DK146342B - Fremgangsmaade til fremstilling af anthracyclinglycosidantibiotika betegnet ma 144-m1 og ma 144-m2 eller ikke toksiske syreadditionssalte eller komplekser deraf med desoxyribonucleinsyre - Google Patents

Description

i 146362

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte anthracyclinglycosid-antibiotika betegnet MA 144-M^ og MA 144-M2 med formlerne R O COOCH- /yWv^'

I ^OH

Wyx OH 0 OH H 0 R = H (MA 144-M^) eller R =0H (MA 144-M2)

OH __0 9 OH

5 eller ikke toksiske syreadditionssalte eller komplekser deraf med desoxyribonucleinsyre.

Det er kendt, at der ved dyrkning af visse Streptomyces-stammer i et substrat dannes anthracyclinglycosider. Blandt disse er daunomycin og adriamycin allerede blevet anvendt klinisk 10 mod cancer hos mennesket.

Daunomycin og beslægtede antibiotika er beskrevet i "Antibiotics", bind 1, side 190-210, Mechanisms of Action, David Gottlieb og Paul D.Shaw, Springer Verlag New York, Inc., N.Y., N.Y. (1967).

15 I Information Bulletin nr.10, International Center of Information of Antibiotics, i samarbejde med WHO, december 1972, 146342 2

Belgien, beskrives endvidere anthracydiner og deres derivater. Under omtalen af amicetin henvises til J.Am.Chem.

Soc. 86, 3592 , (1964).

Det har nu vist sig, at der ved dyrkning af en stamme af arten 5 Streptomyces galilaeus, fortrinsvis ATCC 31.133 (PERM P-2455), under submerse aerobe betingelser og oprensning af dyrkningsmediet kan isoleres anthracyclinglycosidantibiotika med de ovenfor anførte formler og med betegnelsen ΜΆ 144-M^ og MA 144 M2 eller syreadditionssalte eller DNA-komplekser deraf. Dis-10 se forbindelser udviser stærk antitumoraktivitet og lav toksicitet hos dyr.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man dyrker en stamme af arten Streptomyces galilaeus, fortrinsvis ATCC 31.133 (FERM P-2455), 25 under submerse aerobe betingelser i et næringsmedium indeholdende en carbonkilde, en nitrogenkilde og uorganiske salte og isolerer de dannede antibiotika fra dyrkningsmediet, om ønsket, i form af syreadditionssalte eller komplekser deraf med desoxyribonucleinsyre.

20 MA 144-M^ og MA I44-M2 kan isoleres og renses ved konventionelle til isolering og rensning af vanduopløselige antibiotika anvendte fremgangsmåder, som omfatter mindst én fremgangsmåde valgt blandt opløsningsmiddelekstraktion, opløsningsmiddelfældning, koncentration, gelfiltrering, modstrømsforde-25 ling, chelatisering med metalioner og adsorption efterfulgt af eluering fra en ionbytterharpiks, et adsorberende kisel-jordmateriale eller et syntetisk adsorbens.

Ved oparbejdningen af dyrkningsmediet kan opløsningen, der indeholder MA 144-M^ eller MA I44-M2 frysetørres efter tilsæt-30 ning af mindst ét stof udvalgt blandt serum, serumglobulin, gelatine, serumalbumin, desoxyribonucleinsyre, glycerol, sukkerstoffer, aminosyrer og uorganiske eller organiske syrer.

Anthracyclinglycosidantibiotikaerne MA 144-M^ og MA I44-M2 er 3 166342 antimikrobielt aktive overfor grampositive bakterier, er effektive inhibitorer af væksten af faste og ascitiske former for maligne tumorer i pattedyr og har en høj cytotoksicitet og inhiberer således væksten af dyrkede pattedyrtumor-5 celler.

Pig. 1 viser absorptionsspektrene for ultraviolet og synligt lys for MA 144-M^ i methanol.

Pig. 2 viser det infrarøde absorptionsspektrum for MA 144-M^ i kaliumbromid.

10 Fig. 3 viser NMR-spektret for MA 144-M^ i CDCl-j (100 MHz) .

Fig. 4 er absorptionsspektrene for ultraviolet og synligt lys for MA 144-M2 i methanol.

Fig. 5 er det infrarøde absorptionsspektrum for MA 144-M2 i kaliumbromid.

15 Fig. 6 viser NMR-spektret for MA 144-M2 i CDC13 (100 MHz).

Fig. 7 er det infrarøde absorptionsspektrum for det methy-lerede disaccharid.

Fig. 8 viser NMR-spektret for det methylerede disaccharid.

De omhandlede forbindelser er især aktive overfor gramposi-20 tive bakterier, de inhiberer væksten af forskellige pattedyrtumorer, såsom leukemi L1210 og P388 hos mus, og de har lav toksicitet. Som følge heraf er forbindelserne nyttige som antibakterielle midler og antitumormidler.

I den foreliggende beskrivelse refererer benævnelsen MA 144 25 til et antibiotikum, som omfatter mindst ét af antibioti-kaerne MA 144-M^ og MA 144-M2.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes en stamme af arten Streptomyces galilaeus, især Streptomyces galilaeus MA 144-M^ ATCC 31.133 (FERM P-2455), samt Streptomyces ga-30 lilaeus ATCC 14969.

Streptomyces galilaeus MA 144-M^ ATCC 31.133 (FERM P-2455) blev isoleret fra en jordprøve fra Osaki, Shinagawa-ku, To- 4 146342 kyo, Japan. En kultur af Streptomyces galilaeus MA 144-M^ blev deponeret i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og i Fermentation Research Institute, Japan, og blev optaget i de permanente samlinger af mikroorga-5 nismer som henholdsvis ATCC nr. 31.133 og FERM nr. 2455.

Stammen MA 144-M^ har følgende egenskaber: 1) Morfologiske egenskaber:

Under mikroskop observeres veludviklede åbne spiraler fra forgrenede substratmycelier. Der er ingen snoninger, og 10 den modne sporekæde er moderat lang med mere end ti sporer. Sporerne er ellipsoide og måler 0,4 til 0,8μ x 0,8 til 1,6μ, og deres overflade er glat.

2) Egenskaber på forskellige medier:

Beskrivelsen i parentes følger farvestandarden i "Color Har-15 mony Manual", udgivet af Container Corporation of America, U.S.A.

a) På glycose-aspargin-agar, inkuberet ved 27°C: lys gulligbrun vækst (3gc, Lt. Tan), intet luftmycelium, intet opløseligt pigment.

20 b) På sucrose-aspargin-agar, inkuberet ved 27°C: farveløs eller lys gulligbrun vækst (3gc, Lt. Tan), intet luftmycelium, intet opløseligt pigment.

c) På glycerol-aspargin-agar (ISP medium nr. 5), inkuberet ved 27°C: gulligorange (4ic, Suntan) til brun (51g, Cocoa 25 Brown) vækst, hvidt til lysegråt (2fe, Covert Gray) luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

d) På stivelse-uorganiske salte-agar (ISP medium nr. 4), inkuberet ved 27°C: blegorange (3ea, Lt. Melon Yellow) til bleg gulligbrun (3ie, Camel) vækst, lysegråt (2fe, Covert 30 Gray) til gråt (e, Gray) luftmycelium, brunt opløseligt pig-• ment.

146342 5 e) På tyrosin-agar (ISP medium nr. 7), inkuberet ved 27°C: Brunliggråt (31i, Beaver) til brunt (41g, Toast Tan) luftmycelium, sort opløseligt pigment.

f) På næringsagar, inkuberet ved 27°C: farveløs til grålig-5 brun vækst, intet luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

g) På gærekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP medium nr. 2), inkuberet ved 27°C: lysebrun (41e, Maple) til brun (4ng, Lt.

Brown) vækst, lysegråt (3fe, Silver Gray) til gråt (3ih,

Beige Gray) luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

10 h) På havremel-agar (ISP medium nr. 3), inkuberet ved 27°C: farveløs til bleg gulligbrun (2gc, Bamboo) vadest, lysegråt (3fe, Silver Gray) luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

i) På glycerolnitrat-agar, inkuberet ved 27°C: farveløs til bleg gulligbrun (3gc, Lt. Tan) eller lys olivengrå (2db, 15 Parchment) vækst, intet luftmycelium, intet opløseligt pigment.

j) På stivelses-agar, inkuberet ved 27°C: bleg gulligbrun (3gc, Lt. Tan) vækst, gråt (e, Gray) luftmycelium, svagt brunt opløseligt pigment.

20 k) På calciummalat-agar, inkuberet ved 27°C: farveløs vækst, grålighvidt (b, Oyster White) til lyst brunliggråt (3de,

Natural) luftmycelium, intet opløseligt pigment.

l) Stikkultur på gelatine, inkuberet ved 20°C: Blegbrun til bleg gulligbrun vækst, luftmycelium, brunt opløseligt pig- 25 ment.

m) Stikkultur på glueose-pepton-gelatine, inkuberet ved 27°C: Blegbrun til brun vækst, intet luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

n) På skummet mælk, inkuberet ved 37°C: Blegbrun til brun 30 vaekst, intet luftmycelium, brunt opløseligt pigment.

6 146342 3) Fysiologiske egenskaber: a) Væksttemperaturen blev undersøgt på maltose-gærekstrakt-agar (maltose 1,0%, gærekstrakt 0,4%, agar 3,5%, pH 6,0) ved 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C. Optimal temperatur for væk- 5 sten er 27-37°C, og der er ingen vækst ved 50°C.

b) Gelatinesmeltning ved stikkultur på 15% gelatine ved 20°C og ved stikkultur på glucose-pepton-gelatine ved 27°C: Gelatinesmeltningen observeredes som svag på førstnævnte medium med 14 dages inkubation, men som svag eller moderat 10 efter 7 dages inkubation på sidstnævnte medium.

c) Stivelsehydrolyse på stivelse-uorganiske salte-agar ved 27°C: svag hydrolyse observeredes efter 5 dages inkubation.

d) Peptonisering og koagulation af skummet mælk ved 37°C: moderat til stærk peptonisering begyndte efter 5 dages in- 15 kubation og ophørte efter ca. 17 dage. Ingen koagulation.

e) Melanindannelse på tyrosin-agar (ISP medium nr. 7), tyro s in-gærekstr akt-næringsvæske (ISP medium nr. 1) og pep-ton-gærekstrakt-ferro-agar (ISP medium nr. 6) ved 27°C: positiv på alle medier.

20 f) Smeltning af calciummalat på calciummalat-agar ved 27°C: stærkt positiv.

g) Nitratreduktion på pepton-agar indeholdende 1,0% natriumnitrat (ISP medium nr. 8) ved 27°C: positiv.

h) Udnyttelse af kulhydrater i Pridham-Gottlieb-basalmedium 25 (ISP medium nr. 9), inkuberet ved 27°C: rigelig vækst med L-arabinose, D-xylose, glucose, D-fructose, sucrose, inositol, L-rhamnose og raffinose, ingen vækst med D-mannitol.

Ved sammenfatning af de ovenstående karakteristika for nr.

MA 144-M^ ses stammen at høre til slægten Streptomyces og 146342 7 at være af kromogen type, og den producerer brunt opløseligt pigment på forskellige agar-medier. Luftmyceliet danner åbne spiraler, men ingen snoninger. Sporeoverfladen er glat. Væksten på forskellige medier er i almindelighed 5 bleg gulligbrun til brun, men olivenfarvet i nogle få medier, og luftmyceliet er lysegråt. Nitrat reduceres til nitrit.

Den proteolytiske virkning er svag til moderat, og stivelseshydrolysen er relativt svag. Melanin produceres på tyro-sin-agar, tyrosin-gærekstrakt-næringsvæske og pepton-gær-10 ekstrakt-ferro-agar.

Blandt kendte Streptomycesarter ligner stamme nr. MA 144-M^ Streptomyces galilaeus.

Reference 1: Archiv fur Mikrobiologie 31, 356 (1958).

Reference 2: International Journal of Sysematic Bacteriolo-15 gy 22, 298 (1972).

Med særlig opmærksomhed rettet mod differentiation baseret på morfologien, farven af luftmyceliet og andre fysiologiske egenskaber blev forskellen mellem den foreliggende stamme og en bestående standardstamme af Streptomyces galilaeus 20 ISP 5481 undersøgt ved hjælp af parallelkulturer.

Af resultaterne ses det, at den foreliggende stamme er i nær overensstemmelse med Streptomyces galilaeus ISP 5481 med hensyn til morfologi og farve af væksten og myceliet på forskellige medier og med hensyn til fysiologiske egen-25 skaber. Endvidere er der lighed mellem begge stammers fermentationsprodukter, dvs. at cinerubin, som kan produceres af Streptomyces galilaeus, er et af den foreliggende stammes biprodukter. Stamme nr. MA 144-M^ kan således identificeres som hørende til Streptomyces galilaeus.

146342 δ

De submerse, aerobe betingelser, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er fordelagtige til fremstilling af større mængder antibiotika. Det anvendte næringsmedium indeholder kendte næringskilder for actinomyce-5 ter, fortrinsvis kommercielt tilgængelige produkter, såsom glycerol, glucose, stivelse, dextrin, maltose, melasser, olier, fedt og lipider, som carbonkilder i enten renset eller rå tilstand, kommercielt tilgængelige produkter, såsom sojabønnemel, maltekstrakt, pepton, gærekstrakt, di-10 stiller's solubles, fiskemel, glutenmel, majsstøbevand, bomuldsfrømel, casein, hydrolyserede proteinstoffer, nitrater, ammoniumsalte og urinstof, som nitrogenkilder, uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, kalium-phosphat, magnesiumsulfat, calciumcarbonat, og spormængder 15 af tunge metalsalte, såsom kobber, zink, mangan og jern.

I den gennemluftede submerse kultur anvendes et antiskum-middel, såsom flydende paraffin, sojabønnemel, feldt eller silicone. Der kan anvendes en vilkårlig fermentationstemperatur indenfor området 20-35°C, hvorved en MA 144-produceren-20 de organisme kan vokse, skønt det foretrukne temperaturområde • er fra 25-30°C. Kulturmediets pH-værdi er fra 5 til 8,0. Den nødvendige tid for fremstillingen er sædvanligvis 48 til 72 timer.

Isoleringen af MA 144-M^ eller MA 144-M2 fra dyrkningsmediet 25 kan eksempelvis gennemføres på følgende måde:

Efter endt dyrkning ekstraheres MA 144-M.^ eller MA 144-M2 fra dyrkningsmediet med med vand ikke blandbare organiske opløsningsmidler, såsom ethylacetat, butylacetat, chloroform, benzen, n-butanol, methylpropylketon, methylenchlorid eller 30 toluen, i neutral til svagt sur tilstand. I stedet for eller i kombination med opløsningsmiddelekstraktionen af reaktions-blandingen er kromatografi under anvendelse af f.eks. aktivt kul, aluminiumoxid, silicagel eller Sephade^ LH-20 og modstrømsfordeling under anvendelse af et egnet opløsningsmid-35 delsystem en mere bekvem fremgangsmåde til isolering 146342 9 og rensning af MA 144-M^ eller MA 144-M2. Opløsningsmiddel-ekstrakter indeholdende nævnte forbindelse reekstraheres direkte eller efter koncentration under reduceret tryk med med vand ikke blandbare organiske opløsningsmidler, og op-5 løsningsmiddellaget, som indeholder MA 144-M^ eller MA 144-M2, blandes med surt vand med en pH-værdi på under 3,0, derefter reekstraheres MA 144-M^ eller MA 144-M2, som er overført til det sure vandige lag, med egnede organiske opløsningsmidler.

Det aktive stof opnås som et råt pigmenteret pulver ved kon-10 centration under reduceret tryk til tørhed af den organiske opløsning. Ved gentagelse af de nævnte fremgangsmåder kan forbindelserne opnås i renset form.

Opløsningen, som indeholder MA 144-M^ eller MA 144-M2, kan også lyofiliseres alene eller sammen med mindst ét stof 15 valgt blandt serum, serumalbumin, globulin, gelatine, glycerol, sukkerstoffer, aminosyrer, desoxyribonucleinsyre og organiske eller uorganiske syrer, såsom saltsyre, phosphor-syre, svovlsyre, eddikesyre, propionsyre, oleinsyre, palmi-tinsyre, citronsyre, ravsyre og pantothensyre.

20 For at opnå rent MA 144-M^ eller MA 144-M2 kan yderligere rensning udføres ved søjlekromatografi under anvendelse af forskellige adsorptionsmidler, såsom kiselsyre, aluminiumoxid, Sephadeji^LH-20, ionbyttere, såsom svagt sure harpikser og AmberlitXAD, og aktivt kul, gelfiltrering, chela-25 tisering med forskellige metaller og en kombination af én eller flere fremgangsmåder valgt blandt chelatisering med metalioner, opløsningsmiddelfældning, opløsningsmiddelekstraktion, modstrømsfordeling, kromatografi, koncentration, adsorption til adsorptionsmidlet og adsorption fulgt af 30 eluering fra en ionbytterharpiks, en adsorberende kiseljord eller et syntetisk adsorptionsmiddel. Nærmere enkeltheder fremgår af de efterfølgende eksempler.

ίο 146342

Rent MA 144-M^ og MA 144-M2 har følgende fysisk-kemiske egenskaber: MA 144-M1

Svagt basisk, lipofilt, gult pulver. Elementæranalyse gi-5 ver følgende værdier for C42H55°i5Ni

Fundet: C 62,37 H 7,08 O 28,81 N 2,07

Beregnet: C 61,98 H 6,81 O 29,49 N 1,72

Molekylvægt 814.

20

Smeltepunktet og den specifikke drejning ([α]β af en 1%'s 10 opløsning i chloroform) er henholdsvis 149-150°C og 40° ·

Dets absorptionsspektre i det ultraviolette og i det synlige område i methanol viser maksima ved de følgende bølgelængder (fig. 1): W «ί\·> 15 i MeOH 229(775), 258(335), 290(128), 432(155) i 0,01 N HCl-MeOH 229(815), 259(345), 290(130), 432(160) i 0,01 N NaOH-MeOH 237(575), 250s(405), 290(125), 323s(80), 526(135) s = skulder.

20 I fig. 1 viser den fuldt optrukne linie absorptionsspektrene for ultraviolet og synligt lys i methanol, den punkterede linie er spektret i 0,01 N HCl-methanol, og x-x-x-linien er spektret i 0,01 N NaOH-methanol. Fig. 2 viser det infrarøde absorptionsspektrum (KBr-tablet). Fig. 3 viser det nuclear-25 magnetiske resonansspektrum (100 MHz, CDCl^)· MA 144-M^ er opløseligt i surt vand, dimethylsulfoxid, methylcellosolve, methanol, ethanol, ethylacetat, acetone, chloroform, benzen, toluen og svagt opløseligt i vand, di-ethylether og n-hexan. På den anden side er det saltsure 30 salt opløseligt i vand, methanol og chloroform, men kun svagt opløseligt i acetone og ethylacetat. Den methanoliske opløsning af MA 144-M^ er gul i koncentreret HC1, men bliver 146342 11 rødligbrun i koncentreret svovlsyre. Med alkoholisk magnesiumacetat viser opløsningen en rød farve, og den bliver purpurrød ved tilsætning af base. MA 144-M1 giver en negativ ninhydrinreaktion og reducerer ikke Fehling-væsken.

5 MA 144-M2

Svagt basiske, lipofile, røde, nåleformede krystaller. Elementæranalyse giver de følgende værdier for C42H55°i6N:

Fundet: C 60,43 H 6,74 O 29,70 N 1,75

Beregnet: C 60,79 H 6,68 O 30,84 N 1,69 10 Molekylvægt 830.

Smeltepunktet er 151-152°C, og den specifikke drejning

JA Q

([a]p af en 1%'s opløsning i chloroform) er 127°. Absorptionsspektrene i det ultraviolette og i det synlige område viser maksima ved de følgende bølgelængder (fig. 4): 15 W (Ei*om> i MeOH 235(600), 259(310), 269(170), 291(105), 492 (165) i 0,01 N HCl-MeOH 235(615), 259(325), 269(185), 291(115), 492(170) 20 i 0,01 N NaOH-MeOH 237(505), 269(145), 292(95), 330(55), 554(175), 597(145).

I fig. 4 viser den fuldt optrukne linie absorptionsspektrene for ultraviolet og synligt lys i methanol, den punkterede linie er spektret i 0,01 N HCl-methanol, og x-x-x-linien er 25 spektret i 0,01 N NaOH-methanol.

Fig. 5 viser det infrarøde absorptionsspektrum (KBr-tablet), og fig. 6 viser det nuclearmagnetiske resonansspektrum (100 MHz, CDC13).

MA 144-m2 er opløseligt i surt vand, dimethylsulfoxid, 30 methylcellosolve, chloroform, ethylacetat, methanol, ethanol, 146342 12 acetone, benzen og svagt opløseligt i vand, n-hexan, cyclo-hexan, diethylether og petroleumsether. Det saltsure salt er opløseligt i vand, methanol, ethanol og chloroform, men kun svagt opløseligt i acetone og ethylacetat. MA 144-M2 5 giver en negativ ninhydrinreaktion og reducerer ikke Fehling-væsken.

Methanolopløsningen er rød i koncentreret saltsyre og bliver violet i koncentreret svovlsyre. Opløsningen er purpurrød i alkoholisk magnesiumacetatopløsning og bliver purpur-10 blå i NaOH-opløsning.

Den kemiske struktur af de omhandlede forbindelser MA 14 4-M^ og MA 144-M2 blev bestemt som følger:

Ved hydrolyse af MA 144-M^ eller MA 144-^ med fortyndet saltsyre var de opnåede fysisk-kemiske egenskaber, såsom 15 absorptionsspektrene i de ultraviolette, synlige og infrarøde områder, massespektrene og de nuclearmagnetiske resonansspektre, smeltepunkterne, elementæranalysen og Rf-værdierne på kiselsyretyndtlagsplader af aglycondelen, fuldstændigt sammenfaldende med egenskaberne af den aglycon, som opnåedes 20 fra henholdsvis aclacinomycin A og cinerubin A, dvs. agly-conen i MA 144-M^ var aclavinon og i MA 144-M2 ε-pyrromyci-non.

På den anden side fandtes der, ved sammenligning af Rf-vær-dierne på kiselsyretyndtlagsplader for sukkerdelene, som op-25 nåedes ved hydrolyse af aclacinomycin A eller cinerubin A, ’ med Rf-værdierne af de sukkerdele, som opnåedes ved hydrolyse af de omhandlede forbindelser, rhodosamin og 2-desoxyfucose i begge typer forbindelser, men det endestillede sukker, som er L-cinerulose i de kendte forbindelser, var anderledes. Endvide-30 re blev det methylerede disaccharid, som opnåedes fra MA 144-M^ og MA 144-M2 ved partiel methanolyse i methanol indeholdende 0,1 N saltsyre ved stuetemperatur, ekstraheret med ether, renset med kiselsyre og Sephadej^ LH-20. søjlekromatografi og derefter krystalliseret som hvide pladeformede krystaller i ether.

146342 13

De fysisk-kemiske egenskaber af det omtalte methylerede disaccharid er som følger:

Elementæranalyse for ci3H24°6:

Fundet: C 57,09 H 8,61 O 34,30 5 Beregnet: C 56,51 H 8,75 O 34,74

Molekylvægt 276.

Smeltepunkt 87-91°C (sublimationspunkt).

Specifik drejning [a]= “161° (c = 1,0, chloroform) .

Absorptionsspektrene i det ultraviolette og synlige område 10 for det methylerede disaccharid viste endegruppeabsorption, og dets infrarøde absorptions- og NMR-spektre er vist i fig. 7 og 8. Af de ovenstående resultater af analysen blev strukturen af methyldisaccharidet bestemt som

OCBL

.<p*

Ία—°\ 0H

15 Methyldisaccharider opnået fra MA 144-M^ og MA I44-M2 var identiske med hensyn til deres fysisk-kemiske egenskaber.

Ved methanolysen af MA 144-M^ og MA 144-M2 blev 1-desoxy-pyrromycin og pyrromycin også påvist på basis af elementæranalyse, absorptionsspektrene i det infrarøde, ultraviolet-20 te og synlige område, NMR-spektret, smeltepunkt eller Rf-værdier på kiselsyretyndtlagsplader.

Af de ovennævnte resultater blev strukturerne af MA 144-M^ og MA 144-M2 bestemt at være som følger: U6342 14 O COOCH3

''OH

WrV

OH 0 OH O

„<£> °\j l/CH3 K 2 / N. MA 144-M, HO \*3 i(^y °* OH O COOCH3

I ^OH

VWV

OH 0 OH O

λγΝ X^* f\ Uil3 / N MA 144-M0 ^•y x'·.

146342 15

Medens der i teknikken kendes et antal anthracyclinglycosid-antibiotika med aclavinon- og ε-pyrromycinonaglyconbéstanddele, er forbindelserne MA 144-M^ og MA 144-M2 klart forskellige fra ethvert af disse i sådanne karakteristika som 5 molekylformel, nedbrydningsprodukter ved sur hydrolyse, absorptionsspektre ved ultraviolet, synligt og infrarødt lys og NMR-spektrum, som beskrevet ovenfor. Som ovenfor nævnt er MA 144-M^ og MA 144-M2 forskellige fra aclacinomycin A og cinerubin A med hensyn til deres endestillede sukker.

10 [Referencer: 1. The Journal of Antibiotics 28, nr. 10, 830-834 (1975). 2. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 68-77 (1970)] .

Amicetose, som er det endestillede sukker i de omhandlede forbindelser, er kun identificeret i antibiotikaet amicetin.

15 [Reference: J.Am.Chem.Soc. 8j5, 3592-3594 (1964)]. Blandt antibiotika af rhodomycintypen er der et antibiotikum med en lignende sukkerdel, rhodosamin-2-desoxyfucose-rhodinose, men dette er klart forskelligt fra MA 144-M.^ og MA 144-M2 i dets aglycon og endestillede sukker [Reference: Pharma-20 zie 27, 782-789 (1972)].

Det er således verificeret, at MA 144-M^ og MA 144-M2 er hidtil ukendte forbindelser.

Por yderligere at præcisere egenskaberne af MA 144-M^ og MA 144-M2 er Rf-værdierne på kiselsyretyndtlagsplader med 25 forskellige opløsningsmiddelsystemer vist nedenfor:

Rf-Værdier

Opløsningsmiddel system MA 144 M^ MA 144-M2 1) Chloroform/methanol 10:1 0,45 0,45 2) Chloroform/methanol 20:1 0,11 0,11 30 3) Acetone 0,38 0,28 4) Ethylacetat 0,024 0,024 146342 16

De biologiske aktiviteter af MA 144-M^ og MA 144-M2 er som følger: 1) MA 144-M^ og MA 144-M2 har antimikrobiel aktivitet mod forskellige slags mikroorganismer. Den minimale inhibitori-5 ske koncentration af de foreliggende forbindelser, bestemt ved næringsvæskefortyndingsmetoden, er vist i tabellen.

TABEL·.

Minimal inhibitorisk koncentration (MIC, yg/ml) af MA 144-M^ og MA 144-M2......

Testet organisme MA 144-M^ MA 144-M2 10 Staph.aureus FDA 209P 3,1 0,78

Staph.aureus Smith 0,2 0,1

Bac.subtilis ATCC 6633 0,4 0,05

Bac.cereus ATCC 9634 0,78 0,05

Bac.megaterium NRRL B-938 3,1 0,78 15 Sarcina lutea ATCC 341 0,05 0,05

Mic.flavus 0,2 0,2

Cory.bovis 0,4 0,1

Ps.fluorescens NIH JB-254 >100 >100

Proteus morganii (The Institute for >100 >100

Infectious

Diseases) 20 Mycobact.smegmatis ATCC 607 2;5 1,25

Strept.pyogenes NY 5 1,25 0,63

Can.albicans IAM 4905 100 50

Can.tropicalis IAM 4942 >100 100

Som angivet ovenfor viser MA 144-M^ og MA 144-M2 antimikrobi-25 el aktivitet mod grampositive bakterier, og de er således terapeutisk nyttige mod difteri, tuberkulose, pneumonia, tetanus og infektionssygdomme forårsaget af Staphylococcus og Streptococcus.

146342 η 2) MA 144-Μ^ og MA 144-M2 viser også en udpræget antitumoraktivitet med lav toksicitet, og de har vist sig at være effektive til farmaceutisk brug som anticancermidler.

a) Terapeutisk effektivitet på L1210-inficerede mus.

Dosering Forlængelse af overlevel- 5 (mg/kg/dag) sestiden (%)_ MA 144-M1 MA 144-M2 10 90 5 200 46 2,5 192 85 10 1,25 137 200 0,625 123 192 0,313 110 144 0,156 110 116 CDF^-L1210. Forbindelsen blev administreret intraperitonealt 15 fra dag 0 til dag 10.

b) Terapeutisk effektivitet på P388-inficerede mus.

Dosering Forlængelse af overlevel- (mg/kg/dag) sestiden (%)_ MA-144 Μχ MA 144-M2 5 100 57 20 2,5 184 83 1,25 149 206 0,625 135 148 0,313 110 125 25 CDF^-P388. Forbindelsen blev administreret intraperitonealt fra dag 1 til dag 9.

18 166342 c) Terapeutisk effektivitet på Sarcoma 180 fast tumor.

Dosering Vægt af tumor (g) % inhibition af tumorvækst (mg/kg/dag) MA 14 4^ MA 144-M2 MA 144-Μχ MA 144-M2 5 0,38 toksisk 77,4 - 2,5 0,65 0,28 61,3 83,3 5 1,25 0,81 0,39 51,9 76,8 0,6 0,78 0,90 53,7 46,5 0,3 1,25 1,41 25,5 16

Kontrol 1,68 - 0 dd-mus blev inokuleret med 2 x 10® celler af Sarcoma 180, og 10 forbindelsen blev administreret intraperitonealt fra dag 1 til dag 10.

3) Akut toksicitet.

LDgQ for MA 144-M^ og MA 144-M2 er vist i den følgende tabel:

Administrations- LD50

Dyr ve^ MA 144-M^ MA 144-M2

Mus i.p. 35 12,5 15 i.v. 30-35 12-20

Rotte i.p. 25-30 10-15 i.v. 25-30 10-15 4) Cytotoksicitet.

MA 144-M^ og MA 144-M2 inhiberede væksten af dyrkede patte-20 dyr-tumorceller, især ved lav koncentration, og inhiberede fuldstændigt RNA-syntesen. I dette forsøg blev L1210-celler inokuleret i flydende syntetisk næringssubstrat (RPMI 1640-medium, Nissui, Roswell Park Memorial Institute 1640) tilsat 10% kalveserum og dyrket ved 37°C i 3 dage i en C02~inkubator, 25 og MA 144-M^, MA 144 M2 og ^C-precurser blev tilsat i forskellige koncentrationer. Virkningerne på syntesen af protein, RNA og DNA blev indikeret af den 50%'s inhiberende koncentration (yg/ml), som vist i den følgende tabel. Ifølge resultaterne inhiberede MA 144-M1 og MA 144-M2 tydeligt væksten af dyr- 146342 19 kede L1210-celler og RNA-syntesen ved den lave koncentration. Disse resultater understøttede den terapeutiske effektivitet på eksperimentelle tumorer hos dyr.

Virkninger af MA 144-M^ og MA 144-M2 på væksten og den 5 makromolekylære syntese i dyrkede L1210-celler.

ID5q (yg/ml)

Ll210-Celler MA 144-M.j^ MA 144-M2 Vækst 0,12 0,05 DNA-syntese 1,7 1,0 RNA-syntese 0,7 0,5 10 Proteinsyntese 10 *) ae) %' s inhibition ved en koncentration på 10 yg/ml.

Som ovenfor nævnt har forbindelserne MA 144-M^ og MA 144-M2 en udpræget inhibitorisk virkning på maligne tumorer hos pattedyr, især på ascitiske og faste tumorer og leukæmi. Så-15 ledes kan forbindelserne MA 144-M1 eller MA 144-M2, deres salte eller deres komplekser anvendes som terapeutiske midler mod maligne tumorer af fast og ascitisk type.

De omhandlede forbindelser danner ikke-toksiske syreadditionssalte med forskellige organiske og uorganiske saltdannende 20 reagenser og ikke-toksiske komplekser med nucleinsyrer. Således kan syreadditionssalte dannet med farmaceutisk acceptable organiske eller uorganiske syrer, såsom svovl-, phosphor-, salt-, eddike-, propion-, olein-, palmitin-, citron-, rav-, vin-, glutamin- og pantothensyre, anvendes på samme 25 måde som MA 144-forbindelserne per se. Disse salte dannes, isoleres, renses og formuleres ved de fremgangsmåder, som almindeligvis anvendes til saltdannelse for antibiotika. F.eks. opløses det nævnte udvalgte antibiotikum og den pågældende syre hver for sig i et passende opløsningsmiddel, hvori salte 30 har en lav opløselighed, f.eks. ethylether og acetone eller deres blanding, og blandes derefter. Opløsningen koncentreres om nødvendigt og afkøles, hvilket giver krystaller af det 146342 20 nævnte syreadditionssalt, som opsamles og tørres, hvilket giver et krystallinsk pulver. De resulterende salte har en større opløselighed i vand end de tilsvarende antibiotika og anvendes fortrinsvis ved en terapeutisk applikation.

5 Ved anvendelse af de omhandlede antibiotika er et ikke-tok-sisk kompleks deraf med desoxyribonucleinsyre også terapeutisk nyttigt. I dette tilfælde kan DNA ekstraheret fra dyr og mikroorganismer, såsom kalvethymus, Hela-celler, embryoceller fra mennesker og dyr og gærsvampe, anvendes.

10 Fremstilling af DNA-MA 144-komplekser kan udføres ved fremgangsmåder beskrevet i litteraturen for fremstilling af DNA-komplekser af andre anthracyclinantibiotika, såsom adriamycin og daunorubicin (se f.eks. Nature New Biol. 239, 110 (1973) og Europ.J.Cancer 10, 399 (1974)). Til terapeu-15 tiske formål er forbindelserne i den frie baseform ækvivalente med deres ikke-toksiske syreadditionssalte og komplekser.

I farmaceutiske præparater kombineres MA 144-M^, MA 144-M2 eller begge stoffer med en inert, farmaceutisk acceptabel 20 bærer eller et fortyndingsmiddel. De aktuelt foretrukne mængder af det anvende MA 144-stof vil variere efter den bestemte forbindelse, som anvendes, den bestemte formulering af præparatet, applikationsmåden og det bestemte sted og den bestemte organisme, som behandles. Mange faktorer, som æn-25 drer virkningen af præparatet, må tages i betragtning af fagfolk, f.eks. alder, legemsvægt, køn, kost, administrationstidspunkt, administrationsvej, udskillelseshastighed, medicinkombinationer og overfølsomhedsreaktioner. Den optimale applikationshastighed for et givet sæt betingelser kan kon-30 stateres af fagfolk ved anvendelse af konventionelle doseringsbestemmelsesprøver under hensyntagen til de ovenstående retningslinier.

Ved parenteral injektion af MA 144-M^ eller MA 144-Mj opløses dets salte eller dets komplekser i destilleret vand eller i 35 fysiologisk saltopløsning for injektion og injiceres intra- 146342 21 peritonealt, intravenøst, subcutant eller lokalt i patienten. Ved doseringen og injektionsvejen må resultater af dyreforsøg, tilstanden af patienter og forsøgsdyr, alder, legemsvægt, køn, følsomhed, injektionsskema, injektions-5 periode og kombination med anden medicin tages i betragtning. Administration kan udføres kontinuerligt eller periodisk indenfor den maksimalt tålte dosis. MA 144-M^ eller MA 144-M2, dets salte eller dets komplekser kan også administreres oralt i form af tabletter, piller, kapsler, pulvere og gra-10 nulater eller suspensioner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende eksempel.

Eksempel.

Der blev fremstillet et næringsmedium med følgende sammen-15 sætning:

Kartoffelstivelse 2% vægt/volumen

Glucose 2 "Meat" (varemærke for sojabønne- 2,5 pulver) kh2po4 0,1 20 K2HP04 0,1

MgS04.7H20 0,1

NaCl 0,3

MnCl2.4H20 0,0005

FeS04.7H20 0,0005 25 Silicone 0,005 (pH 7,2) 50 ml af dette medium blev steriliseret ved 120°C i 15 minutter i en 500 ml kolbe, denne blev inokuleret med 1 ml af en frossen kultur af Streptomyces galilaeus MA 144-M^ (FERM P-2455) og inkuberet ved 30°C i 48 timer på en roteren-30 de rystemaskine. 10 liter af det tidligere steriliserede medium i en 20 liter fermentationsbeholder af rustfrit stål blev aseptisk inokuleret med 200 ml af den ovennævnte podekultur. Fermentationen blev udført ved 30°C i 18 timer un- 146342 22 der omrøring (300 omdr./min.) og gennemluftning (5 1/min.). Derefter blev 10 liter af denne kultur overført til 600 liter af det tidligere steriliserede medium i en 1 Kl-rustfri ståltank som den anden podning og dyrket ved 30°C i 48 timer 5 under omrøring (180 omdr./min.) og gennemluftning (200 1/min.).

Det opnåede dyrkningsmedium (570 liter) blev indstillet på pH 5/0 med svovlsyre og filtreret gennem diatoméjord. Den resulterende filterkage (54 kg) blev suspenderet i 7 liter acetone og filtreret efter 3 timers omrøring. Remanensen 10 blev reekstraheret med 85 liter acetone. Begge ekstrakter blev koncentreret til 40 liter under reduceret tryk, sat til 25 liter ethylacetat og omrørt. Efter fraskillelse af ethylacetatlaget og koncentrering til 1 liter under reduceret tryk udfældedes rå aclacinomycin A-blanding ved tilsætning 15 af n-hexan til koncentratet, og der opnåedes derefter 16 g af et orangegult pulver efter to ganges vask med en n-hexan-ethylacetat-blanding (50:1).

Dette rå pulver blev opløst i 200 ml ethylacetat, anbragt på en søjle fyldt med 700 g "Column-Lite" (kiselsyre) og 20 elueret med en ethylacetat-methanol-blanding (1:1). Det gule eluat blev koncentreret til tørhed under reduceret tryk. Det opnåede rå aclacinomycinpulver (12 g) blev opløst i 100 ml _3 chloroform og omrystet med 50 ml 10 M EDTA-0,01 M phosphat-puffer (pH 6,8) for at fjerne resterende metalioner, og 25 chloroformlaget blev vaskes to gange med vand, tørret med vandfrit natriumsulfat og derefter koncentreret til tørhed under reduceret tryk. Der opnåedes 11 g af et gult pulver indeholdende aclacinomycin A.

Dette pulver blev opløst i en lille mængde toluen, anbragt 30 på en kiselsyresøjle (4 x 40 cm) og elueret. Aclacinomycin A, B og andre urenheder blev elueret med 2% vægt/volumen metha-nolholdigfctoluen, og derefter blev MA 144-M^fraktionen elueret med 3% methanolholdigttoluen og koncentreret til tørhed, hvilket gav 10,5 mg MA 144-M^ som et gult pulver.

Claims (2)

148342 Den ovennævnte Column-Lite-søjle blev efter eluering af _3 de gule fraktioner behandlet med 10 M EDTA-holdig 30% vægt/volumen methanolblanding, og det resulterende røde eluat blev inddampet til tørhed, hvilket gav 5,0 g af et 5 rødt pulver indeholdende cinerubin A. Dette røde pulver blev behandlet med EDTA og kromatograferet på en kisel-syresøjle som beskrevet for MA 144-M^ Der opnåedes 6,2 mg MA 144-M2 som et rødt pulver.

1. Fremgangsmåde til fremstilling anthracyclinglycosid- antibiotica betegnet MA 144-M^ og MA 144-M2 med formlerne R O COOCH3 I ΧΟΗ YyYx OH O OH H O R - H (MA 144-M^) eller R -OH (MA 144-M2) <E>K; OHy_O ? OH eller ikke toksiske syreadditionssalte eller komplekser deraf med desoxyribonucleinsyre, kendetegnet ved, 15 at man dyrker en stamme af arten Streptomyces galilaeus, fortrinsvis ATCC 31.133 (FERM P-2455), under submerse aerobe betingelser i et næringsmedium indeholdende en carbonkilde,