml, og kulturvæskens pH-verdi ligger mellom 5,8 og 6,2. Ved innhøstningstidspunktet ligger det avsatte cellevolum ved 11-13 ml pr. 100 ml.

Eksempel 3

Kultivering av S. purpurascens - DSM 2658 for den fermentative produksjon av antibiotikakompleks

Kulturen dyrkes under de samme betingelser som i eksempel

1 med følgende medier:

Podningskulturmediets sammensetning

72 timer ved 28°C. Produksjonsmediets sammensetning

I løpet av fermenteringen tilsettes etter ca. 24-32 timer som omtalt nedenfor den kjemiske inhibitor (eksempel 6-9). Fermenteringen avbrytes etter 48 - 52 timer.

Eksempel 4

Kultivering av S. purpurascens - DSM 2658 for den fermentative produksjon av det antibiotiske virksomme kompleks

Kulturen dyrkes under de samme betingelser som i eksempel 1 med følgende medium:

Stammeholde- agars- sammensetning:

Podhingskulturmediets sammensetning: 72 timer ved 28°C.

Produksjonsmediets sammensetning:

I løpet av fermenteringen tilsettes i løpet av 24-32 timer en kjemisk inhibitor som omtalt nedenfor (eksempel 6-9). Fermentereren høstes etter 48-52 timer, når konsentrasjonen av det antibiotiske virksomme kompleks utgjør 25-40 mikrogram pr. ml, og kulturvæskens pH-verdi svinger mellom 6,3 og 6,4. Ved høstningstidspunktet utgjør det avsatte cellevolum 5,0-6,0 ml pr. 100 ml.

Eksempel 5

Kultivering av S. purpurascens - DSM 2658, den fermentative produksjon av det antibiotiske virksomme kompleks.

Kulturen virker på samme måte som i eksempel 1 med følgende medium:

Podningskultur- mediesammensetning:

72 timer ved 28°C.

Eksempel 6

' Tilsetning av kjemisk inhibitor:

Det fremstilles en konsentrert oppløsning av ascorbinsyre eller dens salter (20 mg/ml) i aqua dest. og steriliseres ved en sterilfiltrering. Den gir som omtalt i eksempel 1-5 satt til fermenteringsmediet fra 24-32 timer etter begynt fermentering, idet en sluttkonsentrasjon på 20-100 mg stoff pr. liter oppnås.

Eksempel 7

Tilsetning av en kjemisk inhibitor:

Natriumazid blir i konsentrert (20 mg/ml) steril vandig oppløsning satt til fermenteringsmediet som omtalt i eksemplene 1-5, ca. 24-32 timer etter begynt fermentering til det oppnås en sluttkonsentrasjon på 10-80 mg stoff pr. liter.

Eksempel 8

Tilsetning av en kjemisk inhibitor:

Jern(III)klorid oppløses til en konsentrasjon på 20 mg/ml

i vann, oppløsningen steriliseres ved filtrering og settes til det i eksemplene 1-6 omtalte fermenteringsmedium ca. 24-32 timer etter begynt fermentering for å gi en slutt-konsentras jon på 10-100 mg stoff/liter.

Eksempel 9

Tilsetning av en kjemisk inhibitor:

Tilsetning av et sulfonamid som sulfanilamid, sulfacetamid eller sulfonamid foregikk ved tilsetning av en steril konsentrert (20 mg/ml) vandig oppløsning til det i eksemplene 1-5 omtalte fermenteringsmedium, ca. 24-32 timer etter begynnende fermentering idet det oppnås en sluttkonsentrasjon på 40-200 mg stoff pr. liter.

Eksempel 10

Isolering av kesarirodin:

Det sentrifugeres ca. 4 0 liter av fermenteringsvæsken for

å adskille mycelet og kulturfiltrat fra hverandre. Isoleringsprosessen av kesarirodin fra mycelium og kulturfiltrat er utførlig vist på skjema I. (a) Kulturfiltratet innstilles med NaHC03 på en pH-verdi på 7,5, og ekstraheres 2 ganger med 20 ml etylacetat, de kombinerte til acetatekstrakter konsentreres deretter i vakuum til tørrhet. Man får ca. 1,5 g ekstrakt som betegnes som fraksjon K. (b) Det adskilte mycelium ekstraheres tre ganger med 20 ml aceton:acetat-puffer (9:1) ved pH 3,5, kombinerte ekstrakter konsentreres under vakuum for å fjerne aceton. Det gjen-blivende vandige sjikt innstilles med NaHCO^ til en pH-

verdi på 7,5 og ekstraheres tre ganger med 30 liter etylacetat. De kombinerte ekstrakter konsentreres under vakuum til tørrhet. Man får ca. 6,0 g ekstrakt som betegnes som fraksjon K.

Kesarirodininneholdende ekstrakt, dvs. fraksjon K fra mycelium og kulturfiltrat, kan oppberedes sammen eller adskilt. Isoleringsprosessen av kesarirodin A og B er vist på skjema

II.

(c) 7,5 g ekstrakt (fraksjon K) haes på en 4,5 x 40 cm tynnsjiktkromatografi-kiselgel-H-(BDH)-søyle og elueres med følgende oppløsningsmiddelblanding: Kloroform : metanol : eddiksyre : aqua dest. : trietanolamin i forhold 80 : 10 : 2 : 0,1. Ved denne fremgangsmåte får man ca. 50 mg av den halvrene fraksjon A som inneholder kesarirodin A og ca. 60 mg av den halvrene fraksjon B som inneholder kesarirodin B.

De halvrene fraksjoner vaskes første med petroleter og deretter adskilt renses med preparativ tynnsjiktkromatografi på kiselgel ved hjelp av oppløsningsmiddelsystem som består av kloroform : metanol : eddiksyre : aqua dest. : trietanolamin i forhold 80 : 10 : 2,0 : 0,1. Man får 27 mg av stoffet kesarirodin A og 32 mg av stoffet kesarirodin B.

Karakterisering av kesarirodin A og B:

De rene stoffer kesarirodin A og B analyseres resp. ved hjelp av kjemisk analyse og spektroskopiske metoder.

For UV-absorbsjonsmaksima anvendes stoffet i en konsentrasjon på 10 - 30 mg/liter. Absorbsjonsspektrum ble opp-tegnet på områder fra 200 til 800 nm.

Protonresonansspektret (<1>H-NMR-spektret) ble opptatt på

et HX-270 Bruker Fourier-transform Magnetic Resonance Spectrpmeter ved 270 MHz. Prøvens konsentrasjon utgjorde 2,6-2,7 mg/0,5 ml 99,8 % CDC13, blandet med 0,1 ml 5 % Na2 C03 i 99,5 % D20.

Massespektrum ble bestemt i et MS-902S AEI, massespektrometer (FAB (Fast-Atom-Bombardment)-Positivionemetoden).

Fysikalsk- kjemiske egenskaper av kesarirodin A:

Utseende: Orange-rødt pulver.

Kjemisk formel: C4o<H>53°l4<N>

Molekylvekt: 77.

UV- spektrum:

X max i:

(a) metanol: 203, 234, 253, 292, 464, (sh), 478, (sh), 492, 512 (sh), 526, 575 nm. (b) 0,1 N-HCl-metanol: 203, 234, 253, 292, 464 (sh),

478 (sh), 492, 512 (sh).,

526 (sh), 558 (sh) nm.

(c) 0,1 N-NaOH-metanol:20 3, 239, 298, 554, 586 nm.

<1>H-nMR-spektrum (CDC13 + 0,1 ml 5 % Na2C03 i D2<D) :

7,88 (d, J=7 Hz, 1H), 7,69 (t, J=( Hz, 1H), 7,29 (d, J=

3 Hz, 1H), 5,49 (d, J = 3 Hz, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,03 (d, J= 3 Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,51 (q, J=6 Hz, 1H), 4,21 (q,

J=6 Hz, 1H), 4,0 - 4,1 (kompleks, 2H), 3,72 (s, 1H),

3,65 (s, 1H), 3,56 (s, 1H), 3,25 (d, J=20 Hzm 1H),

2,56 (d, J=20 Hz, 1H), 2,34 (bd, J=14 Hz, 1H), 2,15

(s, 6H), 2,0 - 2,2 (kompleks, 4H), 1,61 - 1,9 (kompleks 8H), 1,17 - 1,32 (overlappende dubletter, 6H), 1,14

(d, J=6 Hz, 3H), 1,07 (t, J=7,5 Hz, 3H).

Oppløselighet:

Kesarirodin A er oppløselig i metanol, aceton, etylacetat, kloroform og svake syrer, lite oppløselig i heksan og petroleter. Det danner i metanol en orangerød oppløsning/ antar imdidlertid i alkalisk miljø en purpurrød farve.

Tynnsj iktkromatografi:

Kesarirodin A har på kiselgel-plater med forskjellige oppløs-ningssytemer de i tabell I viste R^-verdier.

De overnevnte verdier viser at kesarirodin A har struktur-formel Ia.

Fyslkalsk- kjemiske egenskaper av kesarirodin B:

Uteseende: Orange-rødt pulver

Kjemisk formel: C.riHr-0,oN

J 40 53 13

Molekylvekt: 755.

UV- spektrum:

X max i:

(a) metanol: 203, 234, 253, 292, 464 (sh),

478 (sh), 492, 510 (sh), 526, 582 nm.

(b) 0,1 N-HCl-metanol: 203, 234, 253, 292, 464 (sh), 478

(sh), 492, 510 (sh), 526 (sh),

558 (sh) nm.

(c) 0,1 N-NaOH-metanol: 203, 239, 298, 552, 584 nm.

■"■H-NMR-spektrum (CDC13 + 0,1 ml 5 % Na2C<0>3 i D20) :

7,88 (d, J=7 Hz, 1H), 7,7 (t, J=( Hz, 1H), 7,31 (d, J=8

Hz, kH), 5,52 (d, J=3 Hz, 1H), 5,21 (s, 1H), 4,95 (s,

1H), 4,83 (d, J=3 Hz, 1H), 4,4 (q, J=6 Hz, 1H), 3,98 -

4,08 (kompleks, 2H), 3,78 (s, 1H), 3,56 (s, 1H), 3,46

(s, 1H), 3,26 (d, J=20 Hz, 1H), 2,58 (d, J=20 Jz, 1H),

2,25 - 2,38 (kompleks, 1H), 2,28 (s, 6H), 1,88 - 2,2 (kompleks, 4H), 1,5 - 1,85 (kompleks, 10H), 1,02 - 1,35 (overlappende multipletter, 12H).

Oppløselighet:

Kesarirodin B er oppløselig i metanol og aceton, etylacetat, kloroform og svake syrer, er lite oppløselig i n-heksan og petroleumseter. Det danner i metanol en orangerød oppløsning, antar i alkalisk miljø derimot en purpurrød farve.

Tynnsjiktkromatografi:

Kesarirodin B har på 'kiselgelplater ved anvendelse av forskjellige oppløsningssystemer de i tabell I angitte R^-verdier.

De overnevnte resultater viser at kesarirodin B har struk-turformel Ib.

Antibakteriell virkning av kesarirodin

Det ble bestemt en bakteriostatisk virkning av kesarirodin. Resultatene er angitt som diameter (i millimeter) av hemme-ringen frembragt ved stoffet i form av en 1 mg/ml-oppløsning i et hull av 6 mm diameter i agar som inneholder prøveorga-nismen, vises i følgende tabell, tabell II. Kesarirodiner er virksomme mot grampositive bakterier også, og kan derfor anvendes som antibiotika til behandling av sopp- og staphylo-kokk-infeksjoner, difteri, pneumoni, osv.

Antitumor- virkning av kesarirodin:

Fastleggelsen av den zytostatiske aktivitet av kesarirodin foregikk på nedenfor omtalte måte på muse-L 1210-leukemiceller.

(a) Proliferasjonsprøve:

Ved denne in vitro-metode er det etter inkubasjon av cellene med forkjellige konsentrasjoner og prøvestoffer mulig å bestemme den inngitte mengde av en radioaktiv markert DNS-forløper (f. eks. 14C-tiamidin) i en voksende celle. Som kontroll tjener en samme fremgangsmåte underkastede ubehandlede L 1210-celler. Metoden sammenfattes kort i det følgende.

L 1210-celler i eksponensiell vekstfase (5 x 10 3/ml i RPMI 1640) inkuberes i 72 timer (37°C, 5 % C02, 95 % relativ fuktighet) i en 96-hull-mikrotiterplate med forskjellige konsentrasjoner av prøvestoffet. Som kontroller anvendes celler som bare bringes i berøring med det friske medium.

Det anlegges fire hull for hver medikamentkonsentrasjon og kontroll. Etter 65 timer tilsettes 50 yl 14C tiamidin (1,5 yCi/ml) for å markere celle DNS. Etter 4 timers inkubasjon høstes cellene, DMS adskilles med 5 % trifluoreddik-syre, og vaskes med vann og metanol. Etter tørkning ved 50°C bestemmes szintillasjonstallet med 5 ml szintillasjons-væske.

Resultatene uttrykkes som kvotient av scintillasjonsindeks etter inkubasjon med prøvestoffet med denne for kontroll-stoffet. Med de fastslåtte verdier tegnes dosisvirknings-kurve, og det fastslås grafisk verdien ^C^g/ dvs. den konsentrasjon av prøvestoffet som hemmer innbygning av markert tymidin sammenlignet til kontrollene rundt 5 %. IC,.g-verdiene er overfor stilt de av adriamycin i følgende tabell III. (b) Stammecelleprøve ( kontinuerlig eksperiment i mykagar) : Denne metode tjener til påvisning av virkning av prøve-stoffene på vekst av leukemicellene over flere generasjoner, (da varigheten av en cellesyklus utgjør 10-12 timer, omfattes i løpet av undersøkelsestidsrommet på 7 dager rundt 14 på hverandre følgende generasjoner).

I denne prøve beror virkningen av zytotoksiske stoffer

på nedsettelse av antall iakttagbare kolonier sammenlignet til ubehandlede kontroller. Det anvendes følgende metoder:

Pr. plate anvendes 500 L 1210-leukemiceller. Eksperimentene gjennomføres ved kontinuerlig inkubasjon ved forskjellige konsentrasjoner av prøvestoffet, idet stoffet før påføring av cellene på platen tilblandes det øvre agar-sjikt. Platene lagres 7 dager i et rugeskap (37°C 5 % C02, 95 % relativ luftfuktighet). Deretter helles antallet av dannede kolonier med en diameter på mer enn 60 ym med et omvendt mikro-skop. Resultatene uttrykkes som % sats av de på de behandlede plater dannede kolonier sammenlignet til de dannede kolonier av ubehandlede kontroller. Med de fastslåtte verdier tegnes en dosisvirknings-kurve hvorav det grafisk fastslås IC,.q-verdier. IC^^-verdien av kesarirodin sammenlignes i tabell III med verdiene for adriamycin.

Som anført ovenfor har forbindelsen ifølge oppfinnelsen antibakterielle fungicid og zytostatisk virkning, dvs. terapeutisk virkning, spesielt overfor maligne tumorer hos dyr og mennesker.

Forbindelsene og syreaddisjonssaltene kan derfor anvendes som medikamenter til behandling av infeksjonssykdommer som sykdommer og tumorer. Forbindelsene kan administreres på forkjellig måte i avhengighet av doseringsformen. Normalt administreres forbindelsene blandet med farmasøytisk vanlige bærestoffer eller fortynningsmiddel. Således kan de f. eks. administreres enkeltvis eller i blanding sammen med bærestoffer som maltose eller laktose, eller som ikke-toksiske komplekser, f. eks. som desoksyribonukleinsyre-kompleks.

En typisk administreringsform er injeksjon av en oppløsning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen i destillert vann eller i fysiologisk kokesaltoppløsning. Oppløsningene kan injiseres intraperitonealt, intravenøst eller intraarteri-elt.

Dagsdose og enhetsdoser kan fastsettes fra dyreforsøk og også fra in vitro-prøver, således at den samlede dosis administreres kontinuerlig eller i avstander som ikke over-skrider et på forhånd fastlagt område. Således utgjør den samlede dose for en behandlingssyklus ved kreftsykdommer ca. 0,1 - 20 mg, fortrinnsvis 0,5 - 10 mg/kg legemsvekt. Denne dose kan administreres i tilsvarende brøkdeler over et tidsrom på 7 dager. For behandling av infeksjon- og soppsykdommer kommer det som dosisenhet i betraktning 0,1 - 10 mg, fortrinnsvis 0,5-5 mg/kg legemsvekt. Som dagsdose kan det administreres 1 til 3-ganger doseenheten.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av kesarirodin-forbindelser som kan anvendes til behandling av bakterielle infeksjonssykdommer, sopp- og kreftsykdommer med formel hvori Ri betyr resten OR2, idet R2 betyr sukkerkombinasjonen Roa-dF-Rod eller Roa-Rod-Rod, idet Roa betyr rodosamin, dF betyr desoksyfucose og Rod betyr rodinose, samt deres fysiologisk tålbare syreaddisjonssalter, karakterisert ved at mikroorganismen Streptomyces purpurascens HPL Y-11472, DSM 2658 fermenteres ved en temperatur på 24-40°C , pH 6,5-8,5 under aerobe betingelser i et næringsmedium og hvor det etter 20-36 timers fermentering tilsettes en kjemisk inhibitor 10-80 mg/l og de dannede forbindelser isoleres fra kulturvæsken og mycelet etter 48-56 timer ved ekstraksjon med organiske oppløsningsmidler, og etterfølgende kromatografi.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som kjemisk inhibitor anvendes jern(III)klo-rid, natriumazid eller askorbinsyre.