CN104620986B - 三七不定根的诱导及组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七不定根的诱导及组织培养方法，包括以下步骤:(1)三七不定根的诱导：取三七的愈伤组织，接种于固体培养基上，在无菌、23‑25℃及避光的条件下培养3‑5周，得到带有愈伤组织的三七不定根；(2)三七不定根的继代培养:将带有愈伤组织的三七不定根转接到液体培养基中，在转速为110‑130r·min‑1的摇床上，在无菌、23‑25℃及光照条件下连续培养4‑5周；继代3‑5次。本发明利用组织培养方法培养三七不定根，其生长速率快，并且其活性次级代谢产物的含量高且比较稳定，培养物较均一，同时，培养条件在人工控制下不受外界多变天气及病虫害的影响。工艺过程简单，成本低廉，诱导率高，重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的不定根组织培养及生产方法，特别是涉及一种三七不定根的诱导及组织培养方法。
背景技术
三七(Panax notoginseng)是五加科人参属植物，是我国传统的名贵中药和云南省重要的特色资源，也是发展中药和天然药物产业的重要原料。三七在心血管、脑血管、神经、免疫等系统具有多方面的药理活性，还具有对肝损伤的保护作用和抗肿瘤、抗炎等作用。以三七皂苷为主要原料开发的中成药除血塞通外，还有血栓通、复方丹参滴丸、片仔癀和云南白药等多种品牌的中成药。据统计，目前我国医药健康产品中，用三七为原料的产品至少有200种，其年销售额在50亿元以上。三七产业在我国医药健康事业中具有重要的意义。然而，三七为多年生植物，适宜于冬暖夏凉的气候，喜半阴和潮湿的生态环境。三七的自然属性决定了适于其生长的范围仅限于少数特殊环境条件的地区，导致三七资源严重缺乏，对以三七为原料的产业存在着潜在的威胁。
通过组织培养的方法可以获得有效成分含量高、生长周期短的三七培养物，已解决土地及三七资源严重缺乏的问题。具有重要的经济意义与社会意义。其中不定根培养是80年代发展起来的一项新技术。不定根是由植物的愈伤组织诱导出来的根，和药用植物的悬浮细胞相比，其活性成分的含量稳定；和大田栽培生长的植物相比，其生长速度要快上千百倍且其活性成分含量高。因此，比较适合药用植物的组织培养以获取有效成分或作为替代原料，特别是用药部位为其根部的药用植物。
中国专利号为CN103923874A公开的三七悬浮细胞的培养方法，该方法所获得的皂苷含量为2.31±0.35。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供三七不定根的诱导及组织培养方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种三七不定根的诱导及组织培养方法，包括以下步骤:
(1)三七不定根的诱导：取三七的愈伤组织，接种于固体培养基上，在无菌、23-25℃及避光的条件下培养3-5周，得到带有愈伤组织的三七不定根；
(2)三七不定根的继代培养:将带有愈伤组织的三七不定根转接到液体培养基中，在转速为110-130r·min-1的摇床上，在无菌、23-25℃及光照条件下连续培养4-5周；继代3-5次。
固体培养基为在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和琼脂，使吲哚丁酸的终浓度为3.0-5.0mg/L、萘乙酸的终浓度为0.5-1.0mg/L、蔗糖的终浓度为30-40g/L、琼脂的终浓度为6-7g/L，pH＝5.8-6.0。
液体培养基为在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，使吲哚丁酸的终浓度为3.0-5.0mg/L、萘乙酸的终浓度为0.5-1.0mg/L、蔗糖的终浓度为30-40g/L，pH＝5.8-6.0。
本发明的优点：
本发明利用组织培养方法培养三七不定根，其生长速率与三七自然生长相比较快，并且其活性次级代谢产物的含量高且比较稳定，培养物较均一，同时，培养条件在人工控制下不受外界多变天气及病虫害的影响。工艺过程简单，成本低廉，诱导率高，重复性好，不定根生长速率快。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
固体培养基的制备：在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和琼脂，使吲哚丁酸的终浓度为3.0mg/L、萘乙酸的终浓度为1.0mg/L、蔗糖的终浓度为40g/L、琼脂的终浓度为6g/L，混合加热至完全溶解，调pH＝5.8，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
实施例2
固体培养基的制备：在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和琼脂，使吲哚丁酸的终浓度为5.0mg/L、萘乙酸的终浓度为1.0mg/L、蔗糖的终浓度为30g/L、琼脂的终浓度为7g/L，混合加热至完全溶解，调pH＝5.9，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
实施例3
固体培养基的制备：在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和琼脂，使吲哚丁酸的终浓度为3.0mg/L、萘乙酸的终浓度为0.5mg/L、蔗糖的终浓度为35g/L、琼脂的终浓度为7g/L，混合加热至完全溶解，调pH＝6.0，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
实施例4
液体培养基的制备：在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和L蔗糖，使吲哚丁酸的终浓度为3.0mg/L、萘乙酸的终浓度为1.0mg/L、蔗糖的终浓度为40g/L，调pH＝5.8，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟备用。
实施例5
液体培养基的制备：在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和L蔗糖，使吲哚丁酸的终浓度为5.0mg/L、萘乙酸的终浓度为1.0mg/L、蔗糖的终浓度为30g/L，调pH＝5.9，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟备用。
实施例6
液体培养基的制备：在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和L蔗糖，使吲哚丁酸的终浓度为3.0mg/L、萘乙酸的终浓度为0.5mg/L、蔗糖的终浓度为35g/L，调pH＝6.0，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟备用。
SH培养基配方见表1.
表1 SH培养基配方表
实施例7
一种三七不定根的诱导及组织培养方法，包括以下步骤:
(1)三七不定根的诱导：取生长良好的三七的愈伤组织，接种于实施例1制备的固体培养基上，在无菌、23℃及避光的条件下培养4周后，得到带有愈伤组织的三七不定根；
(2)三七不定根的继代培养:将带有愈伤组织的三七不定根转接到实施例4制备的液体培养基中，在转速为110r·min-1的摇床上，在无菌、23℃及光照条件下连续培养4周；继代5次。
三七不定根培养中皂苷的HPLC定量分析:
实验仪器及试药:
安捷伦1100高效液相色谱仪，包括在线脱气机和四元泵。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg2、Rd对照品购于中国药品生物制品检定所，色谱纯甲醇，色谱纯乙腈，超纯水。
方法:
1)色谱条件
色谱柱为kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)柱；流动相A：0.005％甲酸水溶液，B：0.005％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序：0→35min，B:21％；35→36min，B:21％→30％；36→55min,B:30％→40％；55→65min,B:40％→85％；65→80min。检测波长200nm；柱温25℃；流速1.0mL·min-1；进样体积为10μL。
2)供试品溶液的制备
精密称取0.2g左右干燥粉碎的实验样品(本实施例获得的不定根)置于100mL具塞三角瓶中，加入40mL甲醇，60℃水浴1h，重复一次，趁热抽滤，收集滤液。将滤液挥干后溶于10mL蒸馏水，用20mL正丁醇萃取过夜，收集正丁醇层，再经旋转蒸发处理(温度70℃，转速50rpm)后，定容到1mL。用0.22μm微孔滤膜过滤，得样品供试品。
3)皂苷对照品溶液的制备
精密称取经减压干燥12h以上的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg2、Rd各1mg,加少量甲醇超声溶解后置于5mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，配成皂苷混合对照品储备液。对照品储备液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封置冰箱中保存备用。检测结果见表2
表2：
实施例8
一种三七不定根的诱导及组织培养方法，包括以下步骤:
(1)三七不定根的诱导：取生长良好的三七的愈伤组织，接种于实施例2制备的固体培养基上，在无菌、24℃及避光的条件下培养5周后，得到带有愈伤组织的三七不定根；
(2)三七不定根的继代培养:将带有愈伤组织的三七不定根转接到实施例5制备的液体培养基中，在转速为120r·min-1的摇床上，在无菌、24℃及光照条件下连续培养4.5周；继代4次。不定根总皂苷含量(mg/g)8.38±0.79。。
实施例9
一种三七不定根的诱导及组织培养方法，包括以下步骤:
(1)三七不定根的诱导：取生长良好的三七的愈伤组织，接种于实施例3制备的固体培养基上，在无菌、25℃及避光的条件下培养3周后，得到带有愈伤组织的三七不定根；
(2)三七不定根的继代培养:将带有愈伤组织的三七不定根转接到实施例6制备的液体培养基中，在转速130r·min-1的摇床上，在无菌25℃及光照条件下连续培养5周；继代3次。不定根总皂苷含量(mg/g)8.35±0.53。
Claims (1)
1.一种三七不定根的诱导及组织培养方法，其特征在于包括以下步骤:
三七不定根的诱导：取三七的愈伤组织，接种于固体培养基上，在无菌、23-25℃及避光的条件下培养3-5周，得到带有愈伤组织的三七不定根；
三七不定根的继代培养:将带有愈伤组织的三七不定根转接到液体培养基中，在转速为110-130r·min-1的摇床上，在无菌、23-25℃及光照条件下连续培养4-5周；继代3-5次；
所述固体培养基为在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸、蔗糖和琼脂，使吲哚丁酸的终浓度为3.0-5.0mg/L、萘乙酸的终浓度为0.5-1.0mg/L、蔗糖的终浓度为30-40g/L、琼脂的终浓度为6-7g/L，pH＝5.8-6.0；
所述液体培养基为在SH培养基中加入吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，使吲哚丁酸的终浓度为3.0-5.0mg/L、萘乙酸的终浓度为0.5-1.0mg/L、蔗糖的终浓度为30-40g/L，pH＝5.8-6.0；
所述SH培养基配方为NH4H2PO4终浓度300mg/L，MgSO4终浓度195.4mg/L,CaCl2终浓度151mg/L,KNO3终浓度2500mg/L,FeSO4·7H2O终浓度15mg/L,Na2EDTA·2H2O终浓度20mg/L,CuSO4·5H2O终浓度0.2mg/L,ZnSO4·7H2O终浓度1mg/L,KI终浓度1mg/L,MnSO4·H2O终浓度10mg/L,CoCl2·6H2O终浓度0.1mg/L,H3BO3终浓度5mg/L,NaMoO4·2H2O终浓度0.1mg/L,蔗糖终浓度10g/L，pH 5.8-6.0。
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