CN104644631A - 新乌头碱对k562细胞生物学特性的改变 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新乌头碱对K562细胞生物学特性的改变。新乌头碱由包含在附子的有效成分提取液中。附子的有效成分提取液提取的方法为：取附子粉末过三号筛2g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，加入异丙醇：乙酸乙酯为1:1的混合溶液50ml，超声处理，功率300W,频率40kHz，水温在25℃以下30分钟，放冷，用异丙醇：乙酸乙酯为1:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，量取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇：二氯甲烷为1:1的混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得。本发明的有益效果是：新乌头碱能诱导K562中的干细胞比例降低。新乌头碱明显抑制K562细胞的克隆形成。

Description

新乌头碱对K562细胞生物学特性的改变

技术领域

本发明属于医学技术领域，涉及新乌头碱对K562细胞生物学特性的改变。

背景技术

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品。始载于《神农本草经》，其味辛、甘，性大热，有毒。归心、脾、肾经，具有回阳救逆，补火助阳，散寒除湿，止痛的功效，被称为“回阳救逆第一品”。具有镇痛、抗炎、抗癫痫、抗肿瘤、提高免疫功能等多种生理活性[1-3]。

现今生物医学领域内最热门的课题之一便是白血病细胞的诱导分化及逆转机制研究。白血病已经被公认为是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，其生物学特征是造血细胞增殖失控，使细胞不能分化成熟,使细胞的正常凋亡过程障碍，而出现异常分化细胞大量增殖。目前，白血病的治疗仍采用传统的大剂量联合化疗，该方法虽能快速杀灭癌细胞，具有作用明显，针对性强等特点，但同时其产生的副作用也不容忽视，化疗药物在作用于白血病细胞的同时，也作用于正常的细胞，容易抑制骨髓造血功能及免疫功能，损害肝肾，对心脏有毒性作用，引起胃肠道反应。通过化疗和放疗后，最终仍有80％左右患者复发了白血病，因残留的白血病细胞仍持续存在，很难获得长期无病生存。目前对于白血病K562细胞株尚无好的抑制方法。

本发明用Caco-2单层细胞培养法模拟中药血清药理学方法给药，观察云南特色有效的温阳药物大回阳饮中的新乌头碱对白血病细胞及其干细胞的诱导驯化作用，以此改变恶性细胞的阴阳状态，将其从静止封闭的阴态提升至激活开放的阳态，明确温阳中药有效成分对白血病及其干细胞生物特性的影响程度，为白血病尤其是白血病干细胞治疗久攻不下寻求突破的新途径。

发明内容

本发明涉及新乌头碱对K562细胞生物学特性的改变。

包括新乌头碱对K562细胞的抑制作用。

进一步，所述新乌头碱由包含在附子的有效成分提取液中。

进一步，所述附子的有效成分提取液提取的方法为：取附子粉末过三号筛2g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，加入异丙醇：乙酸乙酯为1:1的混合溶液50ml，超声处理，功率300W，频率40kHz，水温在25℃以下30分钟，放冷，用异丙醇：乙酸乙酯为1:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，量取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇：二氯甲烷为1:1的混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得。

本发明的有益效果是：新乌头碱能诱导K562中的干细胞比例降低。新乌头碱明显抑制K562细胞的克隆形成。

附图说明

图1：Caco-2细胞单层绒毛面(扫描电子显微镜)(15000×)；

图2：已分化的Caco-2细胞单层顶端特性微绒毛(透射电子显微镜)(×20000)；

图3(a)K562细胞；

图3(b)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72h；

图4(a)K562细胞(×15000)；

图4(b)K562细胞(×2500)；

图4(c)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72h(×15000)；

图4(d)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72h(×2500)；

图5(a)阴性组；

图5(b)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞14天。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

附子有效成分的提取

取本品粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液50ml，称定重量，超声处理(功率300W,频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷(1:1)混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得[4]。

附子有效成分提取液中含有新乌头碱，下面通过实验说明新乌头碱对K562 细胞的生物学特性的改变。

肿瘤细胞培养：K562(购买于昆明中科院动物所)将白血病K562细胞接种于含10％小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃含5％CO₂的培养箱内培养传代。每2-3天换液1次，所有实验均在细胞的对数生长期内进行。研究大回阳饮的附子中的成分新乌头碱作用于白血病K562细胞株使其生物学特性发生改变。大回阳饮有效成分提取经Transwell转运池Caco-2细胞模型确定无细胞毒浓度，有效成分作用K562细胞，电子显微镜显微镜下观察白血病细胞形态变化。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态、凋亡的情况，分析CD34⁺38_-等抗原变化，同时使用甲基纤维素细胞体外克隆形成细胞培养法观察白血病细胞株K562集落形成情况。研究发现，新乌头碱作用K562细胞72h的无细胞毒的浓度范围为25μg/ml-50μg/ml。K562细胞形态学上有明显的凋亡变化。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期和凋亡状态，S期比例上升，细胞凋亡率上升。细胞分化抗原检测结果提示新乌头碱使K562细胞向巨核系分化，但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。新乌头碱能够明显抑制K562细胞的克隆形成。结果表明，大回阳饮中的附子里的新乌头碱具有药理活性。

Transwell转运池细胞培养法的建立：Caco-2细胞的培养，将液氮中取出复苏的Caco-2在150×g离心转移至DMEM-15的25cm²的细胞培养瓶中，每瓶5ml培养基。以后每隔3d换液一次，当细胞达到80％-90％汇合时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA进行消化传代。当细胞达到80％汇合时，将细胞消化记数，用DMEM-10稀释至1.0×10⁵—2.5×10⁵/ml。向Transwell的顶端绒毛面加入1.5ml的已充分混合的细胞悬浮液，底端基底面加入2.6ml的DMEM-10完全培养基。然后将Transwell放入37℃含5％CO2的培养箱内培养。每隔一天换液一次，直至第21天，测定培养21天的Caco-2细胞单层的电阻值，每孔均大于500Ω/cm²，表明其具有足够的紧密连接和完整性。可用来进行药物吸收和转运机制的试验研究。同时测定碱性磷酸酶的数值，证明已分化完全。电镜拍照。

MTT法检测附子提取物对Caco-2细胞生毒性实验：取对数生长期Caco-2细胞，0.25％胰酶消化，制成4×10⁴/ml的单细胞悬液，接种于96孔培养板，200μl/孔，培养24h，吸净培养液，分别加入8个浓度附子提取物溶解到Hank平衡 盐溶液(HBSS)中(0、50、100、200、400、00、800、1000μg/ml)200μl作用2h后取出一板，加入MTT(5mg/ml)，20μl/孔。培养4h后，吸净培养液，加入DMSO150μl/孔，振荡溶解10min，使结晶物充分溶解。酶标仪测波长490nm处光密度(OD)值，计算附子提取物对Caco-2细胞的生长抑制率[5]。抑制率＝(空白组A值-实验组A值)/空白组A值×100％。

注：空白组A值＝只加HBSS的Caco-2细胞悬浮液经上述处理后用490nm滤光片在酶标仪上测定的吸光度。实验组A值＝将药物溶解在HBSS的Caco-2细胞悬浮液经上述处理后用490nm滤光片在酶标仪上测定的吸光度。

附子提取物经Transwell转运池：Caco-2细胞单层细胞模型，取出Transwell，小心吸弃原培养基，用HBSS轻轻漂洗一遍，加入已过滤除菌的HBSS缓冲盐溶液，测各孔电阻值，TEER＝(Rs-Rb)×4.67cm²，当T＞150时，该穴可用。弃去上穴吸收池内缓冲液，加入1.5ml已配好的样品液大回阳饮提取物150μg/ml(无菌HBSS配制)，置二氧化碳培养箱中作用2小时。2小时后，各孔下穴的全部样品液分别用青霉素小瓶盛装，作好标记。膜完整性检测，样品全部取出后再加入HBSS缓冲盐溶液，测其电阻，以检测细胞单层膜药物作用后是否完整。如果完整，则可将下穴的全部样品液汇集，浓缩，待上高效液相色谱仪检测。

Caco-2细胞单层适用性的确认：Caco-2细胞接种在6孔板上，分别在接种第3d和第14d用HBSS洗细胞单层2次，用含钙，镁4.9mmol/L和0.5％Triton-100磷酸盐缓冲溶液溶解细胞，冰浴1h，14500r/min离心10min，取上清，按Lowry法测定蛋白质含量。使用AKP试剂盒测定AKP活性。在transwell的AP侧加入0.1mmol/L普萘洛尔或1mmol/L阿替洛尔的HBSS0.5ml，BL侧加入HBSS1.5ml，于37℃水浴振摇温育1h，收集BL侧溶液，HPLC测转运量，计算表观渗透系数(Apparent permeabilitycoefficient，Papp[6]。Caco-2细胞在电子显微镜下观察并拍照。

苯甲酰新乌头原碱和新乌头碱的高效液相色谱检测：

标准品溶液的制备：精密称取苯甲酰新乌头原碱标准品和新乌头碱标准品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(1:1)混合溶液制成每1ml各含5μg的混合溶液，经0.2μm微孔滤膜滤过，10μL进样分析[7]。

供试品溶液的制备：取提取好的附子的有效成分1mg，溶解于10mLHBSS 溶液于10mL比色皿中。超声10min。供试品溶液经0.2μm微孔滤膜滤过，10μL进样分析。

色谱条件：色谱柱：迪马公司Diamonsil(钻石)C18柱5um250*46mm；检测波长235nm，以乙腈-四氢呋喃(25:15)为流动相A，以0.1mol/L醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，理论塔板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。见表1新乌头碱和苯甲酰新乌头碱的流动相。

表1

MTT法测定苯甲酰新乌头原碱标准品和新乌头碱标准品对K562细胞增殖作用的抑制：将稀释制备好的K562细胞悬液以1.0×10⁵/ml接种于96孔培养板中，每孔100ul。96孔周围用200ul PBS填充。分别加入配成5组不同浓度的苯甲酰新乌头原碱和新乌头碱的药物培养液5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，75μg/ml，100μg/ml K562细胞。同时设空白对照和溶剂对照，每种浓度均行五个平行复孔，置37℃、5％CO₂培养箱培养内分别孵育24h，48h，72h。实验结束前4h每于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20μl，4h，终止培养。将96孔培养板以3000rpm离心机离心10min，弃去上孔培养液，每孔加DMSO 150μl，震荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值(A)，以A值间接反映活细胞数量，计算不同浓度甲酰新乌头原碱和新乌头碱作用K562细胞不同时间的抑制率。记录结果。实验重复3次。细胞抑制率％＝A对照-A处理/A对照×100％。

苯甲酰新乌头原碱标准品和新乌头碱标准品对K562细胞的作用：收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，用新乌头碱标准品的终浓度依次为25μg/ml、50μg/ml，作用72h。同时设立对照组。分别收集细胞。实验重复3次。

瑞氏-姬姆萨(Wright-Giemsa)染色对K562细胞的观察：染色观察细胞形态学 变化：将新乌头碱标准品诱导72h及阴性对照组K562细胞离心后，在洁净玻片上制作细胞涂片，空气干燥后置水平架上用甲醇-冰醋酸(3:1)固定10min，将Wright-Giemsa染液盖满标本1-2min后，加入磷酸盐缓冲液，体积为染液体积的2-3倍，用洗耳球轻轻吹，使染色液混合均匀,继续染色4-10min。冲洗玻片时要使玻片保持水平，使浮在染色液表面的氧化膜从玻片边缘溢出，以免附着在片上形成污渣，影响染色效果。最后使玻片空气干燥，中性树胶封片，光学显微镜观察细胞形态并标记拍照。

电子显微镜对K562细胞的观察：将新乌头碱标准品诱导72h及阴性对照组K562细胞样本用等渗缓冲溶液PBS(PH7.4)洗涤细胞单层两次，切下聚碳酯膜，3.5％戊二醛前固定。

扫描电镜样本处理：新乌头碱标准品诱导72h及阴性对照组K562细胞用PBS漂洗3次，1％四氧化锇固定45min，PBS漂洗三次之后，先后用丙酮、醋酸异戊酯(1:1)、醋酸异戊酯分别脱水10，30分钟。临界点干燥、喷金后，在扫描电子显微镜下观察细胞单层外观。电镜拍照后观察:用JEOL-1200EX型透射电镜观察K562细胞诱导前后超微结构改变，对选定的切片进行摄片，放大合适的倍数拍片，每一张拍8-15张。

K562细胞周期检测：将新乌头碱标准品诱导72h及阴性对照组K562细胞离心后，制成单细胞悬液，1300r/min离心5min，弃去培养液用4℃预冷的PBS洗1次，离心弃去PBS，加入100-150ulμl PBS制成单细胞悬液，吸取细胞悬液迅速吹入70％预冷的乙醇中振荡混匀，4℃冰箱固定过夜。离心弃去固定液，用1mlPBS重悬，离心，弃去上清，加1ml PBS，吹打均匀，过300目筛网。细胞计数。将细胞调成10⁶/ml单细胞悬液。离心细胞，去上清。加入Rnase A酶(工作浓度20μg/ml)，体积为500μl，酶溶于PBS中，室温避光孵育30min。提前准备好冰水混合物，将避光孵育的细胞悬液放入其中冰浴1-2min。终止酶的作用。离心，除去上清。加入PI(工作浓度50μg/ml)，体积为500μl，酶溶于PBS中，室温避光孵育30min后上机检测。

K562细胞凋亡检测：将新乌头碱标准品诱导72h及阴性对照组K562细胞离心后，制成单细胞悬液，用PBS洗二次，收集1-5×10⁵个细胞。在细胞中加入500μl的Binding buffer混匀。其中样本管和阴性管均加。样本管加入5μl AnnexinⅤ-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide混匀。室温避光反应5-15min。在1小时内，进行流式细胞仪的检测。实验重复3次。

K562细胞表型检测：将新乌头碱诱导72h及阴性对照组K562细胞，取收集的K562,用生理盐水洗涤后用PBS液调整细胞浓度为10⁸/ml，再取50μl细胞悬液,分别加入CD235a，CD36，CD41，CD61，CD13，CD33，CD14，CD34，CD38单克隆荧光抗体,室温孵育30min，用PBS液洗去未结合的抗体。以侧向角散射光(SSC)强度为横坐标和细胞结合CD45荧光强度为纵坐标设门，用流式细胞仪分别测定相应抗体荧光强度，每组分析5000个细胞，数据经FCM所带软件处理后计算出相应表型阳性细胞百分率。实验重复3次。

软琼脂克隆形成试验：分别取收集的K562，调整细胞密度至1×10³/ml待用。分别设25μg/ml、50μg/ml新乌头碱组，阴性组，每组设3个复孔。取0.4％琼脂置高压灭菌锅灭菌，待其温度为50℃左右时，按琼脂和培养基1:1的体积加入预温37℃的新鲜RPMI-16402X完全培养液，加入体积分数为20％胎牛血清，再按照细胞浓度为1×10³/ml加入K562细胞。同时加入集落形成因子100ng/ml迅速混匀，配成终浓度为0.2％琼脂培养基，浇入6孔培养板中，每孔2ml，置室温凝固。把6孔培养板移入CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度环境中培养2周。显微镜计数含有50个细胞以上的克隆数。克隆抑制率＝(处理组克隆数-对照组克隆数)/对照组克隆数×100％。再分别测定新乌头碱对K562细胞的克隆形成抑制率。集落抑制率＝(1-(实验组集落形成率/对照组集落形成率))×100％。实验重复3次。

统计学方法：实验数据以X±S表示，SPSS10.0进行单因素方差分析。

实验结果： 

Caco-2细胞单层适用性

系统适用性试验：

AKP是小肠表皮刷状缘细胞的标志酶。Caco-2细胞生长到一定阶段后，可通过测定Caco-2细胞的酶活性对其分化的生物化学特性进行初步判断。本实验中，Caco-2细胞在接种第3d，细胞未完全汇合时，不能水解AKP底物对硝基苯磷酸盐，使其生成对硝基苯酚，显示没有AKP活性，而在接种第14d，能够水解对硝基苯磷酸盐生成对硝基苯酚，具有AKP活性，显示Caco-2细胞在第14d已 经基本分化完成，具备药物转运需要的各种载体和酶。本实验采用国际公认在Caco-2细胞单层吸收良好的普萘洛尔和吸收不好的阿替洛尔为对照物，得出两者在Caco-2细胞单层的Papp值分别为2.54×10^-5cm/sec和3.35×10^-7cm/sec，与文献[8]值基本相符，表明其具有良好的完整性与转运能力。

Caco-2接种在transwell上电子显微镜观察结果：

Caco-2接种在transwell上，生长21d，在扫描电子显微镜下观察见图1。在透射电子显微镜下观察见图2。表2为碱性磷酸酶的测定结果。

表2

**P＜0.01，AP侧与BL侧进行比较有极显著性差异。

从试验数据得出：腔面的碱性磷酸酶是基底侧的6.9倍，说明细胞生长已经形成了极性，碱性磷酸酶已经大部分集中于刷状缘一侧，即朝向培养基的一侧。

细胞毒性试验结果：

利用酶标仪测定96孔板空白对照和加入附子提取物的HBSS溶液后的吸收度A值，并计算其对Caco-2细胞的抑制率，结果见表3，附子细胞毒性试验测定结果(n＝3)(±S)(％)。

由表3可知，Caco-2细胞抑制率随着新乌头碱的浓度增加而增加，当浓度低于100μg/ml时，新乌头碱的抑制率小于20％，因此，在细胞膜转运实验中选择的浓度为100μg/ml可认为无细胞毒性。

表3

与阴性对照组比较，※P＜0.05，※P＜0.01

对于Caco-2细胞，附子提取物的细胞毒性均随浓度增大而增强，实验结果显示附子提取物浓度高于200μg/ml时，细胞毒性增大，而存活率低于(58.35±13.36)％；100μg/ml浓度与阴性对照组比较均无显著性差异，细胞存活率在80％以上。而浓度为50μg/ml，100μg/ml经过Caco-2transwell吸收模型的中药含量降低，需要多次试验，增大试验工作量。

新乌头碱和苯甲酰新乌头原碱的高效液相色谱检测结果：

利用该方法，附子提取物中新乌头碱和经Caco-2模型吸收后的新乌头碱检测效果很好，保留时间相近，确定为同一物质，没有杂峰干扰。

MTT法测定新乌头碱标准品对K562细胞增殖作用的抑制：

新乌头碱对K562细胞体外增殖有明显的抑制作用，随着作用时间延长，相同浓度新乌头碱对K562细胞增殖抑制作用增强。其中新乌头碱抑制K562细胞具有时间依赖性。新乌头碱对K562细胞随浓度的增高，抑制作用增强。各浓度新乌头碱作用K56224h，抑制效果不明显。25-50μg/ml的新乌头碱作用K562细胞，抑制效果明显，又没有细胞毒作用。表4新乌头碱对K562细胞增殖的抑制作用(MTT)(n＝3)(±S)(％)。

表4

*P＜0.05，与对照组相比较

新乌头碱作用K562细胞形态学变化

光学显微镜观察：

Wright-Gimesa染色：阴性：K562细胞体积较大，平均直径为25μg/ml，形态多呈圆形或略欠规则的圆形；细胞核呈圆形或椭圆形，染色质疏松呈紫红色，核仁清晰，每个细胞约有2～4个，核质比大；细胞质为深蓝色，边缘可见伪足样突起，胞质中无颗粒，偶见细胞质内有空泡，MPO染色呈阴性反应，图3(a)为原始未分化状态细胞。经新乌头碱作用后的K562细胞胞浆增多，部分细胞浆内可见蓝黑色颗粒，胞核有切迹，凹陷，部分呈肾形或不规则形。图3(b)可见到散在的细胞碎片。

电子显微镜观察:未经处理的K562细胞电镜观察核膜完整，核仁明显，细胞形态正常，胞质电子密度较低。新乌头碱作用K562细胞72小时后可见明显的凋亡形态学改变。电镜下可见细胞核固缩，染色质凝集成新月形紧贴于核膜周围，核膜扭曲，胞浆空泡化，胞质电子密度增高等特征，见图4(a)至(d)。其中，图4(a)K562细胞(×15000)，图4(b)K562细胞(×2500)，图4(c)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72h(×15000)，图4(d)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72h(×2500)。

细胞周期检测：细胞周期检测结果见表5，表5为25μg/ml，50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72h后细胞周期(n＝3)(±S)(％)。

表5

*P＜0.05，与对照组相比较

细胞凋亡检测：横坐标代表FITC标记的AnnexinV荧光强度，纵坐标代表PI荧光强度。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为 (FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。结果显示不同药物处理72h后，随浓度的增加，凋亡细胞的比例也逐渐增加。25μg/m，50μg/m新乌头碱作用K562细胞72h细胞凋亡率分别为(1.983±0.023)％*和(6.172±0.185)％*，与对照组(0.112±0.017)％比较，差异具有显著性统计学意义(P<0.01)。表6为新乌头碱诱导K562细胞凋亡(FCM)(n＝3)(±S)(％)。

表6

*P＜0.05，与对照组相比较

新乌头碱作用K562细胞72h后，偏早期的表型CD34、CD38表达均降低。巨核系分化表型CD41、CD61的表达均增高。其他表型表达率无明显变化。表7为新乌头碱作用K562细胞72h细胞表面分化抗原表达变化(流式细胞术)(n＝3)(±S)(％)

表7

*P＜0.05，与对照组相比较

K562细胞克隆形成：新乌头碱能明显抑制K562细胞的克隆形成。如图5所示，图5(a)阴性组，图5(b)50μg/ml新乌头碱作用K562细胞14天，随所加的新乌头碱浓度增高，相对于对照组，各处理组集落直径逐渐变小，集落数量由多变少，各组处理组集落抑制率逐渐增加。见表8。药物处理组与对照组集落抑制率均有显著性差异。(P＜0.05)。25μg/ml、50μg/ml新乌头碱组集落形成率分别为(1.72±0.18)％、(1.91±0.13)％，加药组与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。表8为新乌头碱对K562细胞克隆形成率的影响(n＝3)(±S)(％)。

表8

*P＜0.05，与对照组相比较

结论：

本发明对极富云南特色的名方大回阳饮对白血病细胞生物学特性的影响进行研究，建立Transwell转运池Caco-2细胞体外吸收模型，以吸收的物质为活性成分指征，指导分离纯化，制备供试样品新乌头碱，作用于研究的白血病K562细胞株，监测K562细胞所处不同细胞周期的比例、细胞凋亡及其细胞表面抗原的改变和集落形成能力的影响程度。提取其单体利用噻唑蓝(MTT)比色实验进一步验证新乌头碱对K562细胞有增殖抑制作用通过电子显微镜的观察发现，此种药物可明显诱导K562细胞形态学上的凋亡，主要表现为细胞核固缩，碎裂等。本实验采用流式细胞术凋亡测试结果表明新乌头碱作用K562细胞72h后凋亡率明显增加，提示新乌头碱可能部分通过诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。流式细胞术检测新乌头碱对K562细胞周期变化的影响，实验结果显示，25μg/ml新 乌头碱作用K562细胞，S期比例上升了4.40％，50μg/ml新乌头碱作用K562细胞，S期比例上升了17.88％。提示新乌头碱可能是使更多细胞通过S期限制点对细胞周期进行调节，从而进一步抑制细胞增殖的。细胞分化抗原检测结果提示新乌头碱使K562细胞向巨核系分化趋势，但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。新乌头碱明显抑制K562细胞的克隆形成。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡,肿瘤无限制增生的恶性生物学特征与肿瘤细胞凋亡减少有关。对凋亡分子的深入研究,提示肿瘤细胞凋亡可能成为一种治疗肿瘤的有效途径。经新乌头碱的处理的细胞在检测时都会呈现出一定得凋亡特征：流式细胞仪检测可见明显细胞周期的亚二倍体峰以及细胞凋亡率的升高，形态学上的变化等。白血病发生的重要因素之一就是正常凋亡过程障碍。新乌头碱可诱导K562细胞产生凋亡，其机制可能与降低其BCR-ABL蛋白水平有关。本研究发现新乌头碱不仅能抑制K562细胞增殖，而且能诱导细胞出现凋亡，为临床应用进一步开发研究出新一代高效低毒的抗癌中药新制剂提供了理论依据。

参考文献

1Wang XW，Xie H.Alkaloids ofChineseAconitum plants.Drugs Fu-ture，1999，24(8):877

2Ameri A.Inhibition ofstimulus－triggered and spontaneous epilepti-form activity in rat hippocampal slices by theAconitum alkaloid mesaconitine.Eur J Pharmacol，1998，342(2－3):183

3KANG Le，YUE Shou－wei，WANG Xiao－ling，et al.The mechanism underlying the analgesic effect of the iontophoresis of aconitine on the adjuvant arthritis in rats.Chin J Phys Med Rehabil，2005，27(12):733

4国家药典委员会.中华人民共和国药典[M]二部.北京:化学工业出版社,2010:附录103-104

5Mosmann T.Rapid cobrimetric assay for cellular growth and survival:Application and cytotoxicity assays.J Immuno Methods,1983,65(1-2):55-63 

6杨秀伟,杨晓达，王莹，等.中药化学成分肠吸收研究中Caco-2细胞模型和标准操作程序的建立.中西医结合学报,2007,5(6):634

7Mosmann T.Rapid cobrimetric assay for cellular growth and survival:Application  and cytotoxicity assays.J Immuno Methods,1983,65(1-2):55-63 

8 Yee SY.In vitro permeability across Caco-2 cells(colonic)can predict in vivo(small intestinal)absorption in man-fact or myth.Pharm Res,1997,14(6):763-766。

Claims (3)

1.新乌头碱对K562细胞生物学特性的改变。

2.按照权利要求1所述K562细胞生物学特性的改变，其特征在于：所述新乌头碱由包含在附子的有效成分提取液中。

3.按照权利要求2所述K562细胞生物学特性的改变，其特征在于：所述附子的有效成分提取液提取的方法为：取附子粉末过三号筛2g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，加入异丙醇：乙酸乙酯为1:1的混合溶液50ml，超声处理，功率300W,频率40kHz，水温在25℃以下30分钟，放冷，用异丙醇：乙酸乙酯为1:1的混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，量取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇：二氯甲烷为1:1的混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得。